비장의 Intravital 현미경 : 기생충 이동성 및 혈류의 정량 분석

이 절차에서는 비장을 통한 기생충 통과의 역학을 평가하기 위한 정량적 생체 내 현미경 접근 방식을 보여줍니다. 설치류 말라리아 모델에서, GFP 형질전환 기생충에 감염된 마우스는 비장 정맥 캐뉼레이션의 생체 내 현미경 검사를 위해 준비되어 생체 내 염료를 주입할 수 있습니다. 실험하는 동안 형광 세포는 비장의 다른 영역에서 이미지를 이동합니다.

우리는 붉은 펄프의 3차원 느린 구획에서 기생충의 이동성을 설명하고 혈관 혈류를 계산하기 위해 신화를 제공합니다. 이 매개변수는 두 PULE 균주의 비장 역학을 비교하는 데 사용되었습니다. 여러분 안녕하세요.

제 이름은 난도 엘 포르티요(Nando El Portillo)이고, 제 연구실의 주요 연구 질문 중 하나는 말라리아에서 비장의 역할을 이해하는 것입니다. S 비장 비대는 이 질병의 랜드마크 중 하나이지만, 기술적, 윤리적 문제로 인해 이 기관에 대한 연구를 다루는 것은 매우 어렵습니다. 이를 위해 우리는 이 기생충의 역동적인 통로를 보고 이 현상을 정량화할 수 있는 기술을 가능하게 했습니다.

이것이 Lorena와 MI가 이 프로토콜에서 설명하는 내용입니다. 이 연구는 독일 함부르크 대학의 Dr.Ler와 병원 클리닉의 Dr.Maria Kbo의 그룹과 협력하여 부분적으로 진행되고 있으며 발견 된 피온 Cellex와 장관급 CIA의 일반 자금을 받았으며 에스파뇰 감염은 10 % 기생충에서 치명적 또는 치명적이지 않은 GFP 기생충에 감염된 기증자 M에서 시작됩니다. 기생충을 확인하려면 쥐 꼬리 정맥에서 작은 혈액 한 방울을 꺼내 현미경으로 확장하십시오.

GIM으로 콜레 메트릭 염색을 밀어 넣습니다. 용액을 사용하면 건조된 감염된 적혈구를 시각화하고, 2분 동안 메탄올로 혈액 도말자를 고정하고, GIM에 용액을 바르고 20분 동안 배양할 수 있습니다. 현재 수돗물로 슬라이드를 세척하고 건조시키고 100 x 오일이 있는 광학 현미경을 사용하여 전체 적혈구에 대한 pbc의 백분율을 열거합니다. 목표.

PBS에 희석된 기증자 마우스의 꼬리 혈액에서 얻은 치명적 또는 치명적이지 않은 기생충으로 마우스를 감염시킵니다. 감염 후 3일째에 1%의 말초 기생충에 도달하기 위해 마우스당 50만 마리의 기생충을 주입하도록 용량을 조정하고 복강내를 주입합니다. 또는 FITC로 표지된 적혈구를 대조군에 사용할 수 있습니다.

동물은 쥐에서 동맥혈 1ml를 채취하여 FITC 용액에 EDTA 스팬을 포함하는 PBS에서 원심분리로 펠릿을 세척하고 부드러운 교반으로 어둠 속에서 2시간 동안 배양합니다. 그 후, 원심 분리로 상층액을 제거하고 광범위하게 세척하십시오. 말초 순환에서 평균 1%가 되도록 대조군 마우스에 주입하고 in vivo 실험을 진행합니다.

안녕하세요, 저는 mija입니다. 생체 내에서 비장을 이미지화하려면 분명히 이 기술로 비장을 노출시키기 위해 동물의 작은 시너지 효과를 수행해야 합니다. 나는 노동자 Heisler의 실험실에서 Stephanie GR로부터 그것을 배웠고, 그에게 감사하고 이제 어떻게 진행하는지 보여 드리겠습니다.

감염된 근증의 이미징 감염 후 3일째에 두 균주 모두에서 parat가 1%일 때 수행됩니다. 절차 내내 마우스를 마취하고 조절된 온도로 유지하십시오. 수화로부터 눈을 보호하고 물질의 정맥 투여를 용이하게 하기 위해 진행하기 전에 마우스 발 패드에 핑을 보내 마우스가 완전히 마취되었는지 확인하십시오.

실험이 진행되는 동안 쥐 꼬리 정맥을 캐뉼러화하여 캐뉼러를 구성합니다. 튜브의 한쪽 끝에 작은 바늘을 삽입하고 다른 쪽 끝에 어플리케이터를 삽입합니다. 캐뉼라에 생리적 식염수를 넣고 거품을 제거하고 용액이 캐뉼라를 통해 올바르게 흐르는지 확인합니다.

꼬리의 측면 정맥은 깨끗하게 캐뉼레이트됩니다. 꼬리 밑부분을 부드럽게 수축시켜 가시성을 높입니다. 정맥 내부의 캐뉼라 끝을 소개합니다.

피가 보이면 바늘이 올바른 위치에 있음을 나타냅니다. 그렇지 않은 경우 정맥 상류에서 캐뉼러를 반복 한 다음 접착제와 테이프를 사용하여 캐뉼라를 꼬리에 고정하십시오. 동물의 왼쪽 등쪽의 피부와 근육 조직의 작은 절개를 통해 비장의 아래쪽 부분을 노출시킵니다.

호흡 움직임이 적은 곳에 비장을 놓고 노출된 표면에 PBS를 바르면 쥐의 털이 깨끗하고 수분을 유지할 수 있습니다. 비장을 덮개 수면으로 밀봉하여 시각화할 수 있습니다. 안녕하세요, 제 이름은 로레나입니다.

표시된 프로토콜을 통해 비장을 통한 PULI 기생충의 움직임을 시각화할 수 있습니다. 이것은 GFP 형질전환 기생충 덕분에 가능했습니다. Drexel University의 James Burnes가 기부해 주십시오.

형광 기생충의 움직임을 이미징하면 치명적 균주와 치명적이지 않은 균주 간의 행동에 차이가 있는지 알 수 있습니다. Vidal 현미경 실험은 온도 조절 기능이 있는 배양 시스템과 63 x 글리세롤 대물렌즈가 장착된 Leica 다광자 현미경에서 수행되었습니다. 동물을 s에 놓습니다.tag덮개가 있는 수면 비장이 대물렌즈를 향하도록 현미경의 e. 처음에.

더 낮은 배율에서 비장을 시각화하면 기관의 미시 순환 구조에 대한 일반적인 관점을 제공할 수 있습니다. 자가형광 조직을 사용하여 비장에 초점을 맞추십시오: GFP 기생충이 비장의 다른 영역을 통과하는 것이 관찰됩니다. 안녕하세요, 제 이름은 바르셀로나 대학교 과학기술센터의 마리아 알보(Maria Albo)이며, 비장의 생체 내 영상을 촬영할 예정입니다.

감염된 적혈구의 혈류와 이동성을 연구하기 위해 공진 스캔이 장착된 컨포칼 현미경을 사용하여 장기의 움직임을 피하는 데 매우 유용한 고속 이미징이 가능합니다. 이것은 시야 범위를 선택할 수 있는 분광 현미경입니다. 아주 빨리 심상하기 위하여는, 우리는 2개의 fluorescein, 레테르를 붙이고 반영의 동시 취득을 할 것입니다.

RBC, 반사, 대비 및 Vidal 염료를 사용하여 비장 미세혈관 구조를 증거하기 위해 이미지화할 다양한 영역을 선택합니다. 이제 Vidal 현미경 검사와 이미지 J 소프트웨어를 사용하여 혈관 혈류에서 기생충 이동성을 측정하여 붉은 펄프의 3차원 그물망에서 기생충의 움직임을 추적하는 방법을 설명합니다. 고속 스캐닝 모드를 사용하여 5개의 Z 깊이를 통해 이미지를 획득합니다.

이미지 스택을 Z 코드 컬러 동영상으로 변환하여 단일 형광 세포를 쉽게 추적할 수 있습니다. 세부 정보 : X, Y, Z 및 T 좌표를 사용하여 각 비디오의 깊이에서 시간에 따른 다른 입자를 추적하고, 방향성, 평균, 속도 및 체류 시간과 같은 이동성 매개 변수를 계산하고 분포 맵으로 표시하여 스트레인 모집단 간의 비교 분석을 가능하게합니다. 비장의 혈관 흐름은 덱스트린과 같은 지지 표에 설명된 여러 형광 분자의 전신 주입에 의해 이미지화될 수 있습니다.

그리고 내인성 적혈구 반사를 사용하여 레이저 스캔 방향으로 혈관을 수평으로 설정하고 향상된 라인 평균을 사용하여 중심선 혈류를 스캔합니다. 이 이미지에서 움직이는 세포로 인한 줄무늬는 혈류를 계산하고, 직경이 다른 혈관의 이미지를 촬영하고, 심장 주기에 걸쳐 이미지를 촬영하여 변동을 보상하는 데 사용됩니다. 비장은 오랫동안 말라리아 연구의 블랙박스로 여겨져 왔으며, 여기에서 우리는 이 기관의 기생충 감염 및 혈류의 역학에 대한 통찰력을 얻기 위해 정량적 생체 내 현미경 접근 방식을 개발하여 감염된 적혈구가 비장에 생체 내에서 부착하는 것과 같은 중요한 생물학적 문제를 해결할 수 있었습니다.

고맙습니다.