개별 준비 Drosophila 계란 회의소

다음 실험의 목적은 살아있는 초파리 U site의 동적 과정을 기록하는 것입니다. 이를 위해 먼저 충분히 먹이를 공급한 2일 된 암컷 초파리로부터 온전한 난소를 분리합니다. 두 번째 단계로, 난소에서 개별 aerial를 추출하여 난포를 이미징합니다.

그 후 적절한 형광 단백질이 발현되면, 개별 난포를 직접 이미징하거나 이미징 전 형광 마커를 미세주입하는 것과 같은 추가 조작을 수행할 수 있습니다. 궁극적으로, 동영상 시퀀스 분석을 통해 세포 내 구성 요소들의 동적인 상호작용을 밝혀낼 수 있습니다. 이 방법은 RNA 운송 및 국소 번역 분야의 몇 가지 핵심 질문에 답하는 데 도움이 되었습니다.

예를 들어, 생체 내에서 신체 계획을 설정하는 단백질의 발현이 시간적, 공간적으로 어떻게 조절되는가? 일반적으로 이 방법에 익숙하지 않은 개인은 상당한 속도와 기민함이 요구되기 때문에 어려움을 겪을 수 있다. 반복적인 연습을 통해 더 나은 결과를 얻을 수 있다.

난소 챔버의 조작 과정은 텍스트로 전달하기 어렵고 숙련된 기술과 정교한 손길이 필요하므로, 이 방법의 시각적 시연이 매우 중요합니다. 커버 슬립 위에 halo carbon oil을 소량 떨어뜨려 준비해 둔 뒤, 이 절차를 시작하십시오. 그런 다음 준비된 파리들을 이산화탄소로 마취시킵니다.

끝이 뾰족한 정밀 핀셋을 사용하여 복부 앞쪽의 통통한 암컷 초파리를 잡습니다. 복부 중앙을 잡지 않도록 주의하십시오. 준비된 커버 슬립 상단 약 2~3cm 높이에서 암컷 초파리를 유지합니다.

두 번째 핀셋을 사용하여 암컷의 최후단에 있는 조직을 제거합니다. 이때 일반적으로 깨끗한 핀셋으로 장 조직까지 함께 제거하게 됩니다. 치약을 튜브에서 짜내듯 복부를 전단에서 후단 방향으로 부드럽게 마사지합니다.

난소는 크고 불투명한 구조물처럼 보이며 핀셋 끝에 달라붙습니다. 슬라이드 위의 halo carbon oil에 난소를 접촉시켜 수집하십시오. 그 후 4~6개의 난소가 수집될 때까지 이 과정을 반복하십시오.

기공(aerials)을 분리하기 전, 현미경의 광원을 조절하여 조명이 슬라이드에 낮은 각도로 비춰 조직에 대비되는 그림자가 생기도록 합니다. 초파리를 해부할 때는 적절한 도구를 사용하는 것이 매우 중요합니다.

우리가 사용하는 포인터는 조직을 손상시킬 정도로 너무 날카롭지 않으며, 적당히 뭉툭하여 사용하는 핀셋을 잡을 수 있습니다. 마찬가지로, 핀셋 또한 조직을 손상시킬 만큼 너무 날카롭지 않으면서도, 도구가 휘지 않고 조작할 수 있을 만큼 충분히 정교해야 합니다. 또한 도구를 청결하게 유지하는 것이 매우 중요하므로, 닫힌 포셉을 사용하여 절차 전반에 걸쳐 정기적으로 세척합니다.

후단의 연결 조직을 제거하여 두 난소를 분리합니다. 후단에는 가장 성숙한 난모세포 챔버가 있습니다. 가장 어린 난모세포 챔버가 주로 사용하는 손 쪽으로 오도록 난소를 수평으로 배치합니다.

그런 다음 남은 결합 조직을 통해 후단을 조심스럽게 잡고, 해부용 프로브나 텅스텐 바늘을 사용하여 개별 난포를 떼어냅니다. Jamar 단계에서 10단계 사이의 개별 난포들은 서로 분리되지만, 더 성숙한 난포들은 난소에 붙어 있을 것입니다. 프로브를 사용하여 분리된 난포 15~25개를 오일 방울 중앙으로 조심스럽게 끕니다. 하나 이상의 난소를 해부해야 하는 경우, 서로 다른 파리에서 각각 하나씩 선택하십시오.

과도한 난소 조직은 제거하고, 세포가 스트레스로 인해 표현형 변화를 보이기 시작하므로 신속하게 진행하십시오. 난소에서 박리한 후 40분이 지나면 오일에서 과도한 난소 조직을 제거합니다. 중기 단계의 난모세포를 주입하기 위해 깨끗한 기구를 사용하여, 커버슬립의 장축에 수직이 되도록 배열하십시오. 후기 단계의 난실을 분리하기 위해서입니다.

앞서 설명한 대로 난소의 후방을 잡았을 때는 다른 방법이 필요합니다. 포셉 근처의 난소 후단에 해부용 프로브를 삽입하십시오. 난실을 찌르지 않도록, 후기 단계의 난실 사이에 프로브를 삽입하십시오.

해부용 바늘을 난소 전체에 통과시켜 초기 단계의 난실(egg chambers) 쪽으로 나오게 합니다. 올바르게 수행되었다면, 프로브가 오바리올(ovarioles)과 후기 단계 난실을 고정하고 있는 결합 조직을 제거하게 됩니다. 오바리올이 커버슬립 위에 넓게 펼쳐질 때까지 이 단계를 반복합니다.

난포들이 더 이상 서로 겹쳐 있지 않을 때 이 단계가 완료된 것입니다. 해부용 프로브를 사용하여 후기 단계 난포들을 분리함으로써 Stage 14 위치의 이미징이 용이하도록 합니다. 경부 난포의 경우 핀셋을 사용하여 배측 부속물을 잡으십시오.

주입할 용액을 고속으로 짧게 원심분리하여 준비합니다. 이렇게 하면 주입 바늘을 막을 수 있는 고체 침전물을 펠렛 형태로 가라앉힐 수 있습니다. 그런 다음 로딩 팁을 사용하여 주입 바늘에 용액을 채우고, 용액이 채워진 주입 바늘을 인젝터에 조심스럽게 장착합니다.

이제 샘플 옆에 작은 유리 조각을 배치하고 슬라이드를 현미경 스테이지 위에 고정하십시오. 유리는 벽 역할을 하여 흐름을 끊거나 조절하게 됩니다. 니들을 제거하십시오.

현미경과 주입 장치를 준비합니다. 이때 바늘 끝이 부러지지 않도록 주의하십시오. 가능하다면, 포인트 방문 기능이 있는 자동 스테이지를 사용하여 주입 대상인 스테이지 8 및 스테이지 9 세포를 모두 표시하십시오.

이제 주사 바늘을 오일에 닿을 때까지 내립니다. 표시된 지점 목록에서 첫 번째 지점을 선택하고 세포에 초점을 맞춥니다. 바늘이 세포와 동일한 초점 평면에 올 때까지 수동으로 내립니다.

조작기 컨트롤을 사용하여 주입 바늘의 끝이 U 부위 내부에 위치할 때까지 이동시킵니다. 천천히 찌르는 것보다 빠르게 찌르는 동작이 더 성공적일 때가 많습니다. 내부에 진입하면 바늘을 통해 소량을 배출하고 그 효과를 시각적으로 평가합니다.

반복 작업이 필요합니다. 주입이 성공적이면 세포 내부의 세포질이 밀려나게 됩니다. 주입된 유체의 정확한 양을 정량화하는 것은 어렵습니다.

주입량을 늘리려면 주입 펄스의 압력 또는 지속 시간을 조정하십시오. 바늘 끝을 부러뜨려 바늘의 개구부를 약간 넓히거나, 다음 mark.Cyte를 선택하기 전에 여러 번의 주입 펄스를 사용하십시오. 다른 cytes와 충돌하지 않도록 주입 바늘을 오일 속에서 충분히 높게 들어 올리십시오.

바늘을 세포 내에 과도하게 찌르거나 오래 머물게 하면 난포(egg chamber)가 심하게 손상됩니다. 따라서 빠르게 진행하십시오. 주사는 10초 이내에 완료해야 합니다.

실수가 발생한 경우, 다음 표식 지점으로 이동하십시오. 손상된 지점에 시간을 낭비하지 마십시오. 바늘이 막히면, 깨진 유리 조각 쪽으로 바늘을 옮기십시오.

유리와 바늘이 동일한 초점 평면에 위치한 상태에서 바늘을 유리 안으로 조심스럽게 밀어 넣습니다. 주입 버튼을 눌러 바늘 끝에서 액체가 나오는지 확인하여 바늘이 막히지 않았는지 테스트합니다. 모든 US 부위에 주입이 완료되면, 바늘을 오일 밖으로 수동으로 이동시키고 현미경의 빔 경로 밖으로 방향을 조정합니다.

안구 손상을 방지하기 위해 안전한 방향으로 배치되었는지 확인하고 조명을 끕니다. 형광 이미징을 용이하게 하려면 속도가 필수적입니다. 난포 분리 후 세포 주입까지 1시간 이상이 경과하면 세포 주입이 어려워지고 스트레스와 관련된 표현형 변화가 나타날 수 있습니다.

Cyte를 거칠게 다루거나 과도한 양을 주입할 때도 유사한 문제가 발생할 수 있습니다. trenchgenic 형광 단백질을 발현하는 난소 챔버(Egg chambers)는 주입 과정 없이도 이미징이 가능합니다. 내인성 RNA의 MS two 표지는 in vitro 합성 전체 과정을 이용한 조직 분리 절차를 통해 양호한 결과로 이미징할 수 있습니다.

Alexa, 5 46 kin, RNA를 ME 31 BGFP 난실에 주입하면, RNA가 세포의 등쪽 앞부분에 국소화되어 핵 주변으로 캡 모양을 형성합니다. 숙달되면, 이 기술은 해부부터 이미징 시작까지 약 10분 내에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 수행할 때는 신속하면서도 주의 깊게 작업하여 조직이 손상되지 않도록 유의하십시오. 이 영상을 시청하고 나면 살아있는 Drosophila 세포 내의 역동적인 과정을 기록하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.