개별 준비 Drosophila 계란 회의소

다음 실험의 목적은 살아있는 초파리 U 부위의 동적 과정을 기록하는 것입니다. 이것은 먼저 잘 먹인 2일 된 암컷 파리에서 온전한 난소를 분리함으로써 달성됩니다. 두 번째 단계로, 난소에서 개별 안테나를 추출하여 난실을 이미지화합니다.

그런 다음 적절한 형광 단백질을 발현하는 경우, 개별 난실을 직접 이미지화하거나 이미징 전에 형광 마커의 미세 주입과 같은 추가 조작을 거칠 수 있습니다. 궁극적으로 영화 시퀀스 분석을 통해 세포 내 구성 요소의 동적 상호 작용을 밝힐 수 있습니다. 이 방법은 RNA 수송 및 국소 번역 분야에서 몇 가지 주요 질문에 답하는 데 도움이 되었습니다.

예를 들어, 신체 계획을 설정하는 단백질의 발현은 살아있는 감독 환경에서 시간과 공간에 따라 어떻게 조절됩니까? 일반적으로 이 방법을 처음 접하는 개인은 상당한 속도와 손재주가 필요하기 때문에 어려움을 겪을 것입니다. 두 가지 연습 모두 더 나은 결과를 얻을 수 있습니다.

이 방법의 시각적 시연은 난자 챔버의 조작이 텍스트를 전달하기 어렵고 환자의 기술적 전문성과 확실한 손이 필요하기 때문에 매우 중요합니다. 커버 슬립에 헤일로 카본 오일을 한 방울 떨어뜨리고 따로 보관하여 이 절차를 시작합니다. 그런 다음 준비된 파리를 이산화탄소로 마취시킵니다.

날카롭고 가는 코 집게를 사용하여 복부 앞쪽에 있는 뚱뚱한 암컷 파리를 잡습니다. 복부 중앙을 잡지 마십시오. 준비된 커버 슬립에서 약 2-3cm 위로 암컷을 잡습니다.

두 번째 집게를 사용하여 암컷의 맨 뒤쪽에 있는 조직을 제거합니다. 여기에는 일반적으로 깨끗한 집게가 있는 장 조직이 포함됩니다. 튜브에서 치약을 짜내는 것처럼 복부를 앞쪽에서 뒤쪽으로 부드럽게 마사지합니다.

난소는 크고 불투명한 구조처럼 보이며 집게 끝에 달라붙습니다. 슬라이드의 헤일로 카본 오일에 난소를 만져 난소를 수집합니다. 그런 다음 4-6개의 난소가 채취될 때까지 이 과정을 반복합니다.

안테나를 분리하기 전에. 조명이 얕은 각도로 슬라이드에 부딪히고 조직에 대비되는 그림자를 생성하도록 현미경의 광원을 조정합니다. 파리를 해부할 때는 올바른 도구를 사용하는 것이 매우 중요합니다.

우리가 사용하는 포인터는 너무 날카롭지 않아서 조직을 손상시키지만 상당히 뭉툭해서 우리가 사용하는 핀셋을 잡을 수 있습니다. 다시 말하지만, 너무 날카로워서 조직을 손상시키지는 않지만 도구를 구부리지 않고도 사물을 조작할 수 있을 만큼 충분히 미세합니다. 깨끗한 도구를 사용하는 것도 매우 중요하므로 닫힌 집게로 절차 전반에 걸쳐 정기적으로 청소합니다.

뒤쪽 끝에서 연결 조직을 제거하여 두 개의 난소를 분리합니다. 뒤쪽 끝에는 가장 성숙한 난자가 있습니다. 가장 어린 난소가 주로 사용하는 손을 향해 난소를 수평으로 향하게 합니다.

그런 다음 남아있는 결합 조직으로 뒤쪽 끝을 부드럽게 잡고 해부 프로 또는 텅스텐 바늘을 사용하여 개별 안테나를 추출합니다 : Jamar 단계에서 10 단계까지의 개별 난실은 서로 분리되지만 오래된 난실은 난소에 붙어 있습니다. 프로브를 사용하여 15-25개의 분리된 안테나를 오일 방울 중앙으로 조심스럽게 드래그합니다. 하나 이상의 난소를 절개해야 하는 경우 다른 파리에서 하나를 선택하십시오.

과도한 난소 조직은 모두 버리고 스트레스로 인해 세포가 표현형 변화를 보이기 시작하므로 빠르게 작업합니다. 난소에서 절제 한 지 40 분 후, 오일에서 여분의 난소 조직을 제거하십시오.중간 단계 세포 주입을위한 깨끗한 도구를 사용하여 안테나 방향을 커버 슬립의 긴 축에 수직으로 향하게합니다. 말기 난자를 격리합니다.

앞서 설명한 바와 같이 난소 그립의 뒤쪽에 다른 방법이 필요합니다. 해부 프로브를 집게 근처의 난소 뒤쪽 끝에 삽입합니다. 계란 챔버에 구멍이 뚫리지 않도록 말기 사이에 프로브를 삽입하십시오.tage 계란 챔버.

초기 단계의 난자 챔버에서 나올 때까지 난소를 통해 절개 바늘을 당깁니다. 올바르게 수행되면 프로브는 안테나와 후기 단계 난실을 제자리에 고정하고 있는 결합 조직을 제거합니다. 안테나가 커버 슬립에 펼쳐질 때까지 이 단계를 반복합니다.

난자 챔버가 더 이상 서로 겹쳐져 있지 않으면 이 단계가 완료된 것입니다. 해부 프로브를 사용하여 후기 단계의 난실을 분리하여 14기 위치에 대한 이미징을 용이하게 합니다. 목 챔버는 집게를 사용하여 등쪽 부속물을 잡습니다.

똥개를 고속으로 짧게 원심분리하여 주입할 용액을 준비합니다. 이렇게 하면 주사 바늘을 막을 수 있는 고체 침전물이 펠릿으로 만들어집니다. 그런 다음 주입 바늘에 로딩 팁을 넣고 로드된 주입 바늘을 주입기에 조심스럽게 부착합니다.

이제 샘플에 인접한 작은 유리 조각을 놓고 슬라이드를 현미경 스테이지에 장착합니다. 유리는 깨지거나 깨지는 벽 역할을 합니다. 바늘의 플러그를 뽑습니다.

실험을 위해 현미경 및 주입 장치를 준비합니다. 바늘 끝이 부러지지 않도록 주의하십시오. 가능한 경우, 주입을 위해 모든 8기 및 9기 세포를 표시하기 위해 포인트 방문 기능이 있는 자동화된 스테이지를 사용하십시오.

이제 오일에 닿을 때까지 주사 바늘을 내립니다. 표시된 점 목록에서 첫 번째 점을 선택하고 cyte에 초점을 맞춥니다. 바늘이 cyte와 같은 초점면에 있을 때까지 바늘을 수동으로 내립니다.

매니퓰레이터 컨트롤을 사용하여 주입 바늘의 끝을 U 사이트 내부에 올 때까지 이동합니다. 빠르게 찌르는 동작이 느린 동작보다 더 성공적인 경우가 많습니다. 안으로 들어가면 바늘에서 소량을 꺼내고 효과를 육안으로 평가하십시오.

반복이 필요합니다. 주입이 성공하면 세포 내부의 세포질이 변위됩니다. 주입된 유체의 정확한 양은 정량화하기 어렵습니다.

주입된 부피를 늘리려면 주입 펄스의 압력 또는 지속 시간을 조정하십시오. 바늘 끝을 부러뜨려 바늘 입구를 약간 늘리거나 다음 표시를 선택하기 전에 여러 주입 펄스를 사용하십시오. 사이트. 주사 바늘을 오일에서 충분히 높게 올려 다른 cyte에 부딪히지 않도록 합니다.

세포 내부의 바늘로 많이 찌르거나 오래 있으면 난실이 심각하게 손상됩니다. 그러니 서두르십시오. 주입은 10초 미만이 소요됩니다.

실수가 있는 경우 사이트의 다음 표시로 이동합니다. 시력이 손상된 데 시간을 낭비하지 마십시오. 바늘이 막히면 바늘을 깨진 유리 조각으로 옮기십시오.

유리와 바늘을 같은 초점면에 놓고 바늘을 유리에 부드럽게 밀어 넣습니다. 주입 버튼을 누르고 바늘 끝에서 액체가 나오는지 확인하여 바늘이 막혔는지 테스트합니다. 모든 미국 현장에 주입이 완료되면 바늘을 오일 밖으로 수동으로 이동하고 현미경의 빔 경로 밖으로 향하게 합니다.

눈 손상을 방지하기 위해 안전한 방향에 있고 조명이 꺼져 있는지 확인하십시오. 형광 이미징을 용이하게 하기 위해서는 속도가 필수적입니다. 난자 챔버 분리와 사이트 주입 사이에 한 시간 이상이 경과하면 세포를 주입하기 어렵고 스트레스와 관련된 표현형 변화를 나타냅니다.

cyte를 거칠게 다루거나 과도한 볼륨을 주입할 때 유사한 문제가 발생할 수 있습니다. 트렌치제닉 형광 단백질을 발현하는 난실은 주입 없이 이미지화할 수 있습니다. 내인성 RNA의 MS 2 라벨링은 전체 시험관 내 합성을 사용하여 조직 분리 절차를 사용하여 좋은 결과로 이미지화할 수 있습니다.

Alexa, 5 46 kin, RNA를 ME 31 BGFP 난실에 주입하고, RNA는 세포의 등쪽 전방에 국한되어 핵 주위에 캡을 형성했습니다. 이 기술은 박리 시점부터 이미징 시작까지 약 10분 안에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안 빠르지만 조심스럽게 작업하여 조직을 관리하십시오. 이 비디오를 시청한 후에는 살아있는 초파리 세포의 동적 과정을 기록하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.