특정 엔도와 exoglycosidases를 사용하여 단백질 글리코 실화의 식별 및 특성

다음 실험의 전반적인 목표는 모델 당단백질에서 효소 탈당화(enzymatic deglycosylation) 및 n 및 O 결합 당화(glycosylation) 분석을 위한 글리코세이트의 사용을 설명하는 것입니다. 이는 당단백질을 PGA의 F 또는 단백질 탈당화 혼합물로 처리함으로써 달성됩니다. 또한 단백질 탈당화 혼합물에는 추가 엑소 글리코 아스 혼합물이 보충되었는데, 이는 때때로 저항성 당을 제거하는 데 도움이 됩니다.

모델 당단백질 재조합 인간 융모성 성선 자극 호르몬 베타 또는 HCG 베타 다음 SDS 페이지를 사용하여 이 방법을 설명한 다음 쿠마시 블루 염색 및 당 특이적 염색 방법을 사용합니다. Pro Q Emerald 300은 D 글리코실화를 분석하기 위해 사용됩니다. HCG beta 샘플 결과가 얻어지며, 이는 HCG beta가 이질적으로 glycosylated이며 glycosate 처리 유무에 관계없이 단백질 이동의 차이와 글리칸이 연속적으로 제거됨에 따라 ProQ 염색 시 감소된 신호를 기반으로 여러 glyco form을 포함한다는 것을 보여줍니다.

질량 분석 분석과 같은 기존 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 간단하고 일반적인 실험실 장비를 사용하며 초보 글리코 생물학자에게 적합하다는 것입니다. 이 방법은 내 단백질 글리코실화와 같은 글리코 필드의 주요 질문에 답할 수 있습니다. 효소 탈당화를 시작하려면 단백질 탈당화 키트에서 제공된 완충액을 해동합니다.

튜브를 철저히 혼합하고 실온을 유지하십시오. 효소가 들어있는 바이알을 얼음에 놓고 HCG 베타 바이알의 내용물을 600 마이크로 리터의 증류수에 용해시키고 얼음에 보관하십시오. 10 x 스톡을 증류수에 희석하여 XG 7 버퍼 1 밀리리터를 준비한 후 25 마이크로 리터를 사용하여 PGA의 f 0.5 마이크로리터를 희석합니다.

4가지 엑소 글리코 질환 각각에 2개의 마이크로리터를 결합하여 엑소 글리코세이트 혼합물을 준비합니다. 다음으로, 쓰여진 의정서에서 나타난 것과 같이 7개의 번호가 매겨진 PCR 관에 HCG beta와 10의 x 당단백질 변성 완충액을 추가하고, 관을 모자를 씌우고 94 섭씨 온도에 10 분을 배양해서 thermocycler에 있는 단백질을 온화하게 섞으십시오, 각 반응 관에 눈에 보이는 응축을 제거하기 위하여 thermocycler 분리기에서 관을 제거한 후에 4 섭씨 파악 붙드, 서면 프로토콜에 따라 나머지 시약을 추가합니다. 새 캡을 사용하여 PCR 튜브를 닫습니다.

그런 다음 내용물을 회전시킨 후 부드럽게 네 번 두드려 튜브를 혼합하고 튜브를 섭씨 37도의 온도에서 4시간 동안 배양하는 써모사이클러에 넣습니다. 그런 다음 샘플을 섭씨 4도로 냉각합니다. SDS 페이지를 설정하려면 새로운 3배 감소 SDS 로딩 버퍼를 준비합니다.

DTT를 사용하여 준비된 3배 감소 SDS 로딩 버퍼 12.5마이크로리터를 추가합니다.amp각 샘플에 새 캡으로 튜브를 닫고 튜브를 가볍게 두드려 혼합합니다. 5 분 동안 94 섭씨 온도의 thermocycler에 튜브를 배양하고, 그 후 섭씨 4도까지 냉각한다 배양 부하, 각 샘플의 30 마이크로 리터와 단백질 마커의 10 마이크로 리터 10 - 20 % 트리 글리신 겔에. 각 샘플의 나머지 부분을 저장합니다.

D 정면이 젤의 바닥에 가까이 올 때까지 130 볼트에 젤을 전기화하십시오. 젤이 작동을 마치면 캐스트에서 젤을 제거하고 젤 얼룩을 덮을 수 있을 만큼 충분한 쿠마시 블루 얼룩이 있는 작은 플라스틱 상자에 넣습니다. 젤이 얼룩진 후 부드러운 교반으로 1 시간 동안 젤.

30분 동안 3회 세척합니다. 50ml의 억류 용액에 백색광 투광기 또는 스캐너를 사용하여 이미지를 기록합니다. 대안적으로, 젤은 셀로판 시트 사이에서 건조될 수 있습니다.

프레임에서 겔이 작동하는 동안 각 샘플의 나머지와 단백질 마커를 10-20% Tri glycine 겔에 실행합니다. ProQ 에메랄드 시약을 DMF로 용해시키고 키트와 함께 제공된 제품 설명서에 따라 얼룩에 대한 스톡 수정, 세척 및 산화 용액을 준비합니다. 전기영동이 완료되면 캐스트에서 젤을 제거하고 플라스틱 상자에 넣습니다.

준비된 고정 용액 100ml를 첨가하여 젤을 고정합니다. 젤을 실온에서 하룻밤 동안 그대로 두었다가 다음날 부드럽게 저어줍니다. 준비된 세척액 100ml로 젤을 실온에서 10-20분 동안 부드럽게 저어주면서 세척하고 새 세척액으로 두 번째 세척을 반복합니다.

다음으로, 준비된 산화 용액 25ml에서 30분 동안 부드러운 교반으로 겔을 배양하여 탄수화물을 산화시키고, 겔이 세척되는 동안 두 번의 추가 세척으로 배양을 따릅니다. 키트에 제공된 25ml의 염색 완충액에 500마이크로리터의 ProQ Emerald 300 시약 용액을 첨가하여 새로운 ProQ emerald 300 염색을 준비합니다. 겔 염색 후 90-120분 동안 부드러운 교반으로 어두운 조건에서 준비된 염색에서 배양하여 겔을 염색합니다.

앞에서 설명한 대로 두 가지 세척 단계를 반복합니다. 그런 다음 300나노미터의 UV 트랜스 일루미네이터로 이미지를 기록합니다. 마지막 단계로, 쿠마시 염색 젤과 ProQ 에메랄드 염색 젤의 이미지를 비교합니다.

효소 탈당화(enzymatic deglycosylation) 후 단백질 이동의 변화는 대조군 샘플을 PGA의 F 처리와 비교할 때 확인할 수 있습니다. n 글리칸을 제거하고 n 및 O 글리칸을 제거하기 위한 탈당화 혼합 처리에 대해 추가 글리코세이트로 분해한 후 더 이상의 크기 감소가 보이지 않습니다. 질량의 변화 외에도 글리칸이 제거됨에 따라 띠가 더 날카로워집니다.

17 킬로달톤 마커 아래에서 실행되는 띠는 아마도 완전히 탈글리코실레이트 HCG 베타 폴리펩티드를 나타낼 것입니다. 5-7번 레인은 글리코(Glyco)에 해당하는 밴드를 보여줍니다. 다른 밴드는 불완전한 탈당화(deglycosylation) 또는 HCG 베타 샘플에 존재하는 여러 미확인 단백질에서 파생될 수 있습니다.

에메랄드 그린 시약은 단백질 분자에 존재하는 모든 글리칸을 산화시키고 염색합니다. 따라서, 신호의 강도는 HCG 베타가 효소적으로 d glycosylated됨에 따라 감소합니다. 3열과 4열의 잔류 신호는 사용된 효소에 내성이 있는 글라이칸 모티프의 존재를 나타냅니다.

추가 글리코세이트는 4번째 레인에서 사용됩니다. 설탕 잔여물을 몇 개 더 제거하세요. 단백질 이동은 동일하지만 염색 강도가 약간 감소하는 것을 볼 수 있습니다.

저항성 설탕 부분이 모든 단백질 종에 존재하는 것은 아닙니다. 일부 띠는 에메랄드 그린에 의해 검출되지 않았으며, 이는 이들이 광범위하게 드 글리코실화되었음을 나타내며, 추가 데이터는 HCG 베타가 이질적으로 글리코실화되었다는 결론을 뒷받침합니다. 2번 레인의 아래쪽 밴드는 에메랄드 그린 이미지에서 희미합니다.

2열의 상단 띠는 밝지만 많은 GLYCAN 그룹이 여전히 존재함을 나타내지만, 이러한 데이터는 마우스 세포에서 발현되는 재조합 HCG 베타가 글리코실화의 고유한 이질성으로 인해 여러 글리코 형태를 포함하고 있다는 결론을 뒷받침합니다. 이 절차에 따라 질량 분석법과 같은 다른 방법을 수행하여 점유율이 얼마인지와 같은 추가 질문에 답할 수 있습니다. 글리코실화(glycosylation)의 정도는 어느 정도입니까, 또는 글리칸의 미세한 구조는 무엇입니까?

이 동영상을 시청한 후에는 NNO 결합 글라이칸의 효소 탈당화 및 분석에 글리코실레이트를 사용하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 당단백질에. 단백질 염색 영역은 de glycosylation이 다른 단백질의 분자 질량에 상당한 변화를 일으키는 경우에만 유용하기 때문에 검출 선택이 어려울 수 있습니다.

우리는 de glycosylation 후에 비정상적인 이동을 보았고 이동의 모든 변화는 단백질이 de glycosylated되었다는 증거임을 발견했습니다.