특정 엔도와 exoglycosidases를 사용하여 단백질 글리코 실화의 식별 및 특성

다음 실험의 전반적인 목적은 모델 당단백질의 n 및 O 결합 당화에 대한 효소적 탈당화 및 분석을 위해 glycosate를 사용하는 방법을 보여주는 것입니다. 이는 당단백질을 PGA's F 또는 단백질 탈당화 믹스로 처리함으로써 수행됩니다. 또한, 때때로 제거하기 어려운 당을 제거하는 데 도움이 되는 추가적인 exo glyco ass 혼합물을 단백질 탈당화 믹스에 보충하였습니다.

우리는 모델 당단백질인 재조합 인간 융모성 성선 자극 호르몬 베타(recombinant human chorionic gonadotropin beta, HCG beta)를 사용하여 이 방법을 설명하며, 이어서 SDS-PAGE, 쿠마시 블루(Kumasi blue) 염색 및 당 특이적 염색법을 수행합니다. N-당화(N-glycosylated)를 분석하기 위해 Pro Q Emerald 300이 사용됩니다. HCG beta 샘플 결과에서는 당화 효소 처리 유무에 따른 단백질 이동의 차이와 글라이칸이 순차적으로 제거됨에 따라 ProQ 염색 신호가 감소하는 것을 통해, HCG beta가 불균일하게 당화되어 있으며 여러 가지 당쇄 형태(glycoforms)를 포함하고 있음을 보여줍니다.

질량 분석법과 같은 기존 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은 방법이 간단하고 일반적인 실험실 장비를 사용하며 초보 당생물학자에게 적합하다는 것입니다. 이 방법은 내 단백질이 당화되었는가와 같이 당생물학 분야의 핵심적인 질문에 대한 답을 제공할 수 있습니다. 효소적 탈당화(enzymatic deglycosylation)를 시작하려면 단백질 탈당화 키트에 제공된 버퍼를 해동하십시오.

튜브를 충분히 섞고 실온에서 보관하십시오. 효소가 포함된 바이알은 얼음에 놓아두고, HCG beta 바이알의 내용물을 600 µL의 증류수에 녹여 얼음 위에 보관하십시오. 10 x 스톡 용액을 증류수로 희석하여 1 mL의 1 XG seven 버퍼를 준비한 후, 이 중 25 µL를 사용하여 0.5 µL의 PGA's f를 희석하십시오.

네 가지 exo glyco disease를 각각 2 µL씩 혼합하여 exo glycosate 믹스를 준비합니다. 다음으로, 서면 프로토콜에 명시된 대로 번호가 매겨진 7개의 PCR 튜브에 HCG beta와 10 x glycoprotein 변성 버퍼를 첨가하고, 튜브의 캡을 닫은 후 부드럽게 섞습니다. 써모사이클러에서 94 °C로 10분간 배양한 후 4 °C에서 유지하여 단백질을 변성시킵니다. 써모사이클러에서 튜브를 꺼내 원심분리하여 각 반응 튜브에 보이는 응결수를 제거한 다음, 서면 프로토콜에 따라 나머지 시약들을 첨가합니다. 새 캡을 사용하여 PCR 튜브를 닫습니다.

그런 다음, 원심분리를 통해 내용물을 가라앉힌 후 튜브를 가볍게 네 번 두드려 섞고, 튜브를 서모사이클러에 넣어 37 °C에서 4시간 동안 배양합니다. 이어서 샘플을 4 °C로 냉각합니다. SDS-PAGE를 준비하기 위해, 신선한 3x 환원 SDS 로딩 버퍼를 제조합니다.

DTT가 포함된 준비된 3x 환원 SDS 로딩 버퍼 12.5 µL를 각 시료에 첨가하고, 새 캡으로 튜브를 닫은 후 가볍게 두드려 혼합합니다. 써모사이클러(thermocycler)를 사용하여 94 °C에서 5분간 배양한 다음, 4 °C로 냉각합니다. 배양 후, 각 시료 30 µL와 단백질 마커 10 µL를 10~20% tri-glycine 겔에 로딩합니다. 각 시료의 잔량은 보관합니다.

염색약 전선이 겔 하단에 도달할 때까지 130 V에서 겔 전기영동을 수행합니다. 전기영동이 완료되면 캐스트에서 겔을 분리하여 겔이 충분히 잠길 정도의 쿠마시 블루(kumasi blue) 염색액이 들어 있는 작은 플라스틱 상자에 넣습니다. 완만한 교반 상태에서 1시간 동안 겔을 염색합니다.

30분 동안 3회 세척합니다. 50 milliliters의 detain 용액 내에서 화이트 라이트 투과조명기(transluminator) 또는 스캐너를 사용하여 이미지를 기록합니다. 또는, 겔을 셀로판지 사이에 끼워 건조할 수도 있습니다.

젤이 전기영동되는 동안, 각 샘플의 잔여물과 단백질 마커를 10~20% Tri glycine 젤에서 실행합니다. 키트에 제공된 제품 설명서에 따라 DMF로 ProQ emerald 시약을 용해하고, 염색을 위한 스톡 고정액, 세척액 및 산화 용액을 준비합니다. 전기영동이 완료되면 캐스트에서 젤을 꺼내 플라스틱 상자에 넣습니다.

준비된 고정액 100 milliliters를 첨가하여 겔을 고정합니다. 겔을 상온에서 완만하게 교반하며 하룻밤 동안 둡니다. 준비된 세척액 100 milliliters를 사용하여 상온에서 완만하게 교반하며 10분에서 20분 동안 겔을 세척하고, 새로운 세척액으로 세척 과정을 한 번 더 반복합니다.

다음으로, 준비된 산화 용액 25 milliliters 내에서 겔을 완만하게 흔들어 30분 동안 배양하여 탄수화물을 산화시킨 후, 겔을 세척하면서 두 차례 추가로 세척합니다. 키트에 제공된 염색 완충액 25 milliliters에 ProQ Emerald 300 시약 용액 500 microliters를 첨가하여 신선한 ProQ emerald 300 염색액을 준비합니다. 겔 염색 단계에서, 준비된 염색액 내에서 암실 조건으로 완만하게 흔들어 90분에서 120분 동안 배양하여 겔을 염색합니다.

앞서 설명한 두 번의 세척 단계를 반복합니다. 그런 다음 300 nanometers의 UV 투과 조명기를 사용하여 이미지를 기록합니다. 마지막 단계로, kumasi 염색된 젤의 이미지와 ProQ emerald 염색된 젤의 이미지를 비교합니다.

대조군 샘플을 PGA의 F 처리군과 비교하면 효소적 탈당화 후 단백질 이동의 변화를 확인할 수 있습니다. n-글리칸을 제거하기 위해 Deglycosylation mix 처리를 하여 n-글리칸과 O-글리칸을 제거한 경우, 추가적인 glycosate로 소화시킨 후에도 크기의 더 이상의 감소는 보이지 않습니다. 질량 변화 외에도, 글리칸이 제거됨에 따라 밴드가 더 선명해집니다.

17 kilodalton 마커 아래에서 나타나는 밴드는 완전히 탈당쇄화된 HCG 베타 폴리펩타이드일 가능성이 높습니다. 5번에서 7번 레인은 Glyco에 해당하는 밴드를 보여줍니다. 다른 밴드들은 불완전한 탈당쇄화 또는 HCG 베타 샘플에 존재하는 확인되지 않은 여러 단백질로 인해 발생했을 수 있습니다.

에메랄드 그린 시약은 단백질 분자에 존재하는 모든 글리칸을 산화시키고 염색합니다. 따라서 HCG beta가 효소에 의해 탈글리코실화됨에 따라 신호 강도가 감소합니다. 3번 및 4번 레인의 잔류 신호는 사용된 효소에 내성이 있는 글리칸 모티프가 존재함을 나타냅니다.

추가적인 glycosate가 4번 레인에 사용되었습니다. 당 잔기를 몇 개 더 제거합니다. 단백질 이동도는 동일하지만, 염색 강도가 약간 감소한 것을 확인할 수 있습니다.

저항성 당 잔기는 모든 단백질 종에서 나타나지 않았습니다. 일부 밴드는 emerald Green으로 검출되지 않았으며, 이는 해당 밴드들이 광범위하게 탈당쇄화되었음을 나타냅니다. 추가 데이터는 HCG beta가 불균일하게 당쇄화되어 있다는 결론을 뒷받침합니다. lane 2의 하단 밴드는 emerald green 이미지에서 희미하게 나타납니다.

2번 레인의 상단 밴드가 밝게 나타난 것은 여전히 많은 GLYCAN 그룹이 존재함을 나타내지만, 이러한 데이터는 마우스 세포에서 발현된 재조합 HCG beta가 당화의 내재적 불균일성으로 인해 여러 당쇄 형태를 포함하고 있다는 결론을 뒷받침합니다. 이 절차 이후에는 점유율은 어느 정도인가? 당화의 범위는 어느 정도인가? 또는 당쇄의 미세 구조는 어떠한가?와 같은 추가적인 질문에 답하기 위해 질량 분석법과 같은 다른 방법들을 수행할 수 있습니다.

이 영상을 시청하신 후, 당단백질의 N-연결 당쇄에 대한 효소적 탈당화 및 분석을 위해 glycosylate를 사용하는 방법에 대해 충분히 이해하시게 될 것입니다. 단백질 염색 영역은 탈당화로 인해 분자 질량의 유의미한 변화가 나타나는 단백질에 대해서만 유용하기 때문에, 검출 방법의 선택이 어려울 수 있습니다.

탈당쇄화 후에 비정상적인 이동을 확인하였으며, 이동 양상의 모든 변화는 해당 단백질이 탈당쇄화되었다는 증거임을 발견했습니다.