자동을 사용하여 염색체의 높은 처리량 물리적 매핑 현장에서 하이브리드화
2012년 6월 28일
대규모 병렬 DNA 염기서열 분석 기술을 기반으로 하는 게놈 어셈블리는 일반적으로 매우 단편화되어 있습니다. 물리적 염색체 지도의 개발은 잠재적으로 게놈 어셈블리를 개선할 수 있습니다. 여기에서는 염색체 준비, 형광 현장 혼성화 및 이미징에 대한 혁신적인 접근 방식을 보여주며 물리적 맵 개발의 처리량을 크게 증가시킵니다.
이 절차의 전반적인 목표는 고압 염색체 제제를 사용하여 DNA 프로브를 모기 폴리탄 염색체에 매핑한 다음 C 2 혼성화에서 자동 형광 및 자동 이미징을 수행하는 것입니다. 이는 먼저 고압 방법을 사용하여 폴리탄 염색체 스프레드를 준비함으로써 수행됩니다. 절차의 다음 단계는 Nick translation protocol을 사용하여 형광 색소로 게놈 백 DNA를 라벨링하여 형광 프로브를 준비하는 것입니다.
세 번째 단계는 자동 슬라이드 염색 시스템을 사용하여 C 2 혼성화에서 형광을 수행하는 것입니다. 마지막 단계는 자동 형광 이미징 시스템을 사용하여 표지된 염색체를 스캔하고 사진을 찍는 것입니다. 궁극적으로 이미지는 다염색체에서 형광 표지된 DNA 프로브의 위치를 보여줄 수 있습니다.
이 기술 또는 표준 수동 현장 하이브리드화 프로토콜과 같은 기존 방법의 주요 장점은 처리량이 가장 높은 물리적 매핑 프로토콜이 보다 일관된 결과를 생성하고 실습 시간을 크게 줄인다는 것입니다. 이 프로토콜은 반중력 암컷과 올리피 암컷을 수유 후 약 25시간 후에 해부하여 크리스토퍼 3기에 있을 때 난소를 채취하는 것으로 시작합니다. 이 단계에서 여포 내에 수유 세포가 있는 투명 영역은 둥근 모양이어야 하며 5명의 암컷으로부터 난소를 수집하고 500마이크로리터의 갓 만든 수정된 자동차 소음 용액에 고정해야 합니다.
그런 다음 실온에서 최대 24시간 동안 보관하거나 섭씨 영하 20도에서 더 오래 보관할 수 있습니다. 다음으로, 난소 박리 슬라이드를 만들기 직전에 자동차 소음 용액과 50% 프로피온산을 준비합니다. 각 난소 쌍을 해부 현미경 아래의 먼지가 없는 슬라이드에 새 자동차 소음 용액 한 방울에 떨어뜨립니다.
절개 바늘로 난소를 분리합니다. 모든 난소 조각을 50%프로피온산이 함유된 6개의 깨끗한 슬라이드로 옮깁니다. 해부 바늘을 사용하여 모낭을 서로 분리합니다.
그런 다음 종이 타월로 남아 있는 티슈를 닦아냅니다. 프로폰산 50%를 한 방울 더 떨어뜨리고 3-5분 동안 기다립니다. 전설적으로, 여포는 3 분에서 5 분 동안 50 % 프로폰산에 앉아 염색체 퍼짐을 크게 향상시킵니다.
다음으로, 커버 슬립을 바르고 핵이 퍼질 때까지 1분 더 기다립니다. 슬라이드를 여과지와 플라스틱으로 감쌉니다. Dremel을 3에서 5, 000 RPM 사이로 설정하고 약 1분 동안 회전하는 Dremel 팁을 커버 슬립에 가볍게 소용돌이칩니다.
위상 현미경으로 확산 품질을 확인하고 필요한 경우 dremel을 더 오래 적용하여 염색체를 평평하게 합니다. 두 번째 커버 슬립을 첫 번째 커버 슬립에 인접한 곳에 놓고 커버 슬립을 다른 현미경으로 끼웁니다. 다음으로 슬라이드를 플라스틱 시트와 여과지로 감싸고 랩 슬라이드를 바이스에 넣어 슬라이드를 85인치에서 120인치 파운드 사이로 압착합니다.
6개의 슬라이드 모두에서 염색체를 평평하게 한 후 슬라이드의 포장을 풀고 여분의 슬라이드를 제거하여 염색체를 더 평평하게 만듭니다. 슬라이드 변성 혼성화 시스템에서 섭씨 55도에서 10-15분 동안 슬라이드를 배양합니다. 그런 다음 슬라이드를 액체 질소에 최소 15초 동안 또는 거품이 멈출 때까지 담그십시오.
그런 다음 면도날로 덮개를 빠르게 제거하고 미끄러진 다음 즉시 슬라이드를 50% 에탄올의 차가운 물에 5분 동안 놓습니다. 각 슬라이드에 대해 이 과정을 순차적으로 반복합니다. 70%a, 90% 및 100% 에탄올 수조에서 슬라이드를 탈수합니다.
각 욕조에 5분 동안 담가두세요. 마지막으로, 슬라이드가 자연 건조된 후 물고기가 염색할 준비가 된 것입니다. 자동화된 장치는 프로브 레이블 지정을 제외한 절차의 대부분의 단계를 수행합니다.
따라서 장치를 로드하기 전에 프로브가 준비된 상태에서 상용 NIC 변환 프로토콜을 사용하여 형광 색소로 DNA를 다시 라벨링하여 형광 프로브를 준비하고 슬라이드와 시약을 자동화된 슬라이드에 로드합니다. 염색 시스템을 만들고 다음 단계를 수행하도록 시스템을 프로그래밍합니다. 먼저 800마이크로리터의 XPBS 1개를 20분 동안 공급합니다.
둘째, 슬라이드를 바람으로 말리십시오. 셋째, 1 XPBS에 450 마이크로 리터의 4 % 포르말린이 든 슬라이드를 1 분 동안 고정합니다. 그런 다음 100% 에탄올로 슬라이드를 1초, 두 번, 2분 동안 세척합니다.
에탄올 목욕 후 한 번 슬라이드를 다시 말리십시오. 이제 거품이 생기지 않도록 섭씨 45도에서 2분 동안 슬라이드를 가열합니다. 그런 다음 DNA 프로브 20 마이크로 리터를 적용한 다음 미네랄 오일 한 방울과 자연 속의 커버 슬립을 적용하고 염색체를 섭씨 90도에서 10 분 동안 적용합니다.
그런 다음 슬라이드를 섭씨 42도에서 14시간 동안 하이브리드화하도록 설정합니다. 혼성화 세트 후 섭씨 42도에서 2분 동안 엄격하게 세척한 후 2개의 XSSC를 4회 연속 1초 도포하고 건조합니다. 그런 다음 섭씨 42도에서 0.4 XSSC 800마이크로리터를 10분 동안 두 번 바른 다음 한 번 더 씻고 25도에서 10분 동안 두 번 XSSC
를 바르십시오.이제 50 마이크로 리터의 요요 얼룩을 바르고 미네랄 오일을 바르고 슬립을 덮습니다. 슬라이드를 섭씨 25도에서 10분 동안 배양합니다. 그런 다음 커버 슬립을 제거합니다.
두 개의 XSSC로 슬라이드를 세척할 때마다 1초 동안 4번 세척하고 슬라이드를 불어 말리십시오. 마지막으로, 각 슬라이드에 15마이크로리터의 연장된 금 퇴색 방지 시약을 바르고 새 커버 슬립을 부착합니다. 할로겐 전구용 Olympus U-R-F-L-T 전원 공급 장치부터 시작하여 Accord plus 자동 스캐닝 시스템의 전원을 켭니다.
그 다음에는 컴퓨터, 그리고 마지막으로 카메라가 부착된 현미경입니다. 이제 듀엣 소프트웨어 패키지를 먼저 열고 10 x 사전 스캔을 설정합니다. 온라인 버튼을 클릭하고 새 사례 ID를 입력한 다음 슬라이드 ID를 할당합니다.
bf라고 표시된 점을 클릭합니다. 이것은 명시야 옵션입니다. 10 x 사전 스캔에 대한 스캔 선택 사항을 선택합니다.
2, 500 x 원, 10, 000 x 원 또는 직사각형을 선택합니다. 설정 및 실행을 클릭합니다. 그런 다음 프롬프트에 따라 스캔을 적절하게 조정한 다음 마침을 클릭합니다.
스캔을 시작하려면 메인 탭을 눌러 메인 화면으로 돌아갑니다. 이제 오프라인 버튼을 클릭하고 할당된 케이스 ID와 슬라이드 ID를 찾습니다. 그리고 오프라인을 클릭합니다.
왼쪽 상단 영역의 블랙 박스를 스캔합니다. 화살표를 클릭하고 10 x 사전 스캔을 선택합니다. 화살표를 사용하여 관심 있는 이미지를 찾은 후 스캔한 이미지를 살펴봅니다.
대상 영역의 중간에 있는 화면을 두 번 클릭하고 스냅을 누릅니다. 이렇게 하면 모든 대상을 선택한 후 나중에 캡처할 이미지를 대상으로 합니다. 각 이미지를 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고, 분류를 클릭하고, 10 x 사전 스캔을 선택하고, 폴리탄을 선택합니다.
메인 메뉴로 돌아가서 40 x 사전 스캔을 설정합니다. 온라인을 다시 선택하고 슬라이드를 선택합니다. BF를 ffl로 변경하고 작업 이름을 변경하여 dash X 40 dash rg를 다시 방문합니다.
마지막 설정 바로 아래에 있는 섹션을 변경하여 dash all을 다시 방문합니다. 그런 다음 프로그램을 실행하고 지시를 따릅니다. 자동화를 설정하려면 일치하는 보기 시작 버튼을 클릭하여 10x 및 40x 이미지를 일치시킵니다.
마침을 클릭하여 스캔을 시작합니다. 완료되면 분류를 클릭하고 이미지를 확인합니다. 여성 기형 감비아의 난소 간호사 세포 폴리탄 염색체의 준비는 고압 기술을 사용하여 이루어졌습니다.
이 방법은 대부분의 염색체 구조를 손상시키거나 변경하지 않습니다. 그것은 구부러진 염색체를 평평하게 하여 일반 제제에서 볼 수 없는 숨겨진 미세한 띠를 드러냅니다. 염색체는 변칙 S 감비아 및 탐 백 라이브러리에서 얻은 백 DNA 클론으로 프로브되었습니다.
라이브러리는 변칙 S 감비아 해충 균주의 별 유충에서 먼저 수컷과 암컷으로 생성되었습니다. 이 절차에 따라 염색체 기반 게놈 어셈블리의 빠른 발달을 촉진하기 위해 자동화된 고처리량 물리적 매핑을 수행할 수 있습니다.
개요
본 연구는 모기 폴리탄 염색체에 DNA 프로브를 매핑하기 위한 고처리량 프로토콜을 제시합니다. 고압 염색체 준비 및 자동 이미징 기술을 활용하여, 이 방법은 물리적 지도 개발의 효율성과 일관성을 향상시킵니다.
주요 연구 구성요소
과학 분야
- 유전체학
- 염색체 매핑
- 형광 현장 하이브리드화
배경
- DNA 시퀀싱으로부터 얻은 게놈 어셈블리는 종종 파편화됩니다.
- 물리적 염색체 지도는 게놈 어셈블리의 품질을 향상시킬 수 있습니다.
- 혁신적인 기술은 물리적 매핑에서 처리량을 증가시킬 수 있습니다.
- 자동화된 시스템은 실험실 절차에서 직접 작업 시간을 줄일 수 있습니다.
연구 목적
- 염색체 매핑을 위한 고처리량 프로토콜을 개발합니다.
- 물리적 지도 개발에서 자동 이미징의 효과를 입증합니다.
- 기존 방법에 비해 결과의 일관성을 향상시킵니다.
사용된 방법
- 모기 난소에서 고압 염색체 준비.
- 닉 트랜스레이션 프로토콜을 사용한 형광 프로브 라벨링.
- 자동화된 형광 현장 하이브리드화.
- 염색체 국소화를 위한 자동 이미징.
주요 결과
- 이 프로토콜은 일관성 있고 고품질의 염색체 스프레드를 생성합니다.
- 자동화된 시스템은 물리적 매핑에 필요한 시간을 크게 줄입니다.
- 이미지는 형광으로 라벨링된 DNA 프로브의 국소화를 효과적으로 보여줍니다.
- 이 방법은 수동 프로토콜에 비해 처리량을 향상시킵니다.
결론
- 이 고처리량 프로토콜은 염색체 매핑에서 중요한 발전입니다.
- 자동화는 물리적 매핑에서 효율성과 일관성을 향상시킵니다.
- 입증된 기술은 다른 게놈 연구에 적용될 수 있습니다.
자주 묻는 질문
Executive Industry Relevance
High-throughput physical chromosome mapping addresses a critical bottleneck in genome assembly quality, directly impacting downstream genomic analyses and evolutionary studies. By enabling rapid, consistent localization of DNA probes, this approach supports de-risking of target validation and improves predictive confidence in comparative genomics workflows. The integration of automation reduces hands-on time and enhances reproducibility, positioning the method as a scalable capability for large-scale sequencing projects.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of genomic architecture and clarification of gene localization relative to phenotypic traits.
- Operational Value: Reduces ambiguity in gene annotation by assigning contigs to specific chromosomal locations.
- Predictive Value: Supports mechanistic de-risking by improving confidence in gene function inference through accurate physical mapping.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Produces standardized, high-resolution chromosome spreads suitable for reproducible FISH-based assays.
- Operational Value: Automated staining and imaging systems increase throughput and reduce variability in probe localization detection.
- Assay Readiness: Generates quantifiable spatial outputs that enable comparison across genetic variants or experimental conditions.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Facilitates evolutionary analysis and phylogenetic reconstruction by assigning orientation and location to sequencing contigs.
- Preclinical Model Relevance: Supports vector competence studies by enabling comparative genomics in disease-transmitting versus non-transmitting species.
- Risk-Adjusted Advancement: Improves genome annotation quality, reducing false positives in target identification pipelines.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from early genome sequencing through annotation and comparative analysis, particularly when physical map resolution is needed to resolve assembly gaps or misassemblies.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing regarding gene order, synteny, and chromosomal evolution in disease-relevant models.
- Screening: Enables standardized, automated FISH workflows for high-throughput probe validation and localization screening.
- Analytics: Generates spatial and intensity-based readouts that allow quantitative comparison of probe binding across chromosomes or samples.
- Translational Research: Connects physical mapping to evolutionary inference and biomarker discovery in comparative genomics studies.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable, automated platform for physical mapping applicable across multiple species and projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in gene annotation and reduces mechanistic ambiguity in genomic data interpretation.
- Operational Value: Delivers standardization, reproducibility, and scalability through automation of staining, hybridization, and imaging steps.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions in target selection by enhancing genome assembly reliability and reducing biological false leads.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of genomic targets through improved assembly quality and evolutionary insight.
Implementation Considerations
- Requires expertise in chromosome preparation, FISH protocols, and automated imaging systems.
- Dependent on access to high-pressure preparation tools, automated slide stainers, and motorized fluorescence microscopes.
- Necessitates cross-team standardization for probe labeling, hybridization conditions, and image analysis pipelines.
- Adaptation across model systems may require optimization of chromosome spreading and denaturation steps.
- Practical limitations include dependency on high-quality polytene chromosomes and suitability primarily for dipteran genomes with polytene stages.
