Biofabrication와 바이오 전자 인터페이스 브리지

다음 실험의 전반적인 목표는 생체 고분자 박막을 전기적으로 증착하고, 이를 단백질 및 세포와 같은 생물학적 성분으로 기능화하는 것입니다. 전기 증착은 pH 응답성 다당류 용액과 결합하여 바이어스 전극에서 국소적으로 발생하는 pH 변화를 이용함으로써 이루어집니다. 캐소딕 또는 애노딕 증착 전략을 선택함에 따라 전극에 바이어스를 가해 졸-겔 전이를 유도하며, 이를 통해 전극 기하 구조에 의해 정의된 패턴을 가진 박막을 생성합니다.

또한, 전극 증착 과정 전반에 걸쳐 단백질 및 세포와 같은 생물학적 구성 요소를 도입할 수 있습니다. 박막을 생물학적으로 기능화하기 위해 형광 이미징을 통해 생물학적 구성 요소가 박막에 국소화되어 있음을 보여주는 결과를 얻었습니다. 또한, 효소 활성의 전기화학적 검출과 리포터 세포 반응의 활용을 통해 해당 구성 요소들이 기능적이며 주변 환경과 상호작용할 수 있음을 입증하였습니다.

바이오패브리케이션은 생물학과 전자공학 사이의 인터페이스를 구축하기 위한 새로운 툴박스를 제공합니다. 우리는 이 기술의 주요 장점이 단순함과 생리적 조건에 가까운 환경에서 조립이 가능하다는 점에 있다고 믿습니다. 생물학은 자기 조립과 효소적 수단을 통해 나노 스케일에서 제작하는 데 매우 능숙합니다. 이러한 능력을 활용함으로써, 우리는 다른 조립 기술들이 사용하는 복잡하고 위험하며 시간이 많이 소요되는 합성 방법들을 우회할 수 있습니다.

저희 공동 연구팀은 키탄(kitan)이 전극 증착될 수 있다는 점을 관찰한 후, 생물학적 재료와 메커니즘을 사용하여 BioD 장치 인터페이스를 구축한다는 아이디어를 얻었습니다. 키탄은 장치에서 가해진 전기 신호를 인식하여 박막으로 증착될 수 있는 pH 응답성 필름 형성 다당류입니다. 키탄의 전극 증착 가능성을 확인한 후, 저희는 생화학 및 분자 생물학의 더 광범위한 도구들을 활용하여 BioD 장치 인터페이스를 구축할 수 있다는 것을 깨달았습니다.

이러한 기술의 응용은 기능성 생물학적 성분이 필요한 랩온칩(lab-on-a-chip) 설정으로 확장될 수 있는데, 이는 해당 성분들이 활성을 유지하며 전극 위에 국소화될 수 있는 저렴하고 쉬운 방법을 제공하기 때문입니다. 바이오 패브리케이션 필름은 섬세하며 쉽게 손상될 수 있으므로 이 방법의 시각적 시연이 매우 중요합니다. 따라서 필름을 세척하거나 헹굴 때 너무 강한 자극을 주지 않도록 주의해야 합니다.

필름은 쉽게 손상될 수 있습니다. 하지만 반대로 필름을 쉽게 제거할 수 있어 전극을 재사용할 수 있다는 장점이 있습니다. 이 프로토콜을 시작하려면, 악어 클립과 패치 코드를 사용하여 맞춤 제작된 전극을 전원 공급 장치에 연결하십시오.

인듐 주석 산화물(ITO)이 코팅된 유리 슬라이드를 양극 또는 작업 전극으로 사용하고, 백금 박막을 음극 또는 상대 전극으로 사용합니다. 기능화할 ITO 표면이 상대 전극과 마주 보도록 전극을 배치하며, 이때 ITO 표면은 용액에 담글 수 있도록 수직으로 배치하거나 용액이 표면에 유지될 수 있도록 수평으로 배치합니다. 다음으로, 1% alginate와 0.5% calcium carbonate를 증류수에 혼합하고 오토클레이브로 멸균하여 alginate 증착 용액을 준비합니다. 그 후, Fluor spheres를 혼합하고 볼텍싱하여 alginate에 형광 표지를 합니다.

이를 통해 결과물로 얻어진 필름의 형광 이미징이 가능해집니다. 오토클레이브 처리 후, 준비된 증착 용액에 두 전극을 모두 담급니다. 2분 동안 3 A/m²의 일정 전류 밀도를 가합니다. 전압은 2~3 V 범위 내에서 변동될 것입니다. 2분 후 전극을 분리하고 증착되지 않은 용액을 제거합니다. 과잉의 알긴산염을 제거하기 위해 필름을 염화나트륨으로 가볍게 헹굽니다.

겔을 강화하기 위해 필름을 0.1 molar calcium chloride에 잠시 배양합니다. 그 다음 필름을 원하는 보관 용액에서 배양합니다. 공동 증착 전, 형광 현미경을 사용하여 필름의 이미지를 촬영하십시오.

본 영상에 첨부된 서면 프로토콜의 지침에 따라 신호 송신 세포 배양액과 신호 수신 세포 배양액을 배양하십시오. 다음으로, 알긴산과 탄산칼슘의 증착 용액을 준비합니다. 각 세포 배양액과 이 용액을 1:1 비율로 혼합하여, 최종 농도가 1% 알긴산 및 0.5% 탄산칼슘이 되고 세포 농도는 원래 배양 밀도의 약 절반으로 희석되도록 합니다.

폴리디메틸실란(poly dimethyl silane) 웰로 둘러싸인 두 개의 ITO 전극이 패턴화된 유리 슬라이드와 백금 상대 전극을 사용하십시오. 하나의 ITO 전극과 백금 전극을 전원 공급 장치에 연결합니다. 이전과 마찬가지로, 수신 세포가 포함된 증착 용액에 전극을 담그십시오.

전원 공급 장치를 m²당 3A의 전류 밀도로 정전류 모드로 설정하십시오. 이때 표면적 치수는 증착이 일어날 단일 전극에 의해 정의됩니다. 세포가 알긴산 매트릭스 내에 공동 증착될 수 있도록 2분 동안 전류를 인가하십시오. 이전과 동일하게 염화나트륨으로 필름을 헹구고, 반대쪽 연결을 인접한 ITO 전극으로 전환하십시오.

증착 절차를 반복하되, 이번에는 송신 세포가 포함된 용액을 주입합니다. 공동 증착된 세포와 calcium argenate가 포함된 2전극 칩을 phosphate buffered saline 내에서 37°C로 하룻밤 동안 배양합니다.

10% LB 배지와 1 mM 염화칼슘을 첨가합니다. 배양 후, 형광 현미경을 사용하여 칩을 촬영하여 키토산 전극 증착을 시작합니다. 전원 공급 장치를 전극에 연결합니다.

악어 클립을 연결합니다. 금 코팅 실리콘 칩은 음극으로, 백금 박막은 양극으로 사용합니다. 이전과 마찬가지로 상대 전극이 증착될 수 있도록 금 전극 표면을 배치합니다.

Kato sand flake를 물에 섞고 2 M 염화수소를 천천히 첨가하여 다당류를 용해시켜 Kato sand 용액을 준비합니다. 본문에 언급된 절차에 따라, 형광 현미경으로 전극에 증착된 박막을 이미지화하기 위해 Kato sand 용액을 형광 표지할 수 있습니다. 그다음, 전극을 kaizan 용액에 넣어 증착하려는 영역이 완전히 잠기도록 합니다.

작업 전극의 표면적을 기준으로 계산된 4 A/m²의 밀도로 2분 동안 일정 전류를 가합니다. 이 경우, 4 mm² 크기의 금 전극에 16 µA의 전류를 가하며, 전압은 2~3 V 범위 내에서 변동합니다. 전극을 탈이온수로 헹구어 과잉의 chitosan을 제거합니다. 이후 형광 현미경을 사용하여 박막의 이미지를 촬영합니다. 4 A/m²의 전류 밀도에서 용액으로부터 copos chitosan 및 glucose oxidase를 패턴화된 전극 위에 증착합니다.

키토산 전극 증착 절차에 따라, 글루코스 산화효소가 포집된 카이잔 필름이 생성됩니다. 처리된 전극을 작업 전극으로, 백금선을 상대 전극으로, 은/염화은을 기준 전극으로 하여 3전극 시스템에 연결하고, 염화나트륨이 포함된 인산염 완충 용액에 전극들을 침지합니다. 접합 후 크로노포토메트리(chrono pyrometry)를 이용하여 60초 동안 일정 전압을 인가함으로써 단백질을 카이잔 필름에 전기화학적으로 접합시킵니다.

칩을 인산 완충액에 넣고 오비탈 셰이커에서 10분 동안 세척하여 반응하지 않은 염화나트륨과 접합되지 않은 글루코스 옥시다아제를 제거합니다. 3전극 시스템을 다시 연결하고 5 mM 글루코스 용액에 침지합니다. 그런 다음 사이클릭 볼트 텔레메트리의 매개변수를 설정하여 전위를 양의 방향으로 0.7 V까지 스윕합니다.

전극을 포도당 용액에서 꺼내 인산염 완충액으로 헹굽니다. 그 다음, 8 mL의 인산염 완충액이 담긴 10 mL 비커에 전극들을 넣고 마그네틱 교반기 위에 배치합니다. GOX 기능화 칩을 작업 전극으로 사용하기 위해 0.6 V로 설정합니다.

원하는 파라미터를 설정한 후, 기저선 기록을 수집하십시오. 버퍼에 포도당 분주액을 첨가하여 각 분주 시마다 포도당 농도를 4mM씩 증가시킵니다. 본 실험에서는 80mM 포도당 분주액 400µL를 버퍼에 첨가합니다. 출력 전류를 각 포도당 농도와 상관시킵니다. 단백질 기능화를 수행하기 위한 표준 곡선을 생성하려면, A-P-D-M-S 내에 포함된 인접한 금 및 ITO 전극이 패턴화된 유리 슬라이드를 사용하십시오.

앞서 설명한 것과 같이, 금 전극에 음극 전위를 가해 티젠(tizen)을 전해 증착시킵니다. 박막을 헹군 후, 티로시나아제(tyrosinase)가 첨가된 청색 형광 표지 auto inducer two synthase 용액을 추가합니다. 이후 상온에서 1시간 동안 배양합니다.

이전과 같이 필름을 PBS로 헹구고, 수신 세포가 포함된 알긴산 증착 용액에 담긴 ITO 전극에 양극 전위를 가합니다. 효소적으로 투과 신호를 생성하기 위해 알긴산 내 세포 집단 공동 증착에 설명된 것과 동일한 단계를 계속 진행합니다. 필름을 헹군 후, 10% LB 배지와 1 mM이 보충된 PBS 및 5 µM SAH 용액을 첨가합니다.

염화칼슘으로 전극을 덮어 용액의 증발을 방지하고 37 °C에서 하룻밤 동안 배양합니다. 이를 통해 적색 형광 단백질 DS red를 생성함으로써 수용 세포의 반응을 확인할 수 있으며, 필터를 조정하여 인듀서 투 신타아제(inducer two synthase)의 청색 형광과 전기 신호로 유도된 수용 세포에서 발현되는 적색 형광을 형광 현미경으로 촬영할 수 있습니다. 가해진 전기 신호는 전극 표면 근처에 국소적인 미세 환경을 조성할 수 있으며, 이러한 자극은 알긴산(alginate) 및 잔탄(xanthan)과 같은 다당류의 자가 조립을 유발하여 전극 표면에 하이드로겔 박막 형태로 증착되게 할 수 있습니다.

이러한 솔-겔 전이는 전극 표면에서 일어나므로, 결과적으로 형성된 박막은 전극 패턴과 기하학적 구조가 일치하도록 전기적으로 주소가 지정됩니다. 알긴산물을 사용하여 서로 다른 주소에 고유한 세포 집단들을 공동 증착시켰습니다. 송신 세포 집단과 수신 세포 집단 간의 상호작용을 통해 이들의 전극 주소 지정에 대한 증거가 관찰됩니다.

분자 auto inducer two는 송신 세포에서 확산되어 수신 세포로 흡수되며, 그 결과 DS red 형광 단백질이 발현됩니다. 여기서 적색 형광은 수신 세포가 지정된 전극에서만 관찰됩니다. 반대로, 바이오센싱 효소인 glucose oxidase는 과산화수소를 생성하는 효소 반응을 통해 포도당을 검출하는 능력을 제공하며, 생성된 과산화수소는 전기화학적으로 산화되어 출력 전류를 생성합니다.

이러한 방식으로 화학적 신호를 전기적 신호로 변환할 수 있습니다. 이 도표는 Geo X가 화학적으로 결합된 필름이 Geo X가 포함되지 않은 필름과 달리 포도당 존재 하에서 강한 antic 신호를 생성함을 보여줍니다. 이러한 결과는 Geo X가 증착된 zam 필름 상에 조립될 수 있으며 촉매 활성을 유지함을 나타냅니다. 또한, 포도당 농도가 증가함에 따라 otic 전류가 단계적으로 증가합니다.

함께 제시된 표준 곡선은 단계적 증가가 첨가된 glucose 양에 따라 거의 선형적인 방식으로 진행되었음을 보여줍니다. 이러한 결과는 효소가 여기에 묘사된 바와 같이 Razza 필름에 접합된 후에도 민감도를 유지함을 나타내며, I two synthase는 Penta tyrosine 태그를 포함합니다. Tyrosinase는 tyrosine 태그에 작용하여 잔기의 phenol 그룹을 o quinone으로 산화시키며, 이는 이후 kazan의 amine에 공유 결합합니다. Tyrosinase 조립에 의한 a i two synthase의 Kazam 필름 기능화 증거는 gold 위의 kaza 필름을 보여주는 이 형광 이미지에서 관찰되며, 여기서 기능화된 I two synthase는 파란색으로 형광 표지되었습니다. a I two synthase는 sender 세포와 동일한 방식으로 기질인 SAH로부터 a I two를 생성하므로, SAH 존재 하에 co-opted receiver 세포와 인접해 있으면 receiver 세포가 ds를 발현하여 형광 반응을 일으키게 합니다.

수신 세포의 붉은색 형광은 ai의 확산으로 인한 주소 간의 상호작용을 다시 한번 입증하며, tizen에 고정된 10가지 효소가 공유 결합 후에도 활성을 유지함을 나타냅니다. 이 영상을 시청한 후, 여러분은 다당류 박막을 전기 증착하는 방법과 다양한 기술을 사용하여 이를 기능화하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다. 당사는 이러한 기능화 단계의 다재다능함을 입증함으로써 향후 테스트에서 수많은 생물학적 구성 요소를 활용할 수 있음을 보여주었습니다.

이 기술을 숙달하면 단 몇 분 만에 정밀하게 생물학적 구성 요소를 접합할 수 있는 명확한 필름 패턴을 생성할 수 있습니다. 이러한 방식으로, 체계적인 절차를 통해 지정된 전극 위에 생물학적으로 패턴화된 활성 표면을 매우 쉽게 생성할 수 있으며, 동시에 복잡한 생물학적 상호작용을 구현할 수 있습니다. 이 절차를 거친 후에는 설계된 상호작용을 달성하기 위해 전극 어레이의 설계와 생물학적 구성 요소의 선택 모두에 창의성을 적용할 수 있습니다.

우리는 바이오 제작 도구가 각각 우리 삶을 혁신해 온 서로 다른 두 분야인 생명공학과 마이크로전자공학의 가교 역할을 하기를 희망합니다. 이 두 분야를 접목함으로써 사회의 가장 시급한 문제들에 대한 새로운 해결책을 창출할 수 있을 것이라 믿습니다. 예를 들어, 바이오 제작이 새로운 감지 방식, 현장 진단(point of care), 질병 진단 및 생물학적·화학적 위협 감지를 위한 단순하고 다각적인 방법들을 제공할 수 있을 것으로 기대합니다.

훨씬 더 먼 미래의 한 가지 예로, 차세대 이후의 동맥 스텐트는 동맥을 개방 상태로 유지할 뿐만 아니라 사용자의 대사 프로필까지 모니터링할 수 있게 될 수도 있습니다.