Name: 선형 증폭 매개 PCR - 알 수없는 측면에서는 DNA의 유전 적 요소와 특성의 현지화 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-06-25T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 58 s
Description: 학습하세요 LAM-PCR을 이용한 바이러스 벡터 유전체 통합 부위 정밀 분석 방법입니다. 이 기술은 유전자 치료의 클론 역학 및 바이오안전성 연구에 필수적인 도구로 활용됩니다.

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기금은 Deutsche Forschungsgemeinschaft (SPP1230, 하이델베르크/만하임 종양센터 보조금), Bundesministerium für Bildung und Forschung (iGene), 유럽연합 집행위원회의 VIth + VIIth Framework Programs (CONSERT, CLINIGENE 및 PERSIST)에 의해 제공되었습니다. 비디오에서 프로토콜 기술을 시연해 주신 Ina Kutschera에게 감사드립니다.

링커 카세트 1. 준비 (LC) <ol><li> LC1 올리고 뉴클레오티드 (표 1), (적절한 제한 효소 오버행 표 1) LC2 올리고, 110 ㎕의 트리스 - 염산 (100 ㎜, 산도 7.5), 10 ㎕의 250 mM의 MgCl2를 40 μL의 40 μl를 섞는다. </li><li> 5 분 95 ° C에서 품어 반응이 실온으로 천천히 냉각 할 수 있습니다. 300 μL의 H 2 O를 추가하고 원심 분리 필터에 dsLinker-DNA를 집중한다. 0.2 PCR 튜브에 준비 링커 카세트의 용출액과 나누어지는 10 μL에 80 μL의 H 2 O를 추가합니다. </li></ol> 벡터 게놈 접합 2. 프리 앰프 <ol><li> 분석 할 수있는 모든 샘플은 50 ㎕의 PCR 반응을 준비합니다. <ol><li> DNA 샘플의 농도를 결정합니다. 피펫은 X μL (1-1,000이 nrLAM에 겨 LAM/100-1, 000 겨) 0.2 ML PCR 튜브에 DNA의. DNA의 양이 각각의 샘플과 RAN에서 동일해야합니다0.5-25 μL의 GE. </li><li> 표 2에 설명 된대로 PCR 마스터 믹스를 준비 믹스 (50 - X). 0.2 ML PCR 튜브에 각각의 DNA 샘플과 마스터 믹스 μL. </li></ol></li><li> PCR을 완료 한 후. 표 2에 예시 된 PCR 조건을 사용하여 프리 앰프를 벡터 게놈 접합 각 PCR 튜브를 다시 실행 PCR 프로그램의 Taq 중합 효소 μL 0.5을 추가합니다. PCR 제품은 -20 ° C에서 최대 4 일 ~ 장기 4 ° C에 저장할 수 있습니다 </li></ol> PCR 제품의 3. 자기 분리 <ol><li> 자석 구슬의 준비 <ol><li> 피펫 (20) 1.5 ML 튜브에 스트렙 타비 딘 코팅 자석 구슬의 μL (200 μg) 및 상온에서 자성 입자 분리기 (MPS)에 1 분간 노출. 상층 액을 버린다. </li><li> MPS에서 튜브를 제거하고 40 ㎕의 PSB / 0.1 % BSA (산도 7.5)에 자석 구슬을 재현 탁. 1 분 동안 MPS에 노출하고 상층 액을 버린다. 일단이 단계를 반복합니다. </li><li> 워시 무선 비즈3 M의 LiCl 용액 20 μL 번째 (3 M LiCl을, 10 mM 트리스 - 염산, 1 ㎜ EDTA)은 1 분 동안 MPS에 노출하고 상층 액을 버린다. 6 M의 LiCl 용액 (6 M LiCl을, 10 mM 트리스 - 염산, 1 ㎜ EDTA)의 50 μL에 재현 탁 구슬. </li></ol></li><li> 준비 자석 구슬의 50 μL와 2.2 단계에서 전체 PCR 반응을 섞는다. 적어도 실온에서 2 시간 동안 수평 진탕 기 (300 RPM)에 품어. 이 단계는 코팅 된 비즈 (구슬 DNA 복합체를) 스트렙 타비 딘에 바이오틴 PCR 제품의 결합을 할 수 있습니다. DNA 구슬 복잡한 하룻밤 진탕 배양 또는 최대 4 일 동안 4 ° C에 저장할 수 있습니다. </li><li> 실온에서 1 분 동안 MPS에 DNA 비드 복잡한 노출, 상층 액을 제거하고 100 μL의 H 2 O의 DNA 비드 복잡한을 재현 탁 즉시 LAM 또는 nrLAM을위한 5 단계에 대해 4 단계를 진행합니다. </li></ol> 4. LAM-절차 <ol><li> 이중 가닥 DNA (dsDNA) 합성 (LAM 전용) <ol><li> 1 분 및 표시에 대한 MPS 단계 3.3에서 DNA 비드 복잡한 노출카드 뜨는. 8.25 H 2 O의 μL, 1 μL 배 hexanucleotide 버퍼 0.25 μL의의 dNTPs (10 ㎜) 0.5 μL (2 U) 클레 나우 중합 효소를 추가합니다. 1 시간 동안 37 ℃에서 배양한다. </li><li> H 2 O의 90 μl를 추가하고 1 분 동안 MPS에 노출. 100 μL의 H 2 O에 뜨는에 resuspend DNA 비드 복잡한 폐기 </li></ol></li><li> 제한 다이제스트 <ol><li> 1 분 동안 MPS에 DNA 비드 복잡한을 노출하고 상층 액을 버린다. 8.5 μL의 H 2 O, 1 ㎕의 10 배 제한 효소 버퍼와 제한 효소의 0.5 μl를 추가하고 1 시간 동안 반응을 품어. 4.1.2 단계를 반복합니다. 참고 : 제한 효소의 제조업체에서 권장하는 온도에서 반응을 품어. 제한 사이트 내에 존재하는 또는 관심의 DNA에 프리 앰프에 사용되는 프라이머 결합 부위의 다운 스트림이 없는지 확인합니다. 적당한 제한 효소 / 제한 효소 조합의 선택을 위해 9를 참조하십시오. </li></ol></li><li> 결찰 DS의 링커 (LK) <ol><li> 1 분 동안 MPS에 DNA 비드 복잡한을 노출하고 상층 액을 버린다. 5 μL의 H 2 O, 1 ㎕의 10 배 FastLink 버퍼, 1 μL의 ATP (10 ㎜), 단계 1.2 ~ 2 μL 링커 카세트, 1 ㎕를 고속 링크 DNA 리가 제 (2 U / μL)를 추가합니다. 5 분 동안 실온에서 배양한다. 4.1.2 단계를 반복합니다. </li></ol></li><li> 신시 dsDNA의 변성 <ol><li> 1 분 동안 MPS에 DNA 비드 복잡한을 노출하고 상층 액을 버린다. 5 ㎕를 0.1 N 수산화 나트륨에 재현 탁 DNA 비드 복잡한. 가로 통에 실온에서 5 분 알을 품다. </li><li> 1 분 동안 MPS에 DNA 비드 복잡한을 노출하고 새로운 1.5 ML 튜브에 뜨는을 포함 증폭 된 벡터 게놈 접합을 수집합니다. 즉시 -20 ℃에서 6 단계 또는 저장 상층 액을 진행 </li></ol></li></ol> 5. nrLAM - 절차 <ol><li> 단일 가닥 링커의 결찰 (SSLC) (nrLAM 만) <ol><li> MPS에 단계 3.3에서 DNA 비드 복잡한 노출1 분 및 폐기 뜨는하십시오. 6.5 μL의 H 2 O를 추가, 1 ㎕의 10 배 반응 버퍼, CircLigase 0.5 ㎕의 MnCl 2 (50 ㎜), 0.5 ATP (1 ㎜) μL, 1 μL의 ssLinker 올리고 0.5 μL의 CircLigase (100 U / μL). 1 시간 동안 60 ° C에서 알을 품다. </li><li> H 2 O의 90 μl를 추가하고 1 분 동안 MPS에 노출. 뜨는을 취소하고 100 μL의 H 2 O의 DNA 비드 복잡한 세척 다시 10 μL의 H 2 O에서 1 분, 폐기 뜨는에 resuspend DNA 비드 복잡한에 대한 MPS에 노출 </li></ol></li></ol> 6. 지수 증폭 I <ol><li> 분석 할 수있는 모든 샘플은 50 ㎕의 PCR 반응을 준비합니다. <ol><li> 피펫 2 μL 템플릿 (단계 4.4.2 (LAM부터) 또는 5.1.2 (nrLAM)) DNA 0.2 ml의 PCR 튜브에. </li><li> 표 3에 설명 된대로 PCR 마스터 믹스를 준비합니다. 단계 6.1.1에서 각각의 샘플에 마스터 믹스 48 μl를 추가하고 PCR 컨디셔닝 시스템에 의해 벡터 게놈 접합을 증폭표 3에 예시 된 NS는. PCR 제품은 -20 ° C에서 최대 4 일 ~ 장기 4 ° C에 저장할 수 있습니다 </li></ol></li></ol> PCR 제품의 7. 자기 분리 <ol><li> 3.1.3 - 3.1.1 단계에 예시 된 바와 같이 자석 구슬을 준비합니다. (LAM에 대한) 20 μL 6 M의 LiCl 용액 (6 M LiCl을, 10 mM 트리스 - 염산, 1 ㎜ EDTA)의 (nrLAM에 대한) 50 μL에 재현 탁 구슬. 20 μL (LAM) 또는 준비 자석 구슬 단계 6.1.2에서 PCR 반응 (단계 7.1) 50 μL (nrLAM)를 혼합하고 실온에서 2 시간 동안 수평 진탕 기 (300 RPM)에 품어. DNA 구슬 복잡한 하룻밤 진탕 배양 또는 최대 4 일 동안 4 ° C에 저장할 수 있습니다. </li><li> 1 분 MPS에 DNA 비드 복잡한 노출, 상층 액을 제거하고 100 μL의 H 2 O의 DNA 비드 복잡한을 재현 탁 1 분 동안 MPS에 DNA 비드 복잡한을 노출하고 상층 액을 버린다. </li><li> 20 μL (LAM) 또는 5 μL (nrLAM) 0.1 N 수산화 나트륨에 재현 탁 DNA 비드 복잡한. 인큐가로 통에 실온에서 10 분 동안 BATE는 1 분 MPS에 노출 새로운 1.5 ML 튜브에서 증폭 된 DNA가 포함 상층 액을 수집합니다. 즉시 -20 ℃에서 8.1 단계 또는 저장 상층 액을 진행 </li></ol> 8. 지수 증폭 II <ol><li> 분석 할 수있는 모든 샘플은 50 ㎕의 PCR 반응을 준비합니다. <ol><li> 0.2 ML PCR 튜브에 (단계 7.3) 피펫 2 μL 템플릿 DNA. </li><li> 표 4에 설명 된대로 PCR 마스터 믹스를 준비합니다. 단계 8.1.1에서 각각의 샘플에 마스터 믹스 48 μl를 추가하고 표 4에 예시 PCR 조건에 벡터 게놈 접합을 증폭. PCR 제품은 최대 4 동안 4 ° C에 저장할 수 있습니다 -20 ° C에서 일 또는 장기 </li></ol></li><li> 시각화 (NR) LAM-PCR 제품, 2 % 아가로 오스 겔상에서 단계 8.1.2의 PCR 생성물의 부하 10 μL. 밴드가 보이지 않는 경우, 고해상도 겔 LAM-PCR 생성물의 10 μl를 분석한다. 주의 : 잇hidium 브로마이드 변이원성이다. 매우 신중하게 작업하고 항상 적절한 장갑을 착용하십시오. </li></ol> 높은 처리량 시퀀싱 9. 준비 <ol><li> (NR) LAM-PCR 제품의 정제 <ol><li> 실내 온도 AMPure XP 자석 구슬의 44 μL와 단계 8.1.2에서 40 ㎕의 PCR-제품을 섞는다. 실온에서 5 분을 품어 추가로 2 분 동안 MPS에 노출. </li><li> 뜨는을 취소하고 MPS에 200 ㎕의 70 % EtOH로 두 번 씻어. </li><li> 30 μL의 H 2 O에 뜨는에 resuspend DNA 비드 복잡한 폐기 신선한 0.2 ML 튜브에 1 분 및 전송 뜨는을 품어. 정제 된 DNA의 농도를 결정합니다. </li></ol></li><li> Fusionprimer PCR은 특정 어댑터를 시퀀싱 추가 할 수 있습니다. <ol><li> 분석 할 수있는 모든 샘플은 50 ㎕의 PCR 반응을 준비합니다. </li><li> 0.2 ML PCR 튜브에 DNA의 피펫 X μL (40 NG). DNA의 양이 각각의 샘플과 0.5-25 μL의 범위에서 동일해야합니다. </li><li> 표 5에 설명 된대로 PCR 마스터 믹스를 준비 추가 (50 - X). 단계 9.2.2에서 각 샘플에 대한 마스터 믹스 ㎕의 표 5 PCR 제품에 예시 PCR 조건에 따라 (NR) LAM-PCR 제품 시퀀싱 어댑터를 소개합니다. -20 ° C에서 최대 4 일 ~ 장기 4 ° C에 저장할 수 있습니다 </li><li> Fusionprimer-PCR 제품 부하에게 2 % 아가 로스 겔상에서 단계 9.2.3의 PCR 생성물의 10 μL를 시각화. 9.1.3 - 9.1.1 단계에 설명 된대로 나머지 PCR 제품을 정화. 정확하게 Fusionprimer-PCR 제품의 농도 및 단편의 크기를 정량화하는 자동화 된 고해상도 전기 영동 장치에 단계 9.4에서 1 ㎕의 정제 된 PCR 생성물을 분석한다. </li></ol></li></ol>

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LAM-PCR 기술은 공지 된 DNA 영역의 측면 불명 DNA 서열을 식별한다. 때문에 공지 된 DNA 서열에 특이 적 프라이머의 혼성화와 접합부의 증폭 량으로 인해 고감도, 그것은 단일 세포 수준까지조차 희귀 접합을 증폭 및 검출 할 수있다. 반대로, 클론 상황에서 LAM-PCR은 하나의 반응에 다른 접합의 수천을 증폭 할 수 있습니다. 그러나, 제한의 사용으로 인해이 integrome 만 하위 성분마다 특정한 제한 효소 접합부의 존재를 LAM-PCR에 의해 분석 할 수있는 효소. 따라서, 다른 효소와 동일한 샘플의 반복 분석은 9를 권장합니다. 제공된 LAM-PCR 증폭 산물은 젤 상에 존재하지 않으면, 가장 가능성이 알려진 DNA 단편의 위치와 선택된 제한 효소의 가장 인식 부위 사이의 거리 LAM-PCR 제품 초래할 너무 커서15.이 경우 다른 효소 접합을 증폭하는 데 사용되어야한다. <p class="jove_conten...

선형 증폭 PCR (LAM-PCR)을 매개하는 모든 근원의 알려진 DNA에 인접한 알 수없는 측면에서는 DNA를 식별하고 특성화 할 수 있습니다. 보다 구체적으로, LAM-PCR은 숙주 게놈 내에서 1,2 (IS) 바이러스 벡터의 삽입 부위를 집중하기 위해 개발되었다. 레트로 바이러스 나 트랜스포존과 같은 유전 적 요소는 (반) 임의의 방식 3-6 호스트 게놈에 자신의 게놈을 통합 할 수 있습니다. 많은 경우에 이러한 벡터가 통합 정확하게 위치를 알고 결정적이다. LAM-PCR은 결찰 매개 PCR 7 및 그 변종 또는 역 PCR 8와 같은 대체 기술에 우수한 것으로 입증되었습니다. 이 방법의 감도와 견고성은 벡터 게놈 접합 증폭 PCR 제품의 자기 선택의 최초의 프리 앰프에서 발생한다. 언급 된 다른 방법과 마찬가지로, LAM-PCR은 9-11의 검색 능력에 편견을 도입, 제한 효소의 사용에 의존한다. 따라서,IS 레퍼토리 (integrome)의 서브 세트 만이 하나의 반응에서 검출 될 수있다. 이 바이어스는 제한 효소 (9)의 최적의 조합을 사용하여 주어진 샘플의 병렬 분석을 통해 최소화된다. 최근 기술의 변형은 제한 효소의 사용을 우회 한 번의 반응 9,12있는 샘플의 공정한 게놈 넓은 해석을 허용하는 LAM-PCR (nrLAM-PCR)이 개발되었다 비 제한 칭했다. 과거에는, LAM-PCR은 원인 레트로 바이러스가 유전자 치료 임상 시험 13 ~ 15에서 몇 환자에서 백혈병에 상승을주고 식별하는 데 사용되었습니다. 그 이후로, LAM-PCR을 식별하기에 적합 한 다른 통합 벡터 (렌티 바이러스 벡터, 트랜스포존) 또한 수동적으로 아데노 - 관련 벡터 (AAV) 또는 인테그라 불량 렌티 바이러스 벡터 (IDLV)와 같은 벡터를 통합하는 통합 패턴을 식별 할 수에서 (16) -21. LAM-PCR의 응용 프로그램은 광범위한 확산되어 기존의LY,이 기술은 널리 유전자 치료를받은 환자에서 유전자 변형 세포의 클론 구성을 공부하거나 통합 문제 15,16,22-24을 탈피하여 새로운 벡터 시스템의 바이오 안전성을 평가하는 데 사용됩니다. 최근, LAM-PCR은 IDLV 트래핑 분석 (25)에 의해 특이 디자이너 클레아의 오프 대상 활동을 결정하는 사용. 또한, LAM-PCR 쉽게 유기체에서 시간이 지남에 형질 세포의 운명을 수행 할 수 있습니다. 이 프로토 암 유전자뿐만 아니라 종양 억제 유전자를 확인하고 또한 조혈 또는 암 줄기 세포 생물학 26-28을 연구 할 수 있습니다. 마지막으로 적어도, LAM-PCR은 인간 29 (및 게시되지 않은 데이터)에 T-세포 수용체의 다양성을 연구하기 위해 적응했다. 기술의 본질적인 힘은 단일 염기 R과 함께 알 수없는 측면에서는 DNA의 수백만의 특성을 허용 깊은 시퀀싱 기술과 방법을 연결하여 강화전체 게놈의 esolution. 다음과 같은 프로토콜에서, 우리는 단계별로 증폭 및 렌티 바이러스 벡터입니다 확인하는 예시 적으로 알 수없는 DNA를 측면에서는 식별을 설명합니다. 프로토콜에 사용 된 올리고 뉴클레오티드. 어떤 소스의 추출 된 DNA 또는 cDNA를이 LAM-PCR 및 nrLAM-PCR을위한 DNA 템플릿으로 이용 될 수는 표 1에 나타내었다.

<table><tbody><tr><td>Taq DNA 중합효소</td><td>Genaxxon Bioscience GmbH</td><td>M3001.5000</td><td>대체 Taq 중합효소 사용 가능</td></tr><tr><td>PCR 완충액</td><td>Qiagen</td><td>201203</td><td>이 완충액의 사용을 권장합니다.</td></tr><tr><td>dNTP-Mixture</td><td>Genaxxon Bioscience GmbH</td><td>M3015.4020</td><td>또는 기타 dNTP</td></tr><tr><td>올리고뉴클레오티드(프라이머)</td><td>MWG Biotech</td><td></td><td>HPLC purified</td></tr><tr><td>Dynabeads M-280 스트렙타비딘&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>11206D</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>14190-086</td><td>0.1% wt/vol BSA</td></tr><tr><td>6 M LiCl</td><td>Roth</td><td>3739.1</td><td>10 mM Tris-HCl (pH 7.5)/1 mM EDTA</td></tr><tr><td>Tris-HCl, pH 7.5</td><td>USB Corporation&nbsp;</td><td>22637</td><td>또는 기타 공급업체</td></tr>, <tr><td>EDTA</td><td>Applichem</td>, <td>A1103,0250</td><td>또는 기타 공급업체</td></tr>, <tr><td>Klenow Polymerase</td>, <td>Roche Diagnostics</td><td>10104523001</td><td></td></tr><tr><td>Hexanucleotide 혼합물</td>, <td>Roche Diagnostics</td><td>11277081001</td><td></td></tr><tr><td>Restriction, endonuclease</td>, <td>NEB</td><td></td><td>또는 기타 공급업체</td></tr>, <tr><td>Fast-Link DNA ligation kit</td><td>진원지 생명 공학</td><td>LK11025</td><td></td></tr><tr><td>CircLigase ssDNA 리가제 키트</td><td>, 진원류 생명 공학</td><td>CL4111K</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>72068</td><td>또는 기타 공급 업체</td></tr><tr><td>Agarose LE</td><td>Roche Diagnostics</td><td>11685660001</td><td>또는 기타 공급 업체</td></tr><tr><td>TBE 완충액</td><td>Amresco</td><td>0658</td><td>또는 기타 공급</td></tr><tr><td>업체 Ethidium bromide</td><td>Applichem</td><td>A2273,0005</td><td>Ethidium bromide는 변이가 가능한</td></tr><tr><td>100 bp DNA Ladder</td><td>Invitrogen</td><td>15628-050</td><td>또는 다른 DNA ladder</td></tr><tr><td>20 mM NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71393-1L</td><td>또는 다른 공급 업체</td></tr><tr><td>Magna-Sep 자기 입자 분리기입니다.</td><td>Life Technologies</td><td>K158501</td><td>1.5 ml 튜브와 함께 사용하기 위해</td></tr><tr><td>Magna-Sep 자기 입자 분리기</td><td>Life Technologies</td><td>K158696</td><td>96-웰 플레이트와 함께 사용하기 위해</td></tr><tr><td>Amicon Ultra-0.5, Ultracel-30 membrane</td><td>Millipore</td><td>UFC503096</td><td></td></tr><tr><td>PerfectBlue Gelsystem Midi S</td><td>PeqLab</td><td>40-1515</td><td>또는 기타 전기영동 시스템과 함께 사용하기 위해&nbsp;</td></tr><tr><td>TProfessional 96</td><td>Biometra</td><td>050-551</td><td>또는 기타 96웰 플레이트용 열순환기</td></tr><tr><td>, 오비탈 쉐이커, KS 260, basic</td><td>, IKA</td><td>2980200</td><td>또는 기타 수평 쉐이커</td></tr>, <tr><td>PCR 소프트튜브, 0.2 ml</td><td>, Biozym Scientific GmbH</td><td>711082</td><td>또는 기타 0.2 ml PCR 튜브</td></tr>, <tr><td>1.5 ml 튜브</td>, <td>Eppendorf</td><td>12682</td><td>또는 기타 1.5 ml 튜브</td></tr><tr><td>, 겔 문서화 시스템</td>, <td>PeqLab</td><td></td><td>또는 다른 젤 문서화 시스템</td></tr><tr><td>Nanodrop ND-1000 분광 광도계</td><td>Thermo Scientific</td><td>ND-1000</td><td></td></tr><tr><td>Spreadex EL1200 프리캐스트 젤</td><td>Elchrom Scientific</td><td>3497</td><td></td></tr><tr><td>수중 젤 전기영동 장치 SEA 2000&nbsp;</td><td>Elchrom Scientific</td><td>2001E</td><td></td></tr><tr><td>2100 전기영동 바이오분석기</td><td>Agilent Technologies</td><td>G2939AA</td><td></td></tr></tbody></table>

선형 증폭 매개 pcr - 알 수없는 측면에서는 dna의 유전 적 요소와 특성의 현지화

Linear Amplification Mediated PCR &#8211; Localization of Genetic Elements and Characterization of Unknown Flanking DNA

Linear-amplification mediated PCR(LAM-PCR)은 통합 벡터 시스템을 사용하여 유전자 요법으로 치료받은 환자의 유전자 교정 세포에서 조혈을 연구하기 위해 개발되었습니다. 레트로바이러스 벡터의 안정적인 통합으로 인해 통합 부위는 개별 세포와 그 자손의 클론 운명을 연구하는 데 사용할 수 있습니다. LAM-PCR은 유전자 치료 환자에서 백혈병이 프로바이러스에 의해 유도된 이웃 원발암유전자의 과발현에서 비롯되었다는 증거를 처음으로 제공했다. inverse PCR 및 ligation mediated (LM)-PCR과 같은 기존 방법에 비해 LAM-PCR의 높은 민감도와 특이도는 biotinylated vector specific primer를 사용하는 초기 사전 증폭 단계(100주기의 선형 PCR)를 통해 달성되며, 이를 통해 후속 반응 단계를 고체상(magnetic beads)에서 수행할 수 있습니다. LAM-PCR은 현재 알려진 DNA에 근접한 알려지지 않은 DNA를 식별하는 데 사용할 수 있는 가장 민감한 방법입니다. 최근에는 제한 소화를 우회하여 통합 부위의 검색 편향을 없애고 숙주 게놈에서 프로바이러스 위치를 종합적으로 분석할 수 있는 LAM-PCR의 변이가 개발되었습니다. 다음 프로토콜은 integrated lentiviral vector에 인접한 3' 및 5' sequence의 증폭을 단계별로 설명합니다.

LAM-PCR 각 접합에 대한 정의 조각의 크기와 벡터 게놈 접합의 증폭 결과. 각각의 PCR 단편의 크기는 게놈 DNA의 공지 된 위치와 가장 가까운 제한 효소 인식 부위 사이의 거리에 의존한다. 이 겔 전기 영동에 의해 분석 샘플 예에서 증폭 접합 다양성을 시각화한다. 단지 단일 (모노클로 날), 몇개 (올리고 클론), 또는 다수의 (폴리 클로 날) 밴드는 겔에 존재하는 경우. LAM-PCR의 결과는 가장 높은 해상도의 전기 영동 젤 (그림 2A)로 볼 수 있습니다뿐만 아니라, 2 % 아가 로스 젤 (그림 2B)에 시각화 할 수 있습니다. nrLAM-PCR은 각각의 접합을위한 다양한 길이의 PCR 단편 발생합니다. 따라서, 단일 클론 올리고 클론 또는 클론 샘플은 전기에 의한 얼룩으로 표시하고 시각적으로 구별 할 수 없습니다. 2 % 아가 로스 겔상에서 nrLAM-PCR 생성물을 떠올리 SUC를 결정하기에 충분하다프로토콜 (그림 2C...

선형 증폭 중재 (LAM)-PCR은 게놈에 바이러스 벡터를 통합의 정확한 위치를 식별하기 위해 개발 된 방법입니다. 이 기술은 유전자 치료 환자 등 새로운 벡터 기술, T-세포의 다양성, 암 줄기 세포 모델의 바이오 안전성에 클론 역학을 공부하는 우수한 방법으로 진화하고있다

선형 증폭 매개 PCR - 알 수없는 측면에서는 DNA의 유전 적 요소와 특성의 현지화

Linear-amplification mediated PCR (LAM-PCR) has been developed to study hematopoiesis in gene corrected cells of patients treated by gene therapy with ...

다음 실험의 전반적인 목표는 게놈 내에서 통합된 바이러스 벡터의 정확한 위치를 식별하는 것입니다. 이는 먼저 비오틴화된 프라이머를 이용한 선형 PCR 반응을 통해 일련의 반응 과정에서 고체상에 있는 게놈 DNA로부터 벡터 게놈 접합 서열을 농축함으로써 수행되며, 생성물 양단에 알려진 DNA 서열을 가진 이중 가닥 DNA를 생성하여 벡터 게놈 접합 부위의 기하급수적 증폭이 가능하게 합니다. 그 다음, 람다(lambda) PCR 생성물에 시퀀싱 어댑터를 결합합니다.딥 시퀀싱을 통해 미지의 플랭킹 DNA를 시퀀싱하고 특성화하기 위해, 이러한 단편들은 벡터 삽입의 정확한 위치를 드러냅니다. 그 결과 겔 전기영동에서 관찰되는 것과 같이 다양하게 증폭된 접합부가 나타납니다. 이 방법은 임상 유전자 치료 환자의 바이러스 벡터 삽입 부위 분포에 대한 통찰을 제공합니다.이는 삽입 돌연변이 유발, 스크리닝, 바이러스 감염, 암, 그리고 줄기세포 클론성 또는 T-세포 다양성과 같은 다른 연구에도 적용될 수 있습니다. 해당 절차는 저희 실험실의 기술자인 ina RA가 시연하겠습니다. 이 절차를 위해, 먼저 링커 카세트를 준비합니다. 마이크로 원심분리 튜브에 두 종류의 LCO Lego 각 40 µL와 tris hydrochloride 110 µL, 그리고 magnesium chloride 10 µL를 혼합하십시오. 다음으로, 혼합물을 95 °C 히팅 블록에서 5분 동안 인큐베이션한 후, 하룻밤 동안 실온으로 천천히 냉각시킵니다.다음 날, 준비된 이중 가닥 링커 DNA에 300 µL의 물을 추가하고 마이크로 원심분리 튜브를 통해 여과합니다. 필터를 원심분리하여 농축된 링커 DNA를 하단부(ouit)에 수집합니다. 그다음, 필터에서 하단부(ouit)를 회수합니다.물 80 µL를 추가한 후 파이펫팅합니다. PCR 튜브에 10 µL씩 분주합니다. lamb을 위해 50 µL 반응 튜브에서 PCR을 사용하여 벡터 게놈 접합부를 사전 증폭합니다.반응당 50 µL마다 1 ng에서 1 µg 사이의 샘플 DNA를 첨가하십시오. NR lamb의 경우, 최소 100 ng의 DNA를 사용하십시오. 25 µL 이상 첨가하지 마십시오. 본문의 표 2에 따라 PCR을 수행하십시오.완료되면, 각 반응물에 0.5 µL의 tech를 추가로 넣고 PCR 프로그램을 두 번째로 실행합니다. 먼저, 자기 비드를 준비합니다. 1.5 mL 튜브에 strept ENC 코팅 자기 비드 20 µL를 넣고 상온에서 1분 동안 자기 비드 분리기에 둡니다.그 후 상청액을 제거합니다. BSA가 포함된 PBS 40 µL에 비드를 현탁시킨 후, 비드를 다시 분리기에 넣고 1분 동안 유지합니다. 상청액을 3 M 염화리튬 용액 20 µL로 교체하여 세척합니다.다시 한번, 비즈를 분리기에 올려 1분 동안 둡니다. 상층액을 50 µL의 6 M 염화리튬 용액으로 교체하여 마무리합니다. 이제 자성 비즈 혼합물을 PCR 반응 생성물에 첨가하고, 이 혼합물을 실온에서 부드럽게 흔들어주며 2시간에서 하룻밤 동안 배양합니다.비오틴화된 DNA와 스트립 타바 및 코팅된 비드는 복합체를 형성하며, 이는 4°C에서 최대 4일 동안 보관할 수 있습니다. 높은 민감도로 인해 lamb 또는 NR lamb으로 진행하십시오. L-A-M-P-C-R은 주의 깊게 수행하지 않을 경우 오염되기 쉽습니다.이는 PCR 등급의 환경입니다. 특히 청결함에 각별한 주의를 기울이는 것이 매우 중요합니다. 샘플을 오염시키지 않고 미지의 플랭킹(flanking) DNA를 성공적으로 증폭시키기 위해, 먼저 복합체를 분리기에 1분 동안 노출시킨 후 DNA 비드를 100 µL의 물에 재현탁하십시오.다음으로, 복합체를 분리기에 1분 동안 노출시킵니다. 그리고 이번에는 8.25 µL의 물, 1 µL의 HEXA 뉴클레오타이드 완충액, 0.25 µL의 D DN NTPs, 그리고 0.5 µL의 cano polymerase 혼합액에 DNA 비드 복합체를 재현탁합니다.이 혼합물을 37 °C에서 1시간 동안 배양하십시오. 그 다음 90 µL의 물을 추가하고 반응물을 분리기에 1분 더 노출시키십시오. 이어서 DNA 비드 복합체를 100 µL의 세척용 물에 다시 부유시키십시오.분리기(separator)를 1분 더 사용하고 제한 효소 반응을 준비합니다. 상층액을 제거한 후, 8.5 µL의 물, 1 µL의 제한 효소 버퍼, 그리고 0.5 µL의 제한 효소를 첨가합니다.제한 효소를 선택할 때, preem 증폭 반응에 사용된 프라이머 결합 부위 내부 또는 하류에 해당 효소의 인식 부위가 없는지 확인하십시오. 최적 온도에서 효소를 1시간 동안 반응시킨 후, 90 µL의 물을 첨가합니다. 분리기를 사용하여 1분 동안 처리하고, 100 µL의 세척용 물에 BDNA 복합체를 재현탁합니다.분리를 반복하고 라이게이션 반응을 준비합니다. 비드에 5 µL의 물, 1 µL의 10 x fast link buffer를 첨가합니다. 1 µL의 TP, 1 µL의 fast link DNA ligase, 그리고 과정 시작 단계에서 제작한 1 µL의 링커 카세트를 추가합니다.이 반응을 상온에서 5분 동안 진행합니다. 90 µL의 물을 첨가하고 비드를 분리하여 반응을 종료시킨 후, 100 µL의 물로 세척합니다. 그다음 합성된 DNA를 변성시키기 위해 다시 한번 분리 과정을 거친 후, 비드를 5 µL의 0.1 N 수산화나트륨에 재현탁시키고 혼합물을 상온에서 5분 동안 흔들어 줍니다.그다음 복합체를 1분 동안 분리하고, 사전 증폭된 벡터 게놈 접합부가 포함된 SUP 상층액을 수집합니다. 즉시 지수 증폭을 진행하거나 -20 °C에서 보관하십시오. 분리기를 사용하여 복합체를 1분간 노출시키는 것으로 시작합니다.DNA 비즈를 100 µL의 물에 현탁하여 재현탁합니다. 비즈를 다시 분리하고 상층액을 제거합니다. 라이게이션 반응을 위해 6.5 µL의 물, 1 µL의 circ Ligase, 10x 반응 버퍼를 추가합니다.염화마그네슘 0.5 µL, TP 0.5 µL, SS 링커 올리고뉴클레오타이드 1 µL, 그리고 cir ligase 0.5 µL를 첨가합니다. 60 °C에서 1시간 동안 반응시킨 후, 물 90 µL를 이용하여 반응을 종료합니다. 비드 분리기(bead separator) Resus를 사용하여 비드를 분리하고, 다른 100 µL의 세척액에 비드를 현탁시킨 후, 분리기를 다시 사용하여 세척된 복합체를 물 10 µL에 수집합니다. 본문의 표 3에 기술된 대로 PCR 마스터 믹스를 준비하는 것으로 시작하십시오.200 µL PCR 튜브에 48 µL의 마스터 믹스를 lamb 또는 NR lamb 생성물 2 µL에 첨가하고, 앞서 텍스트에서 설명한 대로 PCR을 수행한다. 추가로 streptin 비드를 준비하고 이를 6 M 염화 리튬(lithium chloride)에 재현탁한다. lamb의 경우 20 µL, NR lamb의 경우 50 µL를 사용한다. 그 후, PCR 반응 생성물과 동일한 부피의 비드를 첨가하고, 쉐이커에서 300 RPM으로 실온에서 2시간에서 하룻밤 동안 배양한다. DNA-비드 복합체를 수집하고, 이전에 입증된 방식대로 100 µL의 물로 세척한다.이제, 0.1 normal 수산화나트륨에 복합체를 현탁시키고 쉐이커 위에서 실온으로 10분 동안 비즈를 배양합니다. 그런 다음 비즈를 분리기에 1분 동안 노출시키고, 증폭된 DNA가 포함된 상층액을 새 튜브에 수집합니다. 증폭된 DNA를 템플릿으로 사용하여, 본문의 표 4에 기술된 대로 2 µL를 사용하여 PCR을 수행합니다.제품을 정제하기 위해 젤 전기영동으로 제품을 시각화합니다. 제품 40 µL를 실온의 am pure XP magnetic beads 44 µL와 혼합하고 5분 동안 배양합니다. 그 후 자석을 이용하여 구슬을 2분 동안 분리합니다.상층액을 제거한 후, 200 µL의 70% ethanol을 사용하여 비드를 두 번 세척합니다. 그런 다음 40 ng의 DNAA 융합 프라이머를 사용하여 비드와 30 µL의 물을 재현탁합니다. 시퀀싱 전용 어댑터를 추가하기 위해 PCR을 사용할 수 있습니다. 세부 사항은 표 5에 제시되어 있습니다.겔에서 생성물을 확인합니다. 고해상도 겔 전기영동으로 lamb PCR 결과를 관찰하는 것이 비교 분석을 통한 진단법으로 가장 적합한 선택입니다. 2% agarose 또한 가능하지만, 효율이 떨어집니다.NR LAMB의 클론성 및 PCR 산물은 육안으로 진단할 수 없습니다. 하지만 프로토콜의 성공 여부를 판단하는 데에는 2% agarose 젤만으로도 충분합니다. PCR 산물을 시퀀싱하면 호스트 게놈 내 벡터의 위치를 찾을 수 있습니다.이 데이터를 통해 코딩 영역 및 전사 시작 부위 근처의 삽입 부위 위치를 기록하는 것이 가능합니다. 이 기술의 개발은 유전자 치료 분야의 연구자들이 전임상 모델과 임상 유전자 치료 시험 모두에서 유전자 전달 벡터의 생물학적 안전성을 탐구할 수 있는 길을 열어주었습니다.

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연구

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생물학

관련된 염색체 트랩 (ACT) 분석은 장거리 DNA 상호 작용을 확인하는 소설 편견 방법입니다. 장거리 DNA 상호 작용의 특성은 우리가 정상적인 생리 모두와 질병 상태에서 유전자 발현에 핵 건축의 관계를 확인할 수 있습니다.

장거리 DNA의 상호 작용을 확인을위한 관련 염색체 트랩

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Oligonucleotide - 결합 형광등 Microspheres를 사용하여 복잡한 임상 및 환경 샘플에서 박테리아의 멀티 플렉스 감지

이 동영상은 단백질과 단백질의 상호작용을 평가하기 위한 BiFC-PALM(광활성화 국소화 현미경과 이분자 형광 보완법의 조합)에 대해 설명합니다. BiFC는 두 개의 형광 단백질 단편과 두 개의 상호 작용하는 관심 단백질의 융합을 포함합니다. 두 단백질이 상호 작용할 때 단편이 근접하게 되어 두 부분이 함께 모여 기능적 형광 단백질을 재구성할 수 있습니다. 단일 형광단의 형광은 PALM에 의해 세포 내부의 단일 분자 수준에서 국한됩니다.

Bimolecular Fluorescence Complementation-Coupled Photoactivated Localization Microscopy

염색체 페인팅은 세포 핵의 조직과 카요타입의 진화를 연구하는 데 유용한 방법입니다. 여기서, 우리는 이후 시상 혼성화(FISH)에서 2차원 및 3차원 형광에 사용되는 단일 폴리텐 염색체로부터 관심 있는 특정 영역을 분리하고 증폭시키는 접근법을 시연한다.

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여기에 우리가 존재 바이오 입자의 수​​집을위한 최적화하고 효율적인 제거 전략을 설명 한 번에 5 ㎕를 마이크로 볼륨 용해 / STR 증폭을 포함하는 향상된 증폭 프로토콜과 함께, 샘플 'DNA 터치'를,의 회복을 허용하는 짧은 탠덤 반복 (STR) 바이오 입자 기증자 (들)의 프로필.

법의학 &#39;터치 DNA&#39;증거에서 간체 미세 조작술에 의해 복구 된 단일 인간 Bioparticles의 향상된 유전자 분석

단백질-단백질 상호 작용은 BiFC(bimolecular fluorescence complementation)와 PALM(photoactivated localization microscopy)을 결합하여 나노미터 공간 해상도로 세포에서 시각화됩니다. 여기에서는 개별 Ras-Raf 복합체의 나노 스케일 클러스터링 및 확산을 시각화하기 위해 U2OS 세포에서 Ras-Raf 상호 작용을 이미징하기 위해 BiFC-PALM을 사용하는 방법에 대해 설명합니다.

이분자 형광 보완과 광 활성화 현지화 현미경 (BiFC-PALM)

감염된 세포의 게놈 DNA에서 레트로바이러스 통합 부위를 증폭하고, 증폭된 바이러스-숙주 접합부를 염기서열분석한 다음, 이러한 염기서열을 참조 게놈에 매핑하는 프로토콜을 설명합니다. 또한 BEDTools를 사용하여 다양한 게놈 주석과 관련된 통합 부위의 분포를 정량화하는 기술에 대해서도 설명합니다.

레트로 바이러스 통합 사이트의 증폭, 차세대 시퀀싱 및 게놈 DNA 매핑

여기, 비 코딩 DNA 요소의 transposon 중재 무작위 삽입의 힘의 최적의 염색체 위치를 해결 하기 위해 사용 되었다.

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여기, 우리는 정확 하 게 계량 드롭 ddPCR 독특한 가수분해 프로브 쌍을 사용 하 여 단일 반응에서 대상 지역의 여러 유전 변경 하는 프로토콜을 제시.

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여기서 우리는 상피 세포 DNA에서 VNTR 궤적 D1S80을 증폭하여 DNA 지문 프로파일을 생성하는 간단한 프로토콜을 설명합니다.

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학습하세요 LAM-PCR을 이용한 바이러스 벡터 유전체 통합 부위 정밀 분석 방법입니다. 이 기술은 유전자 치료의 클론 역학 및 바이오안전성 연구에 필수적인 도구로 활용됩니다.

선형 증폭 매개 PCR - 알 수없는 측면에서는 DNA의 유전 적 요소와 특성의 현지화

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