선형 증폭 매개 PCR - 알 수없는 측면에서는 DNA의 유전 적 요소와 특성의 현지화

다음 실험의 전반적인 목표는 게놈에서 바이러스 벡터를 통합하는 정확한 위치를 식별하는 것입니다. 이는 고체상의 게놈 DNA에서 벡터 게놈 접합 염기서열을 농축하기 위해 비오틴화된 프라이머를 사용한 초기 선형 PCR 반응에 의해 달성되며, 일련의 반응에서 제품의 양쪽 말단에 알려진 DNA 염기서열이 있는 이중 가닥 DNA가 생성되어 벡터 게놈 접합의 기하급수적인 증폭이 가능합니다. 다음으로 염기서열분석 어댑터(sequencing adapter)가 양고기 PCR 산물에 통합됩니다.

심층 염기서열분석을 통해 알려지지 않은 측면 DNA를 염기서열분석하고 특성화하기 위해 이러한 단편은 벡터 통합의 정확한 위치를 보여줍니다. 그 결과 겔 전기영동에 의해 보이는 다양한 증폭된 접합부가 나타납니다. 이 방법은 임상 유전자 치료 환자의 바이러스 벡터 통합 부위 분포에 대한 통찰력을 제공합니다.

또한 삽입, 돌연변이 유발, 스크리닝, 바이러스 감염, 암, 줄기세포 클론성 또는 T세포 다양성과 같은 다른 연구에도 적용할 수 있습니다. 이 절차는 제 연구실의 기술자인 ina RA가 시연할 것입니다.이 절차를 위해 먼저 마이크로 원심분리기 튜브에 두 개의 LCO Legos 각각을 40마이크로리터의 트리스 하이드로클로라이드 및 10마이크로리터의 염화마그네슘을 혼합하는 링커 카세트를 준비합니다. 다음으로, 혼합물을 섭씨 95도의 열 블록에서 5분 동안 배양한 다음 밤새 실온으로 천천히 식힙니다.

다음날, 준비된 이중 가닥 링커, DNA에 300마이크로리터의 물을 넣고 마이크로 원심분리기 튜브에 여과합니다. 필터를 스핀다운하여 ouit에 농축된 링커 DNA를 수집합니다. 그런 다음 필터에서 아웃을 복구합니다.

80마이크로리터의 물을 오일과 피펫에 추가합니다. 10마이크로리터 분취액을 PCR 튜브에 넣습니다. PCR을 사용하여 양고기용 50마이크로리터 반응 튜브에서 벡터 게놈 접합을 사전 증폭합니다.

50마이크로리터 반응당 1나노그램에서 1마이크로그램 사이의 샘플 DNA를 추가합니다. NR 양고기의 경우 최소 100나노그램의 DNA를 사용하십시오. 25 마이크로 리터 이상을 추가하지 마십시오 텍스트의 표 2에 따라 PCR을 실행하십시오.

그리고 완료되면 각 반응에 0.5마이크로리터의 기술을 추가하고 PCR 프로그램을 두 번째로 실행합니다. 먼저 마그네틱 비드를 준비합니다. 1.5ml 튜브에 20마이크로리터의 스트렙트 ENC 코팅 마그네틱 비드를 추가하고 실온에서 1분 동안 마그네틱 비드 분리기에 올려 놓습니다.

그런 다음 상등액 상승을 폐기합니다. BSA를 사용하여 40마이크로리터의 PBS에 비드를 매달고 1분 더 동안 비드를 분리기에 다시 놓습니다. 상층액을 3 몰 리튬 클로라이드 용액의 20 마이크로 리터 세척으로 교체하십시오.

그리고 다시, 1분 동안 분리기에 구슬을 올려 놓습니다. 상등액을 50마이크로리터의 6몰 리튬 염화물 용액으로 교체하여 마무리합니다. 이제 PCR 반응 생성물에 마그네틱 비드 믹스를 첨가하고 이 혼합물을 부드러운 쉐이킹으로 실온에서 2시간에서 하룻밤 동안 배양합니다.

비오틴화된 DNA와 스트립 타바 및 코팅된 비드는 최대 4일 동안 섭씨 4도에서 보관할 수 있는 복합체를 형성합니다. 양고기 또는 NR 양고기로 진행 감도가 높기 때문입니다. L-A-M-P-C-R은 주의 깊게 실행하면 오염되기 쉽습니다.

PCR 등급의 환경입니다. 그리고 청결에 대한 특별한 관심은 가장 중요합니다. 샘플을 오염시키지 않고 알려지지 않은 측면 DNA를 성공적으로 증폭하려면 먼저 복합체를 분리기에 1분 동안 노출시키고 DNA 비드를 100마이크로리터의 물에 현탁시킵니다.

다음으로, 복합체를 분리기에 1분 동안 노출시킵니다. 그리고 이번에는 DNA 비드 복합체를 8.25 마이크로 리터의 물과 혼합하여 재현탁시킵니다. 1마이크로리터의 HEXA 뉴클레오티드 완충액, 1/4마이크로리터의 D DN NTP, 1/2마이크로리터의 카노 중합효소.

이 혼합물을 섭씨 37도에서 한 시간 동안 배양합니다. 그런 다음 90마이크로리터의 물을 넣고 반응을 분리기에 1분 더 노출시킵니다. 그런 다음 DNA 비드 복합체를 100마이크로리터의 물에 재현탁합니다.

분리기를 1분 더 사용하고 제한 효소 반응을 준비합니다. 상층액을 제거한 후. 물 8.5마이크로리터, 제한 효소 완충액 1마이크로리터, 제한 효소 1/2마이크로리터를 추가합니다.

제한 효소를 선택할 때 preem 증폭 반응에 사용되는 primal 결합 부위 내부 또는 다운스트림에 부위가 없는지 확인하십시오. 효소가 이상적인 온도에서 한 시간 동안 반응하도록 한 후 90마이크로리터의 물을 추가합니다. 분리기를 1분 동안 사용하고 BDNA 복합체를 100마이크로리터의 물로 세척하여 다시 현탁시킵니다.

분리를 반복하고 결찰 반응을 준비합니다. 비드에 5마이크로리터의 물, 1마이크로리터의 10 x 패스트 링크 버퍼를 추가합니다. 1마이크로리터의 TP, 1마이크로리터의 패스트 링크 DNA 리가제, 그리고 1마이크로리터의 링커 카세트를 시술 시작 시 만들었다.

이 반응을 실온에서 5분 동안 실행하도록 합니다. 90마이크로리터의 물을 넣고 비드를 분리한 다음 100마이크로리터의 물로 세척하여 반응을 종료합니다. 그런 다음 합성 된 DNA를 변성시키기 위해 또 다른 분리를 통해 0.1 일반 수산화 나트륨 5 마이크로 리터에 비드를 재현탁시키고 혼합물을 실온에서 5 분 동안 흔들어 둡니다.

그런 다음 1분 동안 복합체를 분리하고 preem 증폭 벡터 게놈 접합을 포함하는 SUP natin을 수집합니다. 즉시 지수 증폭을 진행하거나 섭씨 영하 20도에서 보관하십시오. 단지를 분리기에 잠시 노출시키는 것으로 시작합니다.

그리고 DNA 구슬을 100 마이크로 리터의 물에 현탁시키는 것을 반복한다. 그리고 다시 분리하여 상층액을 제거하십시오. 결찰 반응을 위해 6.5 μl의 물, 1 microliter의 circ Ligase, 10 x 반응 완충액을 추가합니다.

염화마그네슘 반 마이크로리터, TP 반 마이크로리터, SS 링커 올리고 1마이크로리터, cir 리가제 반 마이크로리터. 섭씨 60도에서 한 시간 후 비드 분리기 Resus를 사용하여 90마이크로리터의 물로 반응을 종료하고 비드를 100마이크로리터에 현탁시킨 다음 분리기를 다시 사용하여 10마이크로리터의 물에 세척 복합체를 수집합니다. 본문의 표 3에 설명된 대로 PCR 마스터 믹스를 준비하는 것으로 시작합니다.

200 마이크로 리터 PCR 튜브에 2 마이크로 리터의 양고기 또는 NR 양고기 제품에 48 마이크로 리터의 마스터 믹스를 추가하고 이전과 같이 텍스트에 설명 된대로 PCR을 실행하고 비드에 더 많은 스트렙을 준비하고 6 개의 몰 리튬 클로라이드에 재현탁합니다. 양고기의 경우 20마이크로리터, NR 양고기의 경우 50마이크로리터를 사용합니다. 그런 다음 동일한 부피의 PCR 반응 산물에 비드를 첨가하고 300RPM의 셰이커에서 실온에서 2시간 동안 하룻밤 동안 배양한 후 DNA 비드 복합체를 수집하고 이전에 설명한 바와 같이 100마이크로리터의 물로 세척합니다.

이제 0.1 일반 수산화나트륨에 복합체를 현탁시키고 쉐이커에서 실온에서 10분 동안 비드를 배양합니다. 그런 다음 비드를 분리기에 1분 동안 노출시키고 증폭된 DNA를 포함하는 상등액을 새 튜브에 수집합니다. 증폭된 DNA를 주형으로 사용하여, 원본의 표 4에서 기술된 대로 PCR를 실행하기 위하여 그것의 2 마이크로리터를 이용하십시오.

제품을 순화하기 위하여 젤 전기 이동법으로 제품을 구상하십시오. 40 마이크로 리터를 44 마이크로 리터의 실온 am pure XP 마그네틱 비드와 혼합하고 5 분 동안 배양합니다. 그런 다음 자석에서 2분 동안 구슬을 분리합니다.

상등액을 제거한 후 200마이크로리터의 70%에탄올을 사용하여 비드를 두 번 세척한 다음 40나노그램의 DNAA 융합 프라이머를 사용하여 비드와 30마이크로리터의 물을 재현탁합니다. PCR은 염기서열분석 특정 어댑터를 추가하는 데 사용할 수 있습니다. 자세한 내용은 표 5에 나와 있습니다.

젤에 있는 제품을 확인하십시오. 고분해능 겔 전기영동에 의한 lamb PCR의 결과를 보는 것은 비교를 통한 진단 분석의 최선의 선택입니다. 2%aros도 작동하지만 잘 작동하지 않습니다.

NR LAMB, PCR 제품의 클론성은 육안으로 진단할 수 없습니다. 그러나 2%agros gel은 프로토콜의 성공 여부를 결정하기에 완벽하게 충분합니다. PCR 산물을 염기서열분석한 후 벡터의 위치를 숙주 게놈에서 찾을 수 있습니다.

이 데이터로부터, 코딩 영역에서의 삽입 부위 위치를 로그화할 수 있으며, 개발 후 전사 시작 부위에 가깝습니다. 이 기술은 유전자 치료 분야의 연구자들이 전임상 모델과 임상 유전자 치료 시험 모두에서 유전자 전달 벡터의 생물학적 안전성을 탐구할 수 있는 길을 열었습니다.