선형 증폭 매개 PCR - 알 수없는 측면에서는 DNA의 유전 적 요소와 특성의 현지화

다음 실험의 전반적인 목표는 게놈 내에서 통합된 바이러스 벡터의 정확한 위치를 식별하는 것입니다. 이는 먼저 비오틴화된 프라이머를 이용한 선형 PCR 반응을 통해 일련의 반응 과정에서 고체상에 있는 게놈 DNA로부터 벡터 게놈 접합 서열을 농축함으로써 수행되며, 생성물 양단에 알려진 DNA 서열을 가진 이중 가닥 DNA를 생성하여 벡터 게놈 접합 부위의 기하급수적 증폭이 가능하게 합니다. 그 다음, 람다(lambda) PCR 생성물에 시퀀싱 어댑터를 결합합니다.

딥 시퀀싱을 통해 미지의 플랭킹 DNA를 시퀀싱하고 특성화하기 위해, 이러한 단편들은 벡터 삽입의 정확한 위치를 드러냅니다. 그 결과 겔 전기영동에서 관찰되는 것과 같이 다양하게 증폭된 접합부가 나타납니다. 이 방법은 임상 유전자 치료 환자의 바이러스 벡터 삽입 부위 분포에 대한 통찰을 제공합니다.

이는 삽입 돌연변이 유발, 스크리닝, 바이러스 감염, 암, 그리고 줄기세포 클론성 또는 T-세포 다양성과 같은 다른 연구에도 적용될 수 있습니다. 해당 절차는 저희 실험실의 기술자인 ina RA가 시연하겠습니다. 이 절차를 위해, 먼저 링커 카세트를 준비합니다. 마이크로 원심분리 튜브에 두 종류의 LCO Lego 각 40 µL와 tris hydrochloride 110 µL, 그리고 magnesium chloride 10 µL를 혼합하십시오. 다음으로, 혼합물을 95 °C 히팅 블록에서 5분 동안 인큐베이션한 후, 하룻밤 동안 실온으로 천천히 냉각시킵니다.

다음 날, 준비된 이중 가닥 링커 DNA에 300 µL의 물을 추가하고 마이크로 원심분리 튜브를 통해 여과합니다. 필터를 원심분리하여 농축된 링커 DNA를 하단부(ouit)에 수집합니다. 그다음, 필터에서 하단부(ouit)를 회수합니다.

물 80 µL를 추가한 후 파이펫팅합니다. PCR 튜브에 10 µL씩 분주합니다. lamb을 위해 50 µL 반응 튜브에서 PCR을 사용하여 벡터 게놈 접합부를 사전 증폭합니다.

반응당 50 µL마다 1 ng에서 1 µg 사이의 샘플 DNA를 첨가하십시오. NR lamb의 경우, 최소 100 ng의 DNA를 사용하십시오. 25 µL 이상 첨가하지 마십시오. 본문의 표 2에 따라 PCR을 수행하십시오.

완료되면, 각 반응물에 0.5 µL의 tech를 추가로 넣고 PCR 프로그램을 두 번째로 실행합니다. 먼저, 자기 비드를 준비합니다. 1.5 mL 튜브에 strept ENC 코팅 자기 비드 20 µL를 넣고 상온에서 1분 동안 자기 비드 분리기에 둡니다.

그 후 상청액을 제거합니다. BSA가 포함된 PBS 40 µL에 비드를 현탁시킨 후, 비드를 다시 분리기에 넣고 1분 동안 유지합니다. 상청액을 3 M 염화리튬 용액 20 µL로 교체하여 세척합니다.

다시 한번, 비즈를 분리기에 올려 1분 동안 둡니다. 상층액을 50 µL의 6 M 염화리튬 용액으로 교체하여 마무리합니다. 이제 자성 비즈 혼합물을 PCR 반응 생성물에 첨가하고, 이 혼합물을 실온에서 부드럽게 흔들어주며 2시간에서 하룻밤 동안 배양합니다.

비오틴화된 DNA와 스트립 타바 및 코팅된 비드는 복합체를 형성하며, 이는 4°C에서 최대 4일 동안 보관할 수 있습니다. 높은 민감도로 인해 lamb 또는 NR lamb으로 진행하십시오. L-A-M-P-C-R은 주의 깊게 수행하지 않을 경우 오염되기 쉽습니다.

이는 PCR 등급의 환경입니다. 특히 청결함에 각별한 주의를 기울이는 것이 매우 중요합니다. 샘플을 오염시키지 않고 미지의 플랭킹(flanking) DNA를 성공적으로 증폭시키기 위해, 먼저 복합체를 분리기에 1분 동안 노출시킨 후 DNA 비드를 100 µL의 물에 재현탁하십시오.

다음으로, 복합체를 분리기에 1분 동안 노출시킵니다. 그리고 이번에는 8.25 µL의 물, 1 µL의 HEXA 뉴클레오타이드 완충액, 0.25 µL의 D DN NTPs, 그리고 0.5 µL의 cano polymerase 혼합액에 DNA 비드 복합체를 재현탁합니다.

이 혼합물을 37 °C에서 1시간 동안 배양하십시오. 그 다음 90 µL의 물을 추가하고 반응물을 분리기에 1분 더 노출시키십시오. 이어서 DNA 비드 복합체를 100 µL의 세척용 물에 다시 부유시키십시오.

분리기(separator)를 1분 더 사용하고 제한 효소 반응을 준비합니다. 상층액을 제거한 후, 8.5 µL의 물, 1 µL의 제한 효소 버퍼, 그리고 0.5 µL의 제한 효소를 첨가합니다.

제한 효소를 선택할 때, preem 증폭 반응에 사용된 프라이머 결합 부위 내부 또는 하류에 해당 효소의 인식 부위가 없는지 확인하십시오. 최적 온도에서 효소를 1시간 동안 반응시킨 후, 90 µL의 물을 첨가합니다. 분리기를 사용하여 1분 동안 처리하고, 100 µL의 세척용 물에 BDNA 복합체를 재현탁합니다.

분리를 반복하고 라이게이션 반응을 준비합니다. 비드에 5 µL의 물, 1 µL의 10 x fast link buffer를 첨가합니다. 1 µL의 TP, 1 µL의 fast link DNA ligase, 그리고 과정 시작 단계에서 제작한 1 µL의 링커 카세트를 추가합니다.

이 반응을 상온에서 5분 동안 진행합니다. 90 µL의 물을 첨가하고 비드를 분리하여 반응을 종료시킨 후, 100 µL의 물로 세척합니다. 그다음 합성된 DNA를 변성시키기 위해 다시 한번 분리 과정을 거친 후, 비드를 5 µL의 0.1 N 수산화나트륨에 재현탁시키고 혼합물을 상온에서 5분 동안 흔들어 줍니다.

그다음 복합체를 1분 동안 분리하고, 사전 증폭된 벡터 게놈 접합부가 포함된 SUP 상층액을 수집합니다. 즉시 지수 증폭을 진행하거나 -20 °C에서 보관하십시오. 분리기를 사용하여 복합체를 1분간 노출시키는 것으로 시작합니다.

DNA 비즈를 100 µL의 물에 현탁하여 재현탁합니다. 비즈를 다시 분리하고 상층액을 제거합니다. 라이게이션 반응을 위해 6.5 µL의 물, 1 µL의 circ Ligase, 10x 반응 버퍼를 추가합니다.

염화마그네슘 0.5 µL, TP 0.5 µL, SS 링커 올리고뉴클레오타이드 1 µL, 그리고 cir ligase 0.5 µL를 첨가합니다. 60 °C에서 1시간 동안 반응시킨 후, 물 90 µL를 이용하여 반응을 종료합니다. 비드 분리기(bead separator) Resus를 사용하여 비드를 분리하고, 다른 100 µL의 세척액에 비드를 현탁시킨 후, 분리기를 다시 사용하여 세척된 복합체를 물 10 µL에 수집합니다. 본문의 표 3에 기술된 대로 PCR 마스터 믹스를 준비하는 것으로 시작하십시오.

200 µL PCR 튜브에 48 µL의 마스터 믹스를 lamb 또는 NR lamb 생성물 2 µL에 첨가하고, 앞서 텍스트에서 설명한 대로 PCR을 수행한다. 추가로 streptin 비드를 준비하고 이를 6 M 염화 리튬(lithium chloride)에 재현탁한다. lamb의 경우 20 µL, NR lamb의 경우 50 µL를 사용한다. 그 후, PCR 반응 생성물과 동일한 부피의 비드를 첨가하고, 쉐이커에서 300 RPM으로 실온에서 2시간에서 하룻밤 동안 배양한다. DNA-비드 복합체를 수집하고, 이전에 입증된 방식대로 100 µL의 물로 세척한다.

이제, 0.1 normal 수산화나트륨에 복합체를 현탁시키고 쉐이커 위에서 실온으로 10분 동안 비즈를 배양합니다. 그런 다음 비즈를 분리기에 1분 동안 노출시키고, 증폭된 DNA가 포함된 상층액을 새 튜브에 수집합니다. 증폭된 DNA를 템플릿으로 사용하여, 본문의 표 4에 기술된 대로 2 µL를 사용하여 PCR을 수행합니다.

제품을 정제하기 위해 젤 전기영동으로 제품을 시각화합니다. 제품 40 µL를 실온의 am pure XP magnetic beads 44 µL와 혼합하고 5분 동안 배양합니다. 그 후 자석을 이용하여 구슬을 2분 동안 분리합니다.

상층액을 제거한 후, 200 µL의 70% ethanol을 사용하여 비드를 두 번 세척합니다. 그런 다음 40 ng의 DNAA 융합 프라이머를 사용하여 비드와 30 µL의 물을 재현탁합니다. 시퀀싱 전용 어댑터를 추가하기 위해 PCR을 사용할 수 있습니다. 세부 사항은 표 5에 제시되어 있습니다.

겔에서 생성물을 확인합니다. 고해상도 겔 전기영동으로 lamb PCR 결과를 관찰하는 것이 비교 분석을 통한 진단법으로 가장 적합한 선택입니다. 2% agarose 또한 가능하지만, 효율이 떨어집니다.

NR LAMB의 클론성 및 PCR 산물은 육안으로 진단할 수 없습니다. 하지만 프로토콜의 성공 여부를 판단하는 데에는 2% agarose 젤만으로도 충분합니다. PCR 산물을 시퀀싱하면 호스트 게놈 내 벡터의 위치를 찾을 수 있습니다.

이 데이터를 통해 코딩 영역 및 전사 시작 부위 근처의 삽입 부위 위치를 기록하는 것이 가능합니다. 이 기술의 개발은 유전자 치료 분야의 연구자들이 전임상 모델과 임상 유전자 치료 시험 모두에서 유전자 전달 벡터의 생물학적 안전성을 탐구할 수 있는 길을 열어주었습니다.