Name: 마우스 골수에서 파골 세포의 유도 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-11-06T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 17 s
Description: 배우세요 마우스 골수에서 파골 세포를 대량 분리하는 방법을. 밀도 구배 분리와 배양 기술을 활용하여 골 흡수 세포의 생물학을 연구하고 골 관련 질환 메커니즘을 규명할 수 있습니다.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

우리는 NIH 보조금 R01 DE021683, R01 DE019434, U01 HL099776, 오크 재단과 소아 재생 의학 Hagey 연구소의 지원을 인정합니다.

참고 : 윤리 문 : 척추 동물을 포함한 모든 연구가 실험 동물 관리에 스탠포드 행정 패널 (APLAC)의 승인에 따라 프로토콜을 수행 하였다. 1. 준비 <ol><li> 시판 밀도 구배 세포 분리 매체 10 ㎖ 50 ㎖ 원뿔형 튜브에 RT에 와서 (polysucrose 및 나트륨 diatrizoate 포함 1.077 g / ㎖의 밀도로 조정) 허용. </li><li> 유동 세포 계측법 준비 (FACS)는 1X 인산 완충 식염수 (PBS)와 2 % 소 태아 혈청 (FCS)와 버퍼. 50 mL를을 가지고 밀도 구배 세포 분리 매체 단계에서 사용하기 위해 RT에서이 나누어지는을 유지한다. </li><li> 분리 절차를 수행하는 동안 격리 된 조직과 세포를 유지 할 준비가 얼음 양동이를 가지고있다. </li></ol> 2. 문화 매체 준비 <ol><li> 기저 미디어를 준비합니다 MEM (최소 필수 중간), 페놀 레드 (500 ㎖), 글루타민산 (1X)하지 않고, FCS를 (10 배), 10,000 단위 / ㎖ penicilliN (1X). </li><li> 0.22 μm의 필터를 기저 미디어를 필터링합니다. </li><li> 골수 대 식세포 유도 매체를 준비합니다 <ol><li> 2.1 단계에서 제조 된 기저 미디어의 50 mL를 취하여. </li><li> 10 -7 M 최종 농도에서 프로스타글란딘 E2 (PGE2, 씨 352.465 g / 몰)를 추가합니다. </li><li> 10ng의 / ㎖에서 대 식세포 - 콜로니 자극 인자 (M-CSF)를 추가한다. </li><li> 미디어를 자극 골수 대 식세포의 최종 솔루션을 필터링하지 마십시오. </li></ol></li><li> 파골 세포 유도 매체를 준비합니다 <ol><li> 2.1 단계에서 제조 된 기저 미디어의 50 mL를 취하여. </li><li> 추가 10 -7 M 최종 농도에서 프로스타글란딘 E2 (PGE2, 씨 352.465 g / mol)의 </li><li> 10ng의 / ㎖에서 대 식세포 - 콜로니 자극 인자 (M-CSF)를 추가한다. </li><li> 10 ng를 / ㎖에서 RANKL을 추가합니다. </li><li> 파골 세포 유도 매체의 최종 솔루션을 필터링하지 마십시오. </li></ol></li></ol> 3. 골수 격리 <ol><li> 한 C57BL / 6 마​​우스를 안락사경추 탈구이어서 이산화탄소 흡입 방법을 사용. 참고 : 설치류가 적절한 기술, 장비 및 에이전트를 사용하여 훈련받은 사람이 안락사해야합니다. </li><li> 위치 해부 보드에 마우스를 확보하고 70 % 알코올을 스프레이. </li><li> 대퇴골, 경골, 상완골 (humeri)과 척추를 해부하다. <ol><li> 앙와위에서 마우스로 시작합니다. 수직으로 하체를 따라 절개를하고 연부 조직 첨부 파일을 분할하여 대퇴골과 경골의 길이를 따라 절개로 시작합니다. 마지막으로, 골격에서 완전히 뼈를 확보하기 위해 무릎과 엉덩이 관절에서 뼈가 탈구. </li><li> 상완골을 분리하는 상지의 길이를 따라 절개를 진행합니다. 연부 조직 피막 첨부 파일을 해부하여 어깨와 팔꿈치 관절에서 상완골 탈구. </li><li> 마우스는 경향이있다 그래서 마지막으로, 위에 마우스를 켭니다. 정중선에서, 척추의 길이 방향을 따라 피부를 절개를. paravertebral 소프트를 관찰paravertebral 부드러운 조직 덩어리를 해부 척추의 뼈 가장자리를 따라 척추와 째다의 각면에 조직. 가위 사용하여 목의 기지에서 척추에 걸쳐 수평 절단을하고, 연부 조직의 첨부 파일에서 척추를 자유롭게 척추, 꼬리 삽입에 바로 인접의 끝에서. </li></ol></li><li> 뼈가 수확되면, 얼음에 FACS 버퍼에 보관하십시오. </li><li> 뼈에서 근육과 연부 조직을 청소하는 조직의 용지를 사용하십시오. </li><li> FACS 버퍼의 3 ㎖와 봉과 박격포로 청소 뼈를 놓습니다. </li><li> 봉과 박격포 부드럽게 뼈를 분쇄. </li><li> 70 μm의 셀 스트레이너를 통해 솔루션을 전달하여 50 ML 원뿔 튜브에 피 묻은 액체 및 전송 대기음. </li><li> 5 ml의 FACS가 짓 눌린 뼈에 버퍼와 더 호감을 추가합니다. 다시 말하지만, 피펫을 사용하여 유체를 제거하고 70 μm의 스트레이너를 통해 50 ML 원뿔 튜브로 전송할 수 있습니다. </li><li> 일반적으로 뼈 트위어 호감신선한 FACS 완충액에서 세 번, 유체가 적색 착색되지 않을 때까지, 박격포와 유, 신선한 FACS 완충액 5 mL를 추가로 첨가 할 때마다 사용하는 가전. </li><li> 세포 펠렛을 수득 4 ° C에서 5 분 동안 200 XG에 골수 용액을 원심 분리기. </li></ol> 골수 세포의 분리 4. 그라디언트 <ol><li> FACS 완충액 10ml에 상청에 resuspend 대기음 (RT로 유지). </li><li> 시판 밀도 구배 세포 분리 매체 (RT) 10 ㎖를 함유하는 50 ㎖ 원뿔형 튜브를 타고. </li><li> 밀도 구배 세포 분리 매체로 골수 용액을 층을 포함한다. 천천히 전기 피펫을 사용하여이 작업을 수행합니다. 각 피펫 원뿔 튜브의 상단에있는 내부 표면에 대한 팁과 약 30 °의 원뿔형 튜브를 기울이십시오. 밀도 구배 세포 분리 매체를 방해하지 않도록 피펫에 느린 속도 설정을 사용하여 부드럽게 골수 용액 추방. 참고 : 궁극적으로있을 것이다두 솔루션 (휴대폰 솔루션 및 밀도 구배 세포 분리 미디어 솔루션) 사이의 명확한 정의합니다. </li><li> RT 원심 분리기를 사용하여, 15 분 동안 200 XG에서 평형 원심 밀도 구배 세포 분리 매체 및 세포 용액을 원심 분리기. 또한, 밀도 구배 세포 분리 미디어 구배를 사용하여 적절한 상분리되도록 원심 분리기에 가속 및 감속을 제거한다. </li><li> 원심 분리 후, 관심있는 골수 세포를 포함 흐린 중간층을 대기음. </li><li> 새로운 원뿔 튜브에이 세포를 전송합니다. 세포를 씻어 (얼음에 보관) 추가 FACS 버퍼의 20 ML을 추가합니다. </li><li> 4 ° C에서 5 분 200 XG에 원심 분리기 세포 펠렛을 얻었다. </li><li> 혈구 세포를 사용하여 계산을 허용하기 위해 미디어를 자극 식세포의 1 ㎖의 최종 세포 펠렛을 재현 탁. </li></ol> 5. 셀 카운팅 <ol><li> 세포 용액 10 μl를 타고 혼합트리 판 블루 10 μL와. 로드 결과 믹스의 10 μL 혈구 상 및 솔루션 1 ㎖ 당 세포 수를 얻을 수 있습니다. </li></ol> 6. 세포 배양 <ol><li> 24 웰 플레이트의 각 웰에 대 식세포 자극 미디어 2 ㎖를 놓습니다. </li><li> 각 웰에 20 만 셀을 추가합니다. 참고 : 우리의 경험에 의하면, 세포 도금 밀도는 파골 세포의 체외 배양에 적절한의 가장 중요한 요구 사항 중 하나입니다. </li><li> 조심스럽게 37 ° C에서 일반 인큐베이터에서 플레이트와 장소를 선동. </li><li> 3 일 동안 미디어를 변경하지 마십시오. </li><li> 대 식세포 자극 미디어 3 일 후, 파골 세포의 미디어에 미디어를 변경합니다. </li><li> 이하, 지점, 큰, 다핵 파골 세포가 배양 용기에 표시해야하는 5~7일, 매일 미디어를 변경합니다. </li></ol> 7. 염색 주석 산염 내성 산성 인산 가수 분해 효소 (TRAP) <ol><li> 체외 막 다른 5-7 일 후스트럭처는 물론 문화 미디어를 대기음. </li><li> 1X PBS로 3 회 부드럽게 우물을 씻으십시오. </li><li> 4 % 파라 포름 알데히드 용액을 첨가하여 세포를 고정시키고 39 ° C에서 1 시간 방치. </li><li> 이 시간 동안, 37 ° C로 사전 온난화로 (시판) TRAP 염색을 준비합니다. </li><li> 파라 포름 알데히드에서 1 시간 후, 파라 포름 알데히드를 대기음 및 1X PBS로 부드럽게하는 과정을 3 회 반복한다. </li><li> 플레이트의 각 웰에 미리 예열 TRAP 염색의 1 ML을 추가하는 것은 스테인드합니다. </li><li> 차광 1 시간 동안 37 ° C에서 인큐베이터에 접시를 놓습니다. </li><li> 1 시간 후, TRAP 염색을 대기음. </li><li> 예열 탈 이온수로 우물 3 회 반복한다. </li><li> 1-2 분 길의 헤 마톡 실린 (주)와 잘 Counterstain과. </li><li> 명 시야 현미경을 사용하여 이미지 파골. </li><li> 얼룩의 적절한 색상 강도까지 탈 이온수로 우물을 씻어 핵 블루 나타나는 일반적으로 할 때, 달성전자. </li></ol> 8. 파골 세포의 흡수 분석 <ol><li> 뼈 기판 또는 무기 성 칼슘 포스페이트 코팅 중 미리 코팅 인 시판의 24 웰 폴리스티렌 배양 접시를 사용한다. </li><li> 각 웰에 대 식세포 자극 미디어 2 ㎖를 놓습니다. </li><li> 각 웰에 2 단계의 단부에서 얻어진 200,000 갓 절연 골수 세포를 추가한다. </li><li> 부드럽게 3 일 동안 37 ° C에서 인큐베이터에 배치하기 전에 플레이트를 교반. </li><li> 3 일에서 파골 세포의 분화 미디어에 미디어를 변경합니다. </li><li> 5-7일에 대한 파골 세포의 분화 미디어와 매일 미디어 변경을 수행합니다. </li></ol> 파골 세포의 흡수 활동 9. 정량화 <ol><li> 후술하는 바와 같이 광물 기판 파골 세포 분화 배지에서 체외 배양 5-7 일 후, resorpti 형성 파골 세포의 능력을 평가하기 위해, 광물 표면을 분석구덩이, 파골 세포의 활동의 지표에. </li><li> 재 흡수 분석 플레이트에서 대기음 미디어와 각 웰에 10 % 표백제 용액 100 μl를 추가합니다. </li><li> RT에서 15 분 동안 10 % 표백제 용액으로 세포를 인큐베이션. </li><li> 증류수로 우물 3 회 반복한다. </li><li> 남아있는 물을 대기음 판에서 여분의 물을 흔들어 3-5 시간 동안 자연 건조 할 수 있습니다. </li><li> 시중에서 판매하는 폰 코사 염색 키트와 함께 접시 Counterstain과 해제 흡수 된 기판을 쉽게 시각화 할 수 있습니다. </li><li> 흡수 된 표면의 대표 부품의 이미지를 취할 밝은 필드 현미경을 사용합니다. </li><li> 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여, 파골 세포의 재 흡수 활성의 정량화를 허용하도록 흡수 된 표면의 백분율을 계산한다. </li></ol>

<ol><li>Sims, N. A., Martin, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coupling+the+activities+of+bone+formation+and+resorption%3A+a+multitude+of+signals+within+the+basic+multicellular+unit%5BTitle%5D)+AND+%22BoneKEy+reports%22%5BJournal%5D)">Coupling the activities of bone formation and resorption: a multitude of signals within the basic multicellular unit.</a> BoneKEy reports. 3, 481 (2014).</li>
<li>Kahn, A. J., Simmons, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigation+of+cell+lineage+in+bone+using+a+chimaera+of+chick+and+quial+embryonic+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Investigation of cell lineage in bone using a chimaera of chick and quial embryonic tissue.</a> Nature. 258, 325-327 (1975).</li>
<li>Walker, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bone+resorption+restored+in+osteopetrotic+mice+by+transplants+of+normal+bone+marrow+and+spleen+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Bone resorption restored in osteopetrotic mice by transplants of normal bone marrow and spleen cells.</a> Science. 190, 784-785 (1975).</li>
<li>Burger, E. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+formation+of+osteoclasts+from+long-term+cultures+of+bone+marrow+mononuclear+phagocytes%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+experimental+medicine%22%5BJournal%5D)">In vitro formation of osteoclasts from long-term cultures of bone marrow mononuclear phagocytes.</a> The Journal of experimental medicine. 156, 1604-1614 (1982).</li>
<li>Underwood, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+where+comes+the+osteoclast%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+pathology%22%5BJournal%5D)">From where comes the osteoclast.</a> The Journal of pathology. 144, 225-226 (1984).</li>
<li>Lacey, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bench+to+bedside%3A+elucidation+of+the+OPG-RANK-RANKL+pathway+and+the+development+of+denosumab%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Drug+discovery%22%5BJournal%5D)">Bench to bedside: elucidation of the OPG-RANK-RANKL pathway and the development of denosumab.</a> Nature reviews. Drug discovery. 11, 401-419 (2012).</li>
<li>Brown, J. E., Coleman, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Denosumab+in+patients+with+cancer-a+surgical+strike+against+the+osteoclast%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Clinical+oncology%22%5BJournal%5D)">Denosumab in patients with cancer-a surgical strike against the osteoclast.</a> Nature reviews. Clinical oncology. 9, 110-118 (2012).</li>
<li>Khosla, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minireview%3A+the+OPG%2FRANKL%2FRANK+system%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Minireview: the OPG/RANKL/RANK system.</a> Endocrinology. 142, 5050-5055 (2001).</li>
<li>Boyle, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+roles+of+MAPK+kinases+MKK3+and+MKK6+in+osteoclastogenesis+and+bone+loss%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Differential roles of MAPK kinases MKK3 and MKK6 in osteoclastogenesis and bone loss.</a> PloS one. 9, (2014).</li>
<li>Hofbauer, L. C., Heufelder, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+receptor+activator+of+nuclear+factor-kappaB+ligand+and+osteoprotegerin+in+bone+cell+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+molecular+medicine+%28Berlin%2C+Germany%29%22%5BJournal%5D)">Role of receptor activator of nuclear factor-kappaB ligand and osteoprotegerin in bone cell biology.</a> Journal of molecular medicine (Berlin, Germany). 79, 243-253 (2001).</li>
<li>Teramachi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+IL-6+Expression+in+Osteoclasts+is+Necessary+but+not+Sufficient+for+the+Development+of+Paget%27s+Disease+of+Bone%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+bone+and+mineral+research+%3A+the+official+journal+of+the+American+Society+for+Bone+and+Mineral+Research%22%5BJournal%5D)">Increased IL-6 Expression in Osteoclasts is Necessary but not Sufficient for the Development of Paget's Disease of Bone.</a> Journal of bone and mineral research : the official journal of the American Society for Bone and Mineral Research. , (2013).</li>
<li>Catalfamo, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyperglycemia+induced+and+intrinsic+alterations+in+type+2+diabetes-derived+osteoclast+function%5BTitle%5D)+AND+%22Oral+diseases%22%5BJournal%5D)">Hyperglycemia induced and intrinsic alterations in type 2 diabetes-derived osteoclast function.</a> Oral diseases. 19, 303-312 (2013).</li>
<li>Schueler, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intratibial+injection+of+human+multiple+myeloma+cells+in+NOD%2FSCID+IL-2Rgamma%28null%29+mice+mimics+human+myeloma+and+serves+as+a+valuable+tool+for+the+development+of+anticancer+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Intratibial injection of human multiple myeloma cells in NOD/SCID IL-2Rgamma(null) mice mimics human myeloma and serves as a valuable tool for the development of anticancer strategies.</a> PloS one. 8, (2013).</li>
<li>Xing, L., Boyce, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RANKL-Based+Osteoclastogenic+Assays+from+Murine+Bone+Marrow+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+molecular+biology+%28Clifton%2C+N.J%29%22%5BJournal%5D)">RANKL-Based Osteoclastogenic Assays from Murine Bone Marrow Cells.</a> Methods in molecular biology (Clifton, N.J). 1130, 307-313 (2014).</li>
<li>Weischenfeldt, J., Porse, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bone+Marrow-Derived+Macrophages+%28BMM%29%3A+Isolation+and+Applications%5BTitle%5D)+AND+%22CSH+protocols%22%5BJournal%5D)">Bone Marrow-Derived Macrophages (BMM): Isolation and Applications.</a> CSH protocols. , (2008).</li>
<li>Yamamoto, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteoblasts+provide+a+suitable+microenvironment+for+the+action+of+receptor+activator+of+nuclear+factor-kappaB+ligand%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Osteoblasts provide a suitable microenvironment for the action of receptor activator of nuclear factor-kappaB ligand.</a> Endocrinology. 147, 3366-3374 (2006).</li>
<li>Yasuda, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteoclast+differentiation+factor+is+a+ligand+for+osteoprotegerin%2Fosteoclastogenesis-inhibitory+factor+and+is+identical+to+TRANCE%2FRANKL%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Osteoclast differentiation factor is a ligand for osteoprotegerin/osteoclastogenesis-inhibitory factor and is identical to TRANCE/RANKL.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95, 3597-3602 (1998).</li>
<li>Lacey, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteoprotegerin+ligand+is+a+cytokine+that+regulates+osteoclast+differentiation+and+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Osteoprotegerin ligand is a cytokine that regulates osteoclast differentiation and activation.</a> Cell. 93, 165-176 (1998).</li>
<li>Teitelbaum, S. L., Ross, F. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+regulation+of+osteoclast+development+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Genetics%22%5BJournal%5D)">Genetic regulation of osteoclast development and function.</a> Nature reviews. Genetics. 4, 638-649 (2003).</li>
<li>Agas, D., Sabbieti, M. G., Marchetti, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endocrine+disruptors+and+bone+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+toxicology%22%5BJournal%5D)">Endocrine disruptors and bone metabolism.</a> Archives of toxicology. 87, 735-751 (2013).</li>
<li>Manolagas, S. C., O'Brien, C. A., Almeida, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+estrogen+and+androgen+receptors+in+bone+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">The role of estrogen and androgen receptors in bone health and disease.</a> Nature Reviews Endocrinology. 9, 699-712 (2013).</li>
<li>Martin, T. J., Udagawa, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hormonal+regulation+of+osteoclast+function%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+endocrinology+and+metabolism%22%5BJournal%5D)">Hormonal regulation of osteoclast function.</a> Trends in endocrinology and metabolism. 9, 6-12 (1998).</li>
<li>Nakamura, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estrogen+prevents+bone+loss+via+estrogen+receptor+alpha+and+induction+of+Fas+ligand+in+osteoclasts%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Estrogen prevents bone loss via estrogen receptor alpha and induction of Fas ligand in osteoclasts.</a> Cell. 130, 811-823 (2007).</li>
<li>Bellido, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+interleukin-6%2C+osteoclastogenesis%2C+and+bone+mass+by+androgens.+The+role+of+the+androgen+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+clinical+investigation%22%5BJournal%5D)">Regulation of interleukin-6, osteoclastogenesis, and bone mass by androgens. The role of the androgen receptor.</a> The Journal of clinical investigation. 95, 2886-2895 (1995).</li>
<li>Roato, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+among+cells+of+bone%2C+immune+system%2C+and+solid+tumors+leads+to+bone+metastases%5BTitle%5D)+AND+%22Clinica.%2C+%26+developmental+immunology%22%5BJournal%5D)">Interaction among cells of bone, immune system, and solid tumors leads to bone metastases.</a> Clinica., & developmental immunology. 2013, (2013).</li>
<li>Autio, K. A., Morris, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+bone+physiology+for+the+treatment+of+metastatic+prostate+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+advances+in+hematolog.%2C+%26+oncology%22%5BJournal%5D)">Targeting bone physiology for the treatment of metastatic prostate cancer.</a> Clinical advances in hematolog., & oncology. 11, 134-143 (2013).</li>
<li>Sottnik, J. L., Keller, E. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Understanding+and+targeting+osteoclastic+activity+in+prostate+cancer+bone+metastases%5BTitle%5D)+AND+%22Current+molecular+medicine%22%5BJournal%5D)">Understanding and targeting osteoclastic activity in prostate cancer bone metastases.</a> Current molecular medicine. 13, 626-639 (2013).</li>
</ol>

저자 중에 선언하는 공개 또는 이해 상충이 없습니다.

쉽게 체외에서 파골 세포의 큰 숫자를 분리하고 배양 할 수있는 능력은 뼈 생물학 및 파골 세포 - 매개 질환의 이해를 전진하는 데 도움에 대한 책임이있다. 이는 최근 파골 세포 분화, 분화 및 생존 16-18의 주요 조절로 확인되었다 때,이 이어질 RANKL의 식별이었다. 그것은 골수에서 파골 세포의 체외 배양은 파종 밀도에 크게 의존하는 우리의 경험이었다. 우리는 골수 유래 세포를 도금시 파골 세포를 수득하고이 프로토콜 실패 차선 시딩 밀도로 인해 일반적으로 관찰. 따라서,이 프로토콜에, 이곳은 24 웰 플레이트 당 20 만 셀을 배정하는 것이 좋습니다. 또한,이 기술에 최대 성공을 달성하기 위해서는, 정확하게 파골 유도 매체를 제조 권장 위와 s로 미디어를 변경하는 바와 같은AME 시간은 매일, 초기 삼일 후에 하나는 문화 판을 방해 할 필요가없는 경우. 이는 파골 세포 유도 인자 매체의 농도를 일정하게 할 수있다. 또한...

뼈의 리모델링은 동적이며 골 흡수 1 골 형성의 커플 링을 수반한다. 이 엄격하게 규제 과정은 정상적인 항상성 동안 골격을 유지할 책임이 있으며, 부상 및 질병에 대응. 파골 세포는 뼈의 유기 및 무기 매트릭스를 모두 재 흡수 할 수있는 고유 한 다핵 세포이다. 파골 세포는 골수 2-5의 단핵구 / 대 식세포의 혈통에서 파생됩니다. 파골 세포의 기능 또는 형성에 이상이 골다공증과 같은 일반적인 조건을 포함 임상 병리의 다양한 발생할 수 있습니다. 체외에서 파골 세포를 생성하는 기능은 뼈 생물학 (6)에 대한 우리의 이해에 상당한 발전을 허용했다. 결과적으로, 새로운 치료제 7 상당한 이환율 및 사망률을 담당 파골 세포 관련 질환을 치료하기 위해 대두되고 </s&gt;까지. 뼈 질량과 강도의 항상성 유지는 뼈 형성 조골 세포와 뼈 재 흡수 파골 세포 8,9의 공동 행동이 필요합니다. 골 항상성이되는 파골 세포 활성은 골 질량 및 밀도 10 병원성 손실에 이르게 증가, 폐경 후 골다공증을 포함한 질병의 숫자로 변경된다. 인간 질병의 형질 전환 생쥐 모델의 유용성을 증가함에 따라, 인간의 골 질환 11-13에서 파골 세포의 역할을 해독 할 기회가 더있다. 많은 변화가 9,12,14 설명과 파골 세포 배양 기술에 대한 다수의 프로토콜은 문학에 나타납니다. 싱 연구팀은 쥐의 골수 세포에서 osteoclastogenic 분석의 자신의 설명에, 아래에 설명 된 프로토콜과 유사한 방법을 설명합니다. 그러나 긴 뼈 수확 다음의 골수 세포를 분리, 싱 등. α-MEM 전체 미디어와 골수 캐비티를 플러시14. Catalfamo은 파골 세포 기능에 고혈당증의 효과를 검사하고있는 모든 세포가 골수 플러싱 동원하는 방법이되는 비 - 부착 세포는 12 폐기된다 가리, 24 시간 동안 배양 설명도 보일 등에 의해 사용되는 기술 . (9)이 사전에 발행 프로토콜은 하나의 뼈의 양 단부를 절단해야으로서도, 바늘 스틱 부상 귀중한 골수의 손실 위험을 도입 골수, 지루한 연습, 플러싱의 연습을 필요로한다. 우리가 설명 프로토콜은 Weischenfeldt 등에 의해 기술 된 대 식세포의 분리 방법과 유사한 파골 세포를 분리하기 박격포와 유의 사용을 구현한다. 15 우리의 경험은, 그러나, 종종 그 결과, 파골 세포 생산의 관점에서 가변 결과 이전에 출판 된 기법을 사용하여 그 결과 파골 분리 및 체외 배양이며무능력에서 파골 세포를 배양합니다. 따라서, 우리의 존재, 초기 식세포이어서 파골 세포 형성 도금 셀 70-80 %로 약 수율로 시험관 내에서 다핵 파골 세포의 다수 생산하는 마우스 골수의 일관된 분리를 허용하는 프로토콜을 고안 파골 세포 유도 매체.

<table><tbody><tr><td>MEM, 글루타민 없음, 페놀 레드 없음</td><td>Gibco</td><td>51200-038</td><td></td></tr><tr><td>M-CSF, 재조합 마우스</td><td>Gibco</td><td>PMC2044</td><td></td></tr><tr><td>재조합 마우스 TRANCE/RANK L/TNFSF11 (E. coli 발현)</td><td>R& D Systems</td><td>462-TEC-010</td><td></td></tr><tr><td>프로스타글란딘 E2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Histopaque-1077</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10771</td><td></td></tr><tr><td>산성 인산분해효소, 레코사이트(TRAP) 키트</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>387A</td><td></td></tr><tr><td>골분석 골흡수 플레이트, 24웰 플레이트</td><td>Corning Life Sciences</td><td>3987</td><td></td></tr></tbody></table>

마우스 골수에서 파골 세포의 유도

Osteoclast Derivation from Mouse Bone Marrow

<html> 파골 세포는 골수 단핵구 / 대 식세포의 혈통에서 파생 된 고도로 전문화 된 세포이다. 뼈의 유기 및 무기 매트릭스를 모두 재 흡수하는 이들의 독특한 능력은 골 리모델링을 조절하는데 중요한 역할을한다는 것을 의미한다. 함께, 조골 세포 및 파골 세포는 골 흡수 및 건강과 질병 중에 정상 골격을 유지하기 위해 함께 작용하는 골 형성을 모두 포함 동적 커플 링 프로세스에 대한 책임이있다. 신체의 주요 뼈 재 흡수 세포로, 파골 세포의 분화 또는 기능의 변화는 몸에 심각한 영향을 초래할 수 있습니다. 변경된 파골 세포의 기능과 관련된 질환은 더 일반적으로 과도한 파골 세포의 골 흡수가 형성 골절에 걸리기 쉽게하는 골다공증 등의 병변을 관찰하기 때문에 조혈위한 골수 공간을 형성하기 위해 실패에 치명적인 신생아 질병 심각도에 다양합니다. ENT &quot;&gt; 체외에서 높은 숫자 파골 세포를 분리하는 능력은 뼈의 리모델링주기의 이해에 상당한 발전을 허용하고이 질병에 대처 새로운 치료 전략의 발견을위한 도로를 포장하고있다. 여기, 우리는 분리와 파골 세포의 큰 숫자를 얻을 것입니다 마우스 골수에서 파골 세포를 배양 할 수있는 프로토콜을 설명합니다.

이 방법의 목적은 쉽게 일주 전형적, 시험관 내에서 파골 세포의 다수를 분리 하였다. 파골 세포의 다수의 성공적인 분리가 타르트 레이트 저항성 산성 포스파타제 염색 (도 1A)를 사용하여 확인 하였다. 큰 파골 세포는 여러 개의 핵 (일반적으로 ≥ 3 핵)와 큰 보라색의 세포로 시각입니다. 이 프로토콜을 이용하여, 파골 세포 당 30 개의 핵 (도 1b)와 파골 세포를 분리하는 것이 일반적이다. 광물 표면을 사용하여 in vitro에서 파골 세포의 재 흡수 활동을 평가하는 황금 표준 방법으로 간주됩니다.이 방법을 사용하여 형성 한 광물 표면의 비율, 또는 "재 흡수 구덩이는"파골 세포의 재 흡수 용량의 결정 (그림 2) 수 있습니다. <p class="jove_content" fo:keep-together.within-page="a...

파골 세포는 신체의 주요 뼈 재 흡수 세포이다. 많은 수의 파골 세포를 분리 할 수​​있는 능력은 파골 세포 생물학의 이해에 상당한 발전을 가져왔다. 이 프로토콜에서는 배양 및 in vitro에서 파골 세포 활성을 정량화, 단리하는 방법을 설명한다.

Osteoclasts are highly specialized cells that are derived from the monocyte/macrophage lineage of the bone marrow. Their unique ability to resorb both the ...

이 절차의 전반적인 목표는 마우스 골수에서 파골세포를 대량으로 분리하는 것입니다. 이것은 먼저 안락사된 쥐의 뼈를 채취하여 수행됩니다. 다음으로, 세포는 절구와 절구공이를 사용하여 뼈를 분쇄하여 사실 완충제에서 골수에서 해방됩니다.그런 다음 골수 용액을 밀도 구배 세포 분리 배지 위에 층을 이루고 밀도 구배 세포 분리를 수행합니다. 마지막으로, 관심 세포를 포함하는 층을 흡인하고 세포를 골수 마이크로파지 유도 배지에 배치합니다. 궁극적으로 트랩 염색은 많은 수의 파골세포의 존재를 보여주는 데 사용됩니다.이 기술의 의미는 변형된 파골세포 기능과 관련된 질병으로 확장되며, 조혈을 위한 골수 공간 형성 실패로 인한 치명적인 신생아 질환에서 마우스 골수에서 많은 수의 파골세포를 분리하는 신뢰할 수 있는 방법을 생성하기 때문에 골다공증과 같은 병리학에 더 일반적으로 발생할 수 있는 심각한 질병에 이르기까지 심각도가 다양할 수 있습니다. 먼저 50ml 원추형 튜브에서 10ml의 시판되는 밀도 구배 세포 분리를 중간 온도에서 실온으로 가져옵니다. 밀도 구배 셀 분리 매체와 함께 사용할 50ml의 팩스 버퍼 분취량을 실온에 놓습니다.추가 배지를 준비하고 C 57 블랙 식스 마우스를 안락사시킨 후 텍스트 프로토콜에 따라 마우스를 해부 보드에 놓고 70% 에탄올을 사용합니다. 그것을 뿌리려면 fera tibia hum 눈과 척추를 수확하십시오. 그런 다음 뼈를 얼음 위에 사실 완충재로 놓습니다.그런 다음 깨끗한 티슈 페이퍼를 사용하여 뼈의 근육과 연조직을 제거합니다. 뼈를 절구에 넣고 3ml의 사실 완충액이 있는 절구공이를 넣고 부드럽게 으깨십시오. 그런 다음 혈액이 묻은 액체를 흡인하고 70마이크로미터 여과기를 통해 50ml 원뿔형 튜브에 통과시킵니다.으깬 뼈에 5ml의 효과 완충액을 추가로 추가하고 스트레이너를 통해 액체를 50ml 튜브로 옮기기 전에 더 부수십시오. 체액이 더 이상 붉게 변하지 않을 때까지 이 과정을 계속한 후 골수를 섭씨 4도에서 5분 동안 200Gs로 펠릿화합니다. 그래디언트 분리를 수행하려면 세포 펠릿에서 상등액을 흡입하고 10ml의 팩스 버퍼를 사용하여 재생합니다.펠릿을 매달아 놓고 실온 밀도 구배 셀 분리 매체의 원뿔형 튜브를 약 30도로 기울이고 전기 피펫을 사용하여 피펫 끝이 튜브의 내부 상단 표면에 닿도록 합니다. 가속 또는 감속 없이 실온 원심분리기를 사용하여 골수 용액을 배지에 천천히 층을 이룹니다. 200Gs에서 15분 동안 그래디언트를 돌립니다.그런 다음 관심 세포가 포함된 흐린 중간층을 흡인하고 이를 새로운 원뿔형 튜브로 옮깁니다. 20ml의 얼음처럼 차가운 팩스 버퍼를 추가하여 셀을 세척합니다. 그런 다음 1ml의 골수 마이크로파지 자극 배지를 사용하여 세포 계수 후 최종 세포 펠릿을 재현탁합니다.24웰 플레이트의 각 웰에 2밀리리터의 마이크로파지 자극 배지를 배치했습니다. 그런 다음 각 웰에 200, 000개의 세포를 추가하여 적절한 체외 파골세포 배양을 보장하는 세포 밀도를 추가합니다. 플레이트를 부드럽게 교반하고 3일 동안 매체를 변경하지 않고 섭씨 37도에서 배양합니다.3일째 후에는 배지를 골수 파골세포 유도 배지로 변경하고 5-7일 동안 매일 교체하기 시작합니다. 이 시점에서 큰 다핵 파골세포가 보여야 합니다. 여기에서 볼 수 있듯이 staining 및 resorption assay에 대한 텍스트 프로토콜을 참조하십시오.많은 수의 파골세포는 주석산염 저항성 분석을 사용하여 확인할 수 있습니다. 파골세포를 염색하는 포스포테이트는 이 비디오에 설명된 프로토콜을 사용하여 여러 핵이 있는 큰 보라색 세포로 시각화됩니다. 세포당 최대 30개의 핵을 가진 파골세포를 분리하는 것이 일반적입니다.광물화된 표면을 사용하는 것은 in vitro에서 파골세포 흡수 활성을 평가하기 위한 황금 표준 방법으로 간주됩니다. 이 그림에서 10배 배율의 명시야 현미경은 검은색 윤곽선으로 형성된 광물화된 표면 또는 흡수 구덩이의 백분율을 보여주며, 이를 통해 파골세포 흡수 능력을 측정할 수 있습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 마우스 골수에서 많은 수의 파골세포를 안정적으로 분리하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.

osteoclast-derivation-from-mouse-bone-marrow

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

이 비디오에서는 생쥐의 긴 뼈에서 골수 기질 세포의 분리 및 배양을 보여줍니다. 분리된 부착 BMSC는 추가 분석에 사용할 수 있습니다.

Isolation and Culture of Bone Marrow Stromal Cells from a Mouse Tibia

노치 신호는 세포 간의 직접 접촉에 의존하는 셀룰러 통신의 한 형태입니다. 체외에서 Notch 신호를 적절하게 유도하려면 Notch 리간드를 고정된 상태의 세포에 제공해야 합니다. 이 프로토콜은 마우스 파골세포 전구체에서 Notch 신호의 체외 자극 방법을 설명합니다.

마우스 파골 세포 전구체의 노치 신호 전달의 자극

이 프로토콜 생체 외에서 인간 전 임상 모델의 주변 혈액 monocytes 배양 암 세포 osteoclast 상호 작용을 모방 하기 위해 유 방 암 세포 라인에서 osteoclastogenesis의 개발을 설명 합니다. 모델 뼈 전이 형성의 우리의 이해를 심화 하 고 향상 치료 옵션 사용 될 수 있습니다.

말 초 혈액 Monocytes 유 방 암 세포 라인 공동 경작에서 Osteoclastogenesis의 인간의 전 임상 모델의 개발

이 원고 osteoclast 형성에서 복잡 한 1 rapamycin의 포유류/기계적 대상의 역할을 연구 하 고 마우스 골 수에서 분리 및 문화 osteoclasts에 생체 외에서 프로토콜을 설명 합니다.

RANKL 기반 Osteoclast 문화 분석 결과의 마우스 골 수 mTORC1 Osteoclast 형성에의 역할을 조사 하

이 문서에서는, 우리는 분리 하 고 마우스 긴 뼈에서 골 수 기질 세포와 조 혈 줄기 세포 분화 방법 제시. 두 개의 서로 다른 프로토콜에는 저조한 다른 세포 인구 확장 및 차별화 osteoblasts, adipocytes, osteoclasts에 적합 되 게 됩니다.

절연, 문화, 및 골 수 기질 세포와 생쥐에서 Osteoclast 창시자의 차별화

큰 뼈 장애 복구에 대 한 설계 새로운 생체 재료의 수는 지속적으로 뼈 이식 수술과 관련 된 합병증을 극복 하 고 뼈 치유 향상을 목표로 확장 됩니다. 여기, 우리는 뼈 수리에 대 한 생체의 전 임상 생체 적합성 테스트를 위한 종합 전략을 제시.

뼈 재생을 위해 생체에서 생물학적 호환성 프로필

파 골 세포는 조 혈 간세포의 대 식 세포 혈통에서 유래한 조직 특유의 대 식 세포 폴 리 에틸렌 이다. 이 프로토콜은 기존의 방법에서 발견 되는 사고의 위험을 줄이면서 많은 양의 파 골 세포를 얻을 수 있도록 골 수 셀을 분리 하는 방법을 설명 합니다.

쥐 골 골에서의 파 골 세포 전 구체의 분리, 정제 및 분화

파골세포는 신체의 주요 뼈 흡수 세포입니다. 이 프로토콜은 인간 말초 혈액 단핵구로부터 파골세포의 시험관내 분화를 위한 신뢰할 수 있는 방법을 설명합니다. 이 방법은 항상성 및 질병에서 파골세포 생물학을 더 깊이 이해하는 데 중요한 도구로 사용될 수 있습니다.

기능성 파골세포와 인간 말초 혈액 CD14+ 단핵구의 분화

이 프로토콜은 유도만능줄기세포(iPSC)에서 인간 파골세포의 분화를 제시하고 파골세포 및 파골세포 전구체의 특성 분석 방법을 설명합니다.

인간 유도 만능 줄기 세포에서 파골세포의 분화 및 특성화

본 프로토콜은 마우스에서 매우 균일한 골수 중간엽 줄기세포(BMSC)를 정제, 확장 및 특성화하는 비용 효율적인 방법을 설명합니다. 이 접근 방식은 증식 및 분화 가능성이 높은 BMSC를 대량으로 획득할 수 있도록 하여 마우스 모델을 지원하고 전임상 연구를 발전시킵니다.

Purification, Expansion, and Flow Cytometry-Based Phenotyping of Mouse Derived Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells

쥐 골수 손상 모델은 막내 골화를 통한 출생 후 골형성을 연구하는 데 유용한 도구입니다. 이 단순화된 수술 프로토콜은 새로운 뼈 형성 및 손상 후 세포 반응의 다운스트림 평가를 위한 골수 절제 절차를 설명합니다.

쥐 골수 손상 모델에서 골수내 골화를 통한 출생 후 골형성을 연구하기 위한 개선된 방법론

배우세요 마우스 골수에서 파골 세포를 대량 분리하는 방법을. 밀도 구배 분리와 배양 기술을 활용하여 골 흡수 세포의 생물학을 연구하고 골 관련 질환 메커니즘을 규명할 수 있습니다.

마우스 골수에서 파골 세포의 유도

더 많은 동영상 탐색