마우스 골수에서 파골 세포의 유도

이 절차의 전반적인 목표는 마우스 골수에서 파골세포를 대량으로 분리하는 것입니다. 이것은 먼저 안락사된 쥐의 뼈를 채취하여 수행됩니다. 다음으로, 세포는 절구와 절구공이를 사용하여 뼈를 분쇄하여 사실 완충제에서 골수에서 해방됩니다.

그런 다음 골수 용액을 밀도 구배 세포 분리 배지 위에 층을 이루고 밀도 구배 세포 분리를 수행합니다. 마지막으로, 관심 세포를 포함하는 층을 흡인하고 세포를 골수 마이크로파지 유도 배지에 배치합니다. 궁극적으로 트랩 염색은 많은 수의 파골세포의 존재를 보여주는 데 사용됩니다.

이 기술의 의미는 변형된 파골세포 기능과 관련된 질병으로 확장되며, 조혈을 위한 골수 공간 형성 실패로 인한 치명적인 신생아 질환에서 마우스 골수에서 많은 수의 파골세포를 분리하는 신뢰할 수 있는 방법을 생성하기 때문에 골다공증과 같은 병리학에 더 일반적으로 발생할 수 있는 심각한 질병에 이르기까지 심각도가 다양할 수 있습니다. 먼저 50ml 원추형 튜브에서 10ml의 시판되는 밀도 구배 세포 분리를 중간 온도에서 실온으로 가져옵니다. 밀도 구배 셀 분리 매체와 함께 사용할 50ml의 팩스 버퍼 분취량을 실온에 놓습니다.

추가 배지를 준비하고 C 57 블랙 식스 마우스를 안락사시킨 후 텍스트 프로토콜에 따라 마우스를 해부 보드에 놓고 70% 에탄올을 사용합니다. 그것을 뿌리려면 fera tibia hum 눈과 척추를 수확하십시오. 그런 다음 뼈를 얼음 위에 사실 완충재로 놓습니다.

그런 다음 깨끗한 티슈 페이퍼를 사용하여 뼈의 근육과 연조직을 제거합니다. 뼈를 절구에 넣고 3ml의 사실 완충액이 있는 절구공이를 넣고 부드럽게 으깨십시오. 그런 다음 혈액이 묻은 액체를 흡인하고 70마이크로미터 여과기를 통해 50ml 원뿔형 튜브에 통과시킵니다.

으깬 뼈에 5ml의 효과 완충액을 추가로 추가하고 스트레이너를 통해 액체를 50ml 튜브로 옮기기 전에 더 부수십시오. 체액이 더 이상 붉게 변하지 않을 때까지 이 과정을 계속한 후 골수를 섭씨 4도에서 5분 동안 200Gs로 펠릿화합니다. 그래디언트 분리를 수행하려면 세포 펠릿에서 상등액을 흡입하고 10ml의 팩스 버퍼를 사용하여 재생합니다.

펠릿을 매달아 놓고 실온 밀도 구배 셀 분리 매체의 원뿔형 튜브를 약 30도로 기울이고 전기 피펫을 사용하여 피펫 끝이 튜브의 내부 상단 표면에 닿도록 합니다. 가속 또는 감속 없이 실온 원심분리기를 사용하여 골수 용액을 배지에 천천히 층을 이룹니다. 200Gs에서 15분 동안 그래디언트를 돌립니다.

그런 다음 관심 세포가 포함된 흐린 중간층을 흡인하고 이를 새로운 원뿔형 튜브로 옮깁니다. 20ml의 얼음처럼 차가운 팩스 버퍼를 추가하여 셀을 세척합니다. 그런 다음 1ml의 골수 마이크로파지 자극 배지를 사용하여 세포 계수 후 최종 세포 펠릿을 재현탁합니다.

24웰 플레이트의 각 웰에 2밀리리터의 마이크로파지 자극 배지를 배치했습니다. 그런 다음 각 웰에 200, 000개의 세포를 추가하여 적절한 체외 파골세포 배양을 보장하는 세포 밀도를 추가합니다. 플레이트를 부드럽게 교반하고 3일 동안 매체를 변경하지 않고 섭씨 37도에서 배양합니다.

3일째 후에는 배지를 골수 파골세포 유도 배지로 변경하고 5-7일 동안 매일 교체하기 시작합니다. 이 시점에서 큰 다핵 파골세포가 보여야 합니다. 여기에서 볼 수 있듯이 staining 및 resorption assay에 대한 텍스트 프로토콜을 참조하십시오.

많은 수의 파골세포는 주석산염 저항성 분석을 사용하여 확인할 수 있습니다. 파골세포를 염색하는 포스포테이트는 이 비디오에 설명된 프로토콜을 사용하여 여러 핵이 있는 큰 보라색 세포로 시각화됩니다. 세포당 최대 30개의 핵을 가진 파골세포를 분리하는 것이 일반적입니다.

광물화된 표면을 사용하는 것은 in vitro에서 파골세포 흡수 활성을 평가하기 위한 황금 표준 방법으로 간주됩니다. 이 그림에서 10배 배율의 명시야 현미경은 검은색 윤곽선으로 형성된 광물화된 표면 또는 흡수 구덩이의 백분율을 보여주며, 이를 통해 파골세포 흡수 능력을 측정할 수 있습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 마우스 골수에서 많은 수의 파골세포를 안정적으로 분리하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.