심근 경색 후 Spectrofluorometry에 의해 측정 된 쥐 편도체에서 카스파 제 3 활동

심근경색(MI)은 심장 기능 손상뿐만 아니라 MI의 행동 결과에 관여하는 뇌 영역인 편도체의 세포사멸(apoptosis)을 동반합니다. 이 프로토콜은 MI를 유도하고, 편도체 조직을 수집하고, 그 안에서 세포사멸의 마커인 카스파제-3 활성을 측정하는 방법을 설명합니다.

이 절차의 전반적인 목표는 분광형광측정법을 사용하여 심근경색 후 쥐 편도체에서 카스파제-3 활성을 측정하는 것입니다. 이 방법은 심근 경색이 인지 능력, 정신 건강, 노화 과정 및 수면에 미치는 결과와 같은 행동 신경 과학 분야의 주요 질문에 답할 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 간단하고 빠르며 신뢰할 수 있다는 것입니다.

일반적으로 이 방법을 처음 접하는 개인은 수술 및 조직 샘플링을 위한 손재주가 필요하기 때문에 어려움을 겪을 것입니다. 절차를 시연하는 것은 우리 실험실의 연구 조교인 Kim Gilbert가 될 것입니다. 승인된 기관 프로토콜에 따라 마취를 유도한 후 발 꼬집음 반사가 없는 상태에서 적절한 마취를 확인합니다.

쥐에게 기관내 튜브를 삽관하고 체온을 섭씨 37도로 유지하기 위해 발열 패드에 복부 욕창 위치에 있는 동물을 놓습니다. 기관내 튜브를 마취 기계에 연결하여 2%이소플루오란을 분배합니다. 다음으로, 클로르헥시딘 글루코네이트와 이소프로필 알코올로 수술 부위를 준비합니다.

그리고 양쪽 눈에 안과 연고를 바르면 건조함을 방지할 수 있습니다. 동물 위에 멸균 드레이프를 씌워 수술 부위 주변에 멸균 영역을 만듭니다. 그리고 필요한 멸균 수술 기구를 동물 옆의 다른 멸균 구역에 놓습니다.

그런 다음 숫자 10 메스 날이나 가위로 피부를 절개합니다. 가위나 지혈 클램프를 사용하여 근육 조직을 벗겨냅니다. 그런 다음 가위나 지혈 클램프를 사용하여 흉벽을 열고 흉부 견인기를 배치하고 지혈 클램프로 심낭을 엽니다.

관상동맥 폐색을 유도하기 위해 먼저 하행 관상동맥 주위와 인접한 심근 조직을 통해 360mm 길이의 4개의 제로 실크 봉합사를 고리로 만듭니다. 실크 봉합사의 양쪽 끝을 14게이지 1.25cm 길이의 플라스틱 튜브에 삽입합니다. 실크 봉합사의 양쪽 끝을 당기고 튜브를 동맥에 대고 아래로 밀어 동맥을 막습니다.

지혈 클램프로 플라스틱 튜브를 고정하여 폐색을 고정하고 40분 동안 폐색을 유지합니다. 40분 후, 지혈 클램프를 제거한 다음 유연한 튜브와 실크 봉합사를 제거하여 폐색을 해제합니다. 두 개의 제로 봉합사로 흉부를 닫고 흉강을 통해 유연한 카테터를 삽입하고 기흉을 방지하기 위해 10ml 주사기로 흉부에서 공기를 빼냅니다.

4 개의 제로 실크 봉합사로 근육을 꿰매고 3 개의 제로 실크 봉합사로 피부를 꿰매십시오. 마지막 피부 봉합사를 봉합하기 전에 10ml 주사기와 카테터를 사용하여 흉부에서 공기를 다시 빼냅니다. 피부를 닫은 다음 이소 플루오란을 멈 춥

쥐를 깨끗한 케이지에 넣고 마취에서 회복하는 동안 모니터링하십시오. 8시간마다 반복 투여하여 진통제를 투여합니다. 승인된 절차에 따라 동물의 목을 인도적으로 참수한 후, 으깬 얼음 위에 놓인 접시에 쥐의 머리를 올려 놓습니다.

가위를 사용하여 두개골을 엽니다. 그런 다음 rongeurs를 사용하여 위로 당겨 아래 조직을 손상시키지 않고 뼈 다발을 분리합니다. 다음으로, 주걱의 평평한 날을 두개골 바닥과 뇌의 뒤쪽 복부 표면 사이에 놓고 날을 부드럽게 앞으로 밀어 두개골에서 뇌를 들어 올려 두개골에서 뇌를 분리합니다.

뇌를 등쪽 표면에 놓습니다. 소뇌 앞에 있는 시상하부를 확인하고 시상하부의 뒤쪽 끝 앞과 앞쪽 끝에서 뇌를 관상상으로 절단합니다. 양측 편도체(bilateral amygdala)를 시상하부(hypothalamus) 바로 옆에 있는 측두엽(temporal lobes) 아래에 있는 두 개의 작은 구체로 식별합니다.

그런 다음 뇌의 정면 끝이 평평하게 뒤집어지도록 하고 등쪽 표면이 실험자로부터 멀어지도록 합니다. 다음으로, 반구를 분리하고 연속적인 편도체에서 피질을 제거합니다. 편도체가 드러나면 메스로 편도체를 잘라냅니다.

편도체를 가로지르는 어두운 봉합선을 따라 잘라 기저측과 중앙 내측 부분을 분리한 다음 두 부분을 얼음 위에 별도의 라벨이 붙은 튜브에 넣습니다. 이 단계는 효소의 변질을 방지하기 위해 가능한 한 빨리 수행되어야 합니다. 다른 반구로 해부 절차를 반복한 후 4개의 바이알을 모두 액체 질소에 1분 동안 담근 다음 섭씨 80도의 음의 냉동고에 보관합니다.

얼음 위의 각 5-10mg의 샘플에 150마이크로리터의 용해 완충액을 추가하는 것으로 시작합니다. 얼음 위에서 각 샘플을 최대 강도로 5초 동안 초음파 처리합니다. 그런 다음 얼음 위에서 30분 동안 배양합니다.

배양 중에는 5분마다 5초 동안 샘플을 볼텍스합니다. 그런 다음 샘플을 액체 질소에 번갈아 넣고 섭씨 37도로 설정된 온도 조절 장치로 제어되는 가열판에 올려 세 번의 동결-해동 주기를 수행합니다. 최종 동결 해동 주기 후 조직 샘플을 섭씨 4도에서 1300G에서 10분 동안 원심분리합니다.

다음으로, 상층액을 조심스럽게 흡인하고 얼음 위의 새 튜브로 옮깁니다. 서면 프로토콜의 지침에 따라 단백질을 정량화한 후 0.8마이크로리터의 10밀리몰 Ac-DEVD-AMC와 반응 완충액을 포함하는 반응 튜브에 25마이크로그램의 단백질을 추가하여 최종 부피 200마이크로리터를 만듭니다. 음성 반응 샘플의 경우, 25마이크로그램의 단백질을 1마이크로리터의 800마이크로몰 Ac-DEVD-CHO 및 0.8마이크로리터의 10밀리몰 Ac-DEVD-AMC와 결합합니다.

모든 샘플과 대조군을 섭씨 37도에서 3시간 동안 어두운 곳에서 배양합니다. 배양 시간이 경과한 후 각 샘플에서 pH 10의 0.4몰 글리신 600마이크로리터와 0.4몰 수산화나트륨으로 반응을 중지하고 대조합니다. 유리 큐벳의 각 반응에 2ml의 증류수를 추가합니다.

분광 형광 측정법(spectrofluorometry)으로 형광을 정량화합니다. 10초 동안 컨트롤과 샘플을 읽고 1초에 한 번씩 읽습니다. 마지막으로, 현재 화면에 표시된 공식에 따라 각 샘플의 특정 활성을 정량화합니다.

이 히스토그램은 심근경색을 겪은 쥐의 편도체에서 카스파제-3 활성을 보여줍니다. 데이터는 100%로 설정된 가짜 대조군의 평균 활동 비율로 표시되며, 각 그룹은 8마리의 쥐로 구성되었습니다. 별표는 p 값이 0.05 미만인 그룹 간의 유의미한 차이를 나타냅니다.

이 기술을 완전히 익히면 심근경색 수술과 조직 샘플링 사이의 간격을 제외하고 7시간 안에 완료할 수 있습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 쥐에서 심근 경색을 유도하고 분광 형광 측정을 사용하여 쥐 편도체에서 카스파제-3 활성을 측정하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.