Name: 심근 경색 후 Spectrofluorometry에 의해 측정 된 쥐 편도체에서 카스파 제 3 활동 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-01-12T17:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 41 s
Description: 학습하세요 심근 경색 후 쥐 편도체에서 카스파제-3 활성을 분광형광법으로 측정하는 방법을. 이 기술은 신경과학 및 심혈관 연구에서 세포사멸을 정량화하는 신뢰할 수 있는 프로토콜을 제공합니다.

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. 상테 -이 작품은 자연 과학 및 캐나다 김 길버트 공학 연구위원회에서 보조금에 의해 지원되었다 퐁 드 라 공들인 뒤 퀘벡에서 재학를 보유하고있다.

동물은 동물 관리에 캐나다위원회의 가이드 라인에 따라, 지역 동물 관리위원회의 규정을 준수하여 처리됩니다. 쥐 (21 ~ 22 ºC의 온도 40-50 %에 습도) 개별적으로 일정 조건 하에서 보관되어 08:00에 시작, 12 시간 어두운 조명주기를 포함. 차우 펠릿 및 수돗물은 연구 전반에 걸쳐 사용할 수 임의로 있습니다. 공급자의 납품 후 3 일의 적응 기간은 실험 전에 허용됩니다. 300-800g 사이의 무게 수컷 흰쥐 일상적 프로토콜이 사용되어왔다. 1. MI 수술 <ol><li> 케타민 60 ㎎ / ㎏과 자일 라진 (10) ㎎ / ㎏의 복강 내 주사와 마취를 유도한다. 발을 슬쩍 할 때 반사의 부재로 적절한 마취를 확인합니다. </li><li> 수술 부위를 면도. (16G 1.77 인치) 카테터 및 측와위에서 동물을 배치 : 기관 내 튜브와 쥐를 삽관. 온도를 약 37 ℃를 유지하기 위해 가열 패드에 동물을 놓습니다. 2 % 이소 플루 란 할 수있는 기관 내 튜브를 연결합니다. </li><li> 클로르헥시딘 글루 콘 이소 프로필 알코올로 수술 부위를 준비합니다. 수술하는 동안, 멸균 장갑 멸균 악기를 사용합니다. 마취 동안 건조를 방지하기 위해 두 눈에 안과 연고를 적용합니다. 동물과 동물 옆에 또 다른 무균 필드에 악기 멸균 필드를 넣습니다. </li><li> 메스 블레이드 # 10 피부를 절개. 지혈 클램프와 근육 조직을 벗겨. 복부 욕창 위치에있는 동물을 놓습니다. 지혈 클램프와 위치 가슴 트랙터 오픈 흉부 벽. 지혈 클램프 열기 심낭. </li><li> 연속 된 심근 조직을 통과, 관상 동맥 폐색, 루프에게 하행 관상 동맥 주위에 360mm 길이의 4-0 실크 봉합사를 생산합니다. 14G, 1.25 cm 긴 플라스틱 관에 실크 봉합사의 양쪽 끝을 삽입합니다. </li><li> 실크 봉합사와 고름의 양쪽 끝을 잡아 당겨시간은 아래 동맥에 튜브는 40 분 동안을 폐색한다. 지혈 클램프 플라스틱 튜브를 체결하여 안전 폐색. </li><li> 40 분 후,가요 성 배관 및 실크 봉합사를 제거하여 지혈 클램프를 해제함으로써 폐색을 해제. 주 : 샴 대조군은 동일한 수술 마이너스 관상 동맥 폐색을 겪는다. </li><li> 흉부 벽을 닫기 전에, 기흉을 방지하기 위해 5 ML의 주사기와 흉부의 공기를 그릴 흉강을 통해 유연한 카테터 (18G, 4.5 CM)를 배치합니다. </li><li> 닫기 흉부 공동은 2-0 봉합사로, 4-0 실크 봉합사로 근육과 3-0 실크 봉합사로 피부 만들기. </li><li> 마지막으로 피부 지점을 닫기 전에 다시 흉부 캐비티 이전에 배치 카테터를 통해 5 ML의 주사기와 흉부의 공기를 그립니다. </li><li> 마지막으로 피부에 포인트를 봉합. 이소 플루 란 환기를 중지합니다. </li><li> 쥐의 각성을 모니터링합니다. 이 regaine을 가질 때까지 무인 동물을 방치하지 마십시오D 충분한 의식은 흉골 드러 누움을 유지합니다. </li><li> 항생제와 진통제 (부 프레 노르 핀, 0.05 ㎎ / ㎏ IP)과 24 시간 (duplocillin의 단일 용량, 0.2 ㎎ / ㎏ IP)에 대한 쥐에게 매일 8 시간을 취급합니다. </li><li> 수술 후, 집 쥐 개별적으로 즉 희생의 시간까지 3 일 후 MI. </li><li> 경색 크기 주로 괴사는 좌심실의 위험 지역에서 경색 된 조직의 비율로서 표현된다. 이는 트리 페닐 착색 (11)를 이용하여 측정 할 수 있습니다. </li></ol> 2. 편도 격리 <ol><li> 코가 좁은 끝 구멍 밖으로 돌출, 원뿔 모양의 가방에 먼저 동물 머리를 놓습니다. 보안 쥐 움직임을 방지 할 수 있습니다. 가위 블레이드 사이에, 단두대에 적절하게 머리를 놓습니다. 동물의 목을 벨. </li><li> 접시에 쥐 장소 머리가 짓 눌린 얼음에 보관. 얼음 조각 (4 ℃로)에 조직 분리를위한 모든 절차를 수행합니다. </li><li> 잘라 열린 SKULL 가위로 조심스럽게 잡아 당겨과 아래 조직을 토막 피함으로써 뼈 rongeurs과 뼈 덮개를 분리합니다. </li><li> 두개골의 바닥과 뇌의 후방 복부 표면 사이의 주걱의 플랫 블레이드를 놓고 조심스럽게 뇌가 천천히 올라 해제 될 때까지 부드럽게 두개골의 바닥을 따라 앞으로 블레이드를 밀어 두개골에서 뇌를 분리 두개골. 두개골을 폐기하십시오. </li><li> 는 등의 표면에 두뇌를 놓습니다. 시상 하부 (소뇌의 앞에 구조)를 확인하고 그 앞쪽 끝과 후방 끝 뒤에 앞에 coronally 뇌를 잘라; 다른 용도로 필요하지 않은 경우 뇌의 앞쪽과 뒤쪽 부분을 폐기합니다. </li><li> 바로 옆에있는 시상 하부에, 좌우, 측두엽 아래에 작은 구체로 amygdalas을 시각화. </li><li> 멀리 실험에서, 그 정면 끝 등의 표면을 뇌 플랫 플립. </li><li> 뇌의 왼쪽 또는 오른쪽으로 시작합니다. 헤미을 분리다음 분야와 인접 편도체의 피질. 편도의 분리를 허용하려면이 느슨한 피질의 방법에 대한 8mm를 잘라. 메스와 편도체를 버려야. </li><li> 그것을 통해 실행하는 어두운 봉합, 거의 절반의 절반을 따라 절단하여 centromedial 부분에서 편도의 기저 부분을 분리합니다. 이 구조는 항상 쉽게 식별 아니다. </li><li> 별도의 확인 된 유리 병에 편도체의 하위 부분을 넣고 짓 눌린 된 얼음에 보관하십시오. </li><li> 다른 반구와 반복 해부 절차. </li><li> 1 분 동안 액체 질소에 튜브를 담근다. 필요할 때까지 -80 ° C의 냉동고에 병을 보관하십시오. </li></ol> 3. 카스파 제 3 활동 <ol><li> 수크로오스 0.32 M, 1 % 트리톤 X-100, 트리스 -HCl, pH가 8, 에틸렌 디아민 테트라 아세트산의 5 mm의 디티 오 트레이 톨의 2 mm의 페닐 메틸 설 포닐 플루오 라이드로부터 1mm, 류 펩틴 10 μg의 μL / 10 mm의 용해 완충액을 제조 , 펩 스타틴 A의 10 μg의 / μL과 아프로 티닌의 10 μg의 / μL. </li><li>각 샘플 (5-10 mg)을에 용해 버퍼 150 μl를 추가합니다. 얼음에 보관하십시오. 최대 강도 (40 W)에서 5 초 동안 얼음에 각각의 샘플을 초음파 처리. 30 분 동안 얼음에서 용해 완충액에서 조직을 배양한다. 와류에서 5 분 동안 각각의 샘플. </li><li> 교대 액체 질소에서 37 ° C로 설정 자동 온도 제어 가열판에 샘플을 놓고 3 냉동 / 해동 사이클을 수행한다. 13,000g에서 원심 분리기 조직 (4 10 분 동안 ° C). 조심스럽게 상층 액을 제거하고 얼음에 튜브를 유지. </li><li> 소 혈청 알부민으로 0 및 10 ㎍ / ml이다 표준 단백질 농도를 준비한다. 전용 버퍼 공백을 준비합니다. </li><li> 각 표준에 브래드 포드 시약 200 μl를 추가합니다. 595 nm에서 표준 읽기. 단백질 수준, 증류수 795 μL 및 브래드 포드 시약 200 μL를 샘플의 상등액 5 μL를 추가한다. 595 nm에서 각각의 샘플을 읽고 표준 곡선과 단백질을 정량화. </li><li> 5 밀리미터의 MgCl 2에 50 mM Tris-HCl, pH 7, &lt;와 반응 완충액을 제조/ 서브&gt;, 에틸렌 글리콜 디아민 테트라 아세트산의 1 mm의 3 0.1 % cholamidopropyl) dimethylammonio] -1- 프로판 디티 오 트레이 톨 및 1 mm이다. </li><li> 양성 및 음성 반응 샘플들을 획득하기 위해 반응 완충액 및 카스파 제 -3 기질에 25 μg의 단백질을 추가한다. 음의 샘플은, 단백질 25 μg의, AC-DEVD 초 800 μm의 0.4 μL와 AC-DEVD-AMC 10 mm의 0.8 μL, 반응 버퍼를 추가합니다. 긍정적 인 샘플의 경우, 반응 버퍼에 단백질 25 μg의와 AC-DEVD-AMC 10 mm의 0.8 μl를 추가합니다. 세중의 모든 부정과 긍정적 인 샘플을 처리합니다. 반응 버퍼를 추가하여 200 μL까지 각 샘플의 최종 부피를 완료합니다. </li><li> AC-DEVD-CHO 800 μM, 0.5 μL, 0.8 μL AC-DEVD-AMC 10 mM 내지 용해 완충액 10 μL에 반응 완충액 중 188.7 μl를 첨가함으로써 네거티브 컨트롤을 생성한다. 양성 대조군의 경우, 반응 버퍼의 189.2 μL, AC-DEVD-AMC 10 mm의 0.8 μL 및 용해 버퍼의 10 μl를 추가합니다. </li><li> 샘플을 품어37 O ℃에서 3 시간 동안 어둠 속에서 컨트롤 </li><li> 각 샘플 및 제어에 600 μL 글리신 0.4 M NaOH를 0.4 M (PH 10)과의 반응을 중지합니다. </li><li> 465 내지 365 nm이고, 발광 파장의 여기 파장에 의해 형광 spectrofluorometry 정량화. 유리 큐벳의 반응에 증류수 2 ㎖를 추가합니다. 각 초에 1 포인트 10 초 동안 제어 및 샘플을 참조하십시오. </li><li> 각 샘플의 특정 활동을 정량화 : ((음 샘플 마이너스 긍정적 인 샘플의 형광) 2.8 ml를 X 볼륨의 형광) (단백질 25 mg을 배양 3 시간의 X 양의 시간)으로 나눈 값입니다. </li></ol>

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</ol>

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지난 10 년 동안이 프로토콜을 사용하여 우리의 경험은 중요한 방법 론적 문제의 식별되었다. 첫째, 짓 눌린 된 얼음에 페트리 접시에 빠른 뇌 해부 준비 품질을 유지하는 것이 중요하다. 둘째, 조직은 초음파 등의 심장 (10 초)과 같은 조직의 유형, 또는 신장 (20 초)에 비해 뇌에 대한 편도체 짧다고 실현되어야한다. 셋째, 큰 관심을 신중 샘플에 추가하기 전에, 기판을 혼합주의해야한다. 혼합 순서가 불충분 한 때 우리는 변수 신호가 발생했습니다. 샘플을 판독 할 때 제, 기포는 석영 셀에 존재할 수 없어야한다. 그렇지 않으면, 신호가 변경 될 수있다. 1 μL 미만의 체적을 피하기 위해 기판 ​​부피가 증가 : 우리는 결과의 재현성을 높이기 위해 지난 몇 년 동안 변화했다. 여전히 작은 변화는 연속 분석법 사이에서 발생할 수 있고, 적어도 3 개의 시료를 제어하는​​ 데 사용되어야변화를 제어 할 수 있습니다. 이러한 컨트롤 형광 측정 평균화하고, 평균 100 %로 설정된다. 실험 샘플의 형광 측정은 대조 시료의 퍼센트로 변환된다. 기술의 또 다른 한계는 따라서, 카스파 제 -3 활성을 과소 평가 될 수있는 조직의 일부만이 사용되도록하고. 실제로, 아폽토시스의 시간 윈도우는 임의의 주어진 셀 짧게 중이며 1,4,15 샘플링시의 인접 지역에서 발생하더라도 누락 될 수있다. 반대의 경우도 가능하다 : 세포 사멸은 카스파 제 -3 활동의 과대 평가 결과, 조직의 부분에서 특히 강렬한 될 수 있습니다. 우리는 TUNEL 분석 또는 Bax의 /에서 Bcl2 비율 (소개를 참조하십시오)와 같은 보완적인 기술에 대한 잔여 조직 (편도)의 사용을 권장합니다. Spectrofluorometry 웨스턴 블로 팅을 통해 적어도 두 가지 장점이 있습니다. 첫째, 직접 정량 데이터를 생성한다. 둘째, 효소를 측정ctivity 자체보다는 무관 할 수 있으며,이 단백질의 발현은 효소 활성의 변화없이 증가 할 수 있음을 공지 된 단백질 또는 RNA 발현. 또한, spectrofluorometry는 다른 조직 또는 다른 동물 종으로 수행 될 수 있고, 다른 기판에, 다른 카스파 아형에 대해 조절 될 수 있으므로, 그 비교는 안전 할 수있다. 결론적으로,이 문서는 세포 사멸 3 일 심근 경색 후 변연계의이 지역에서 발생하는 증거를 제공하는 편도체에서 카스파 제 -3 활성을 측정하는 spectrofluorometry을 사용하는 방법을 보여줍니다.

카스파 또는 시스테인 의존 아스 파르 테이트 지시 단백질 분해 효소는 다양한 항상성 processess 1에 관여하는 효소의 가족입니다. 카스파는 크게 아폽토시스 또는 염증의 역할에 따라 분류 될 수있다. 카스파-1, -4, -5 -12가 세포 사멸에 종사하는 사람들이있을 수있는 반면 염증에 관여하는 하위 분류 기자 카스파​​로 (카스파 제 8 -9)와 사형 집행 인의 카스파 (카스파 제 -3, -6 및 -7 ). 심근 경색 (MI) 또는 뇌허혈 후 관찰 카스파는 주로 세포 사멸이 과도 할 수있다 질환에 많은 병리에 중요한 역할을한다. 우리의 실험에 사용 된 후 MI 증후군의 쥐 모델에서, 카스파 제 -3은 심근 2뿐만 아니라 분위기 3-6과 감정의 제어에 연루되는 변연계에서뿐만 아니라 활성화되어 있음을 수립한다. 또한, 카스파 제 -3은 상이한 영역에서 활성화되는 것을 알 수있다변연계의 같은 편도체와 해마, 허혈성 모욕 4 후 3 일 주변이 활성화 피크로. 흥미롭게도, 카스파 제 -3 활성은 MI 후 행동 장애와 상관 관계 및 약리 및 영양 개입을 통해 감쇠는 카스파 제 -3 및 사후 MI 우울증 7-12 사이의 가능한 링크를 제안,이 부상을 줄일 수 있습니다. 카스파 제 -3 활성은 다양한 기법에 의해 측정 될 수있다. 웨스턴 블 롯팅은 카스파의 특성을 파악한 후 효소 활성 효소뿐만 아니라 프로 효소 형태를 검출 할 수있다. 웨스턴 블 롯팅은, 그러나, 반 정량적이고, 작은 변화는 약한 신호 - 대 - 잡음 비율 (13)을 통해 손실 될 수있다. 더 나은 기술이 형광 화합물을 해제하고 spectrofluorometry 의해 측정 될 수 카스파 제 (3)에 의한 기판 (DEVD-AMC)의 절단에 기초한다. 카스파 제 -3 활성화는 세포 사멸의 신뢰할 수있는 마커입니다. 세포 사멸의 CA의 측정N의 발생 시간 윈도우가 짧기 때문에 불안정하고, 인접 셀은 세포 자멸 소체 세포 또는 14 phagocytize 있었다. 아폽토시스는 또한 이러한 백스 / 같이 사멸 시그널링 캐스케이드 (6), 또는 항 - 세포 사멸 / 프로 단백질의 비율에 의한 DNA 단편화를 검출하는 그러한 터미널 데 옥시 뉴 클레오 타이 딜 트랜스퍼 dUTP 닉 엔드 (nick end) 표지화 (TUNEL) 분석과 같은 다른 기술들에 의해 확인 될 수있다 BCL2 6.

<table><tbody><tr><td>분광플루오로미터</td><td>광자 기술 기기 (현재 Horiba)</td><td>Ratiomaster M-40</td><td>with DeltaRAM&nbsp; 랜덤 액세스 모노크로메이터&nbsp;</td></tr><tr><td>인공 호흡기</td><td>하버드 장치</td><td>683</td><td>작은 동물 환기</td></tr><tr><td>유리 큐벳</td><td>NSG 정밀 셀</td><td>3G10</td><td>광학 유리 (340-2,500 nm) 10 mm 경로</td></tr><tr><td>초음파 발생기</td><td>Cole Parmer</td><td>4710&nbsp; 시리즈</td><td></td></tr><tr><td>분광계</td><td>Varian</td><td>Cary 50 Bio</td><td></td></tr></tbody></table>

심근 경색 후 spectrofluorometry에 의해 측정 된 쥐 편도체에서 카스파 제 3 활동

Caspase-3 Activity in the Rat Amygdala Measured by Spectrofluorometry After Myocardial Infarction

심근 경색 (MI)는 생리적 및 행동 수준에서 극적인 중장기 결과를 초래하지만, 관련된 메카니즘은 여전히​​ 불명확하다. 우리 연구소는 장애 심장 기능, 변연계의 신경 세포 손실,인지 결핍과 우울증의 행동 징후를 표시 MI 후 증후군의 쥐 모델을 개발했다. MI 후 삼일에 뾰족 - 신경 세포 수준에서 카스파 제 -3 활성화는 편도와 같은 다른 변연 지역에서 포스트 MI의 세포 사멸을 매개. 인지 및 행동 장애는 2-3주에게 포스트 MI를 표시하고 이러한 카스파 제 -3 활성의 조치를 통계적으로 상관 관계. 여기에 설명 된 프로토콜은 MI를 유도 편도 조직을 수집하고 spectrofluorometry를 사용 카스파 제 -3 활성을 측정하기 위해 사용된다. MI를 유도하기 위해, 하행 관상 동맥을 40 분간 폐색된다. 래트를 희생하고 편도선은 RAPI 격리 : 카스파 제 -3 활성의 평가를위한 프로토콜 3 일 후에 시작 MI뇌에서 DLY. 샘플은 신속하게 액체 질소에 냉동과 실제 분석 할 때까지 -80 ℃에서 보관됩니다. 카스파 제 -3 활성을 평가하기 위해 수행 spectrofluorometry 기법에 의해 측정 될 수있는 형광 화합물을 방출하여 카스파 제 -3 기질 (DEVD-AMC)의 절단에 기초한다. 방법론은 정량적 재현성하지만 필수 장비는 고가이고 샘플을 정량화하기위한 절차는 시간을 소모한다. 이 기술은 심장, 신장 같은 다른 조직에 적용될 수있다. DEVD-AMC 다른 카스파 제의 활성을 측정하기 위하여 다른 기판으로 대체 될 수있다.

편도 8 가짜 (제어) 및 삼일 허혈 / 재관류 프로토콜의 유도 후 8 MI 쥐에서 분리 하였다. 카스파 제 -3 활성은 활성 카스파 제 -3에 의해 절단하고 spectrofluorometry 의해 검출 될 수있는 형광 색소를 사용하여이 조직을 측정 하였다. 긍정과 부정 측정 (단계 3.11, 3.12 및 3.16 참조) 각 초에서 1 점으로, 10 초 동안 세중 수행하고 측정 하였다. 양성 및 음성 대조군의 차이를 산출하고,이 실험을 수행하는 동안 모든 조직에 대한 모의 차이의 평균을 100 %로 설정 하였다. MI 쥐의 결과는이 기준에 따라 조정하고, 그림 1은 최종 결과를 보여 그것은 가짜 (P &lt;0.05)에 비해 심근 경색 쥐에서 상당히 높은 활성을 나타냅니다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/53207/53207fig1.jpg" /> 도 1 카스파 제 -3MI 쥐의 편도체의 활동은, 100 % (그룹 당 8 쥐)로 설정, 가짜 컨트롤의 평균 활동의 백분율로 표시. * 상당한 집단 간 차이 (P &lt;0.05)를 나타냅니다. 데이터는 SEM ± 평균으로 표현된다.

심근경색(MI)은 심장 기능 손상뿐만 아니라 MI의 행동 결과에 관여하는 뇌 영역인 편도체의 세포사멸(apoptosis)을 동반합니다. 이 프로토콜은 MI를 유도하고, 편도체 조직을 수집하고, 그 안에서 세포사멸의 마커인 카스파제-3 활성을 측정하는 방법을 설명합니다.

심근 경색 후 Spectrofluorometry에 의해 측정 된 쥐 편도체에서 카스파 제 3 활동

Myocardial infarction (MI) has dramatic mid- and long-term consequences at the physiological and behavioral levels, but the mechanisms involved are still ...

이 실험 절차의 전반적인 목표는 분광형광광도법을 사용하여 심근경색 후 쥐의 편도체 내 caspase-3 활성을 측정하는 것입니다. 이 방법은 심근경색이 인지 능력, 정신 건강, 노화 과정 및 수면에 미치는 영향과 같이 행동 신경과학 분야의 주요 질문들에 대한 답을 제시할 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 간단하고 신속하며 신뢰할 수 있다는 점입니다.일반적으로 이 방법은 수술 및 조직 샘플링을 위한 정교한 손재주가 필요하기 때문에 처음 접하는 개인은 어려움을 겪을 수 있습니다. 본 절차의 시연은 저희 실험실의 연구원인 Kim Gilbert가 진행하겠습니다. 승인된 기관 프로토콜에 따라 마취를 유도한 후, 발가락 꼬집기 반사가 없는지 확인하여 마취가 적절히 되었는지 확인하십시오.쥐의 기관에 기관내관을 삽입하고, 체온을 37 °C로 유지하기 위해 가열 패드 위에 동물을 복와위로 배치합니다. 기관내관을 2% isofluorane을 공급하는 마취기에 연결합니다. 다음으로, 클로르헥시딘 글루코네이트와 이소프로필 알코올로 수술 부위를 소독합니다.그리고 건조함을 방지하기 위해 양쪽 눈에 안연고를 도포합니다. 수술 부위 주변에 멸균 구역을 만들기 위해 동물 위에 멸균 드레이프를 덮습니다. 그리고 동물 옆의 다른 멸균 구역에 필요한 멸균 수술 기구들을 배치합니다.다음으로, 10번 메스 날이나 가위를 사용하여 피부를 절개합니다. 가위나 지혈 겸자를 사용하여 근육 조직을 벗겨냅니다. 그 다음, 가위나 지혈 겸자를 사용하여 흉벽을 열고 흉부 견인기를 배치한 뒤, 지혈 겸자로 심낭을 엽니다.관상동맥 폐쇄를 유도하기 위해, 먼저 360 mm 길이의 4-0 실크 봉합사를 하행 관상동맥과 인접한 심근 조직 주위로 루프를 만들어 감습니다. 실크 봉합사의 양 끝을 14-gauge, 1.25 cm 길이의 플라스틱 튜브에 삽입합니다. 실크 봉합사의 양 끝을 잡아당기고 튜브를 동맥 쪽으로 밀어 넣어 동맥을 폐쇄합니다.지혈 집게로 플라스틱 튜브를 집어 폐쇄 상태를 고정하고 40분 동안 유지합니다. 40분 후, 지혈 집게를 제거하여 폐쇄를 해제한 다음, 유연한 튜브와 실크 봉합사를 제거합니다. 2-0 봉합사로 흉부를 봉합하고, 흉강을 통해 유연한 카테터를 삽입한 뒤 10 milliliter 주사기로 흉부의 공기를 뽑아내어 기흉을 방지합니다.근육은 4-0 실크 봉합사로, 피부는 3-0 실크 봉합사로 봉합합니다. 마지막 피부 봉합을 마무리하기 전, 10 mL 주사기와 카테터를 사용하여 흉강 내의 공기를 다시 한 번 제거합니다. 피부 봉합을 완료한 후 isofluorane 투여를 중단합니다.쥐를 깨끗한 케이지에 넣고 마취에서 회복되는 동안 모니터링하십시오. 8시간마다 반복 투여하여 진통제를 처방하십시오. 승인된 절차에 따라 동물을 인도적으로 안락사(참수)시킨 후, 쥐의 머리를 분쇄 얼음 위에 놓인 접시에 올리십시오.가위로 두개골을 엽니다. 그런 다음 론저(rongeurs)를 사용하여 아래쪽 조직이 손상되지 않도록 주의하며 뼈 조각들을 위로 끌어올려 분리합니다. 다음으로, 스패튤라의 평평한 날을 두개골 바닥과 뇌의 후복측 표면 사이에 배치하고, 날을 천천히 앞으로 밀어 뇌를 두개골에서 들어 올려 분리합니다.뇌를 등쪽 표면이 닿게 놓습니다. 소뇌 앞에 위치한 시상하부를 확인하고, 시상하부의 후단 앞쪽과 전단 뒤쪽에서 뇌를 관상면으로 절단합니다. 시상하부 바로 옆 측두엽 아래에 있는 두 개의 작은 구체 형태인 양측 편도체를 확인합니다.그런 다음 뇌를 전면부 쪽으로 납작하게 뒤집어 배측 표면이 실험자 반대 방향을 향하게 합니다. 다음으로, 양쪽 반구를 분리하고 연속적인 편도체에서 피질을 제거합니다. 편도체가 드러나면 메스로 편도체를 절제하여 제거합니다.편도체를 가로지르는 어두운 봉합선을 따라 절개하여 기저외측부와 중심내측부를 분리한 다음, 두 부분을 각각 라벨이 부착된 튜브에 담아 얼음 위에 둡니다. 효소의 변성을 막기 위해 이 단계는 가능한 한 빠르게 수행해야 합니다. 다른 반구에 대해서도 동일한 해부 과정을 반복한 후, 4개의 튜브를 모두 액체 질소에 1분 동안 담갔다가 -80°C 냉동고에 보관합니다.먼저 5~10 mg의 각 샘플에 150 µL의 용해 완충액(lysis buffer)을 얼음 위에서 첨가합니다. 각 샘플을 얼음 위에서 최대 강도로 5초 동안 초음파 처리(sonicate)합니다. 그 후 얼음 위에서 30분 동안 배양합니다.배양하는 동안 5분마다 5초 동안 샘플을 볼텍싱합니다. 그 다음, 샘플을 액체 질소와 37 °C로 설정된 정온 가열판에 번갈아 배치하여 동결-해동 사이클을 3회 수행합니다. 마지막 동결-해동 사이클 후에, 조직 샘플을 4 °C에서 1300 Gs로 10분 동안 원심분리합니다.다음으로, 상층액을 조심스럽게 흡입하여 얼음 위에 놓인 새 튜브로 옮깁니다. 서면 프로토콜의 지침에 따라 단백질 양을 정량한 후, 0.8 µL의 10 mM Ac-DEVD-AMC와 반응 버퍼가 들어 있는 반응 튜브에 단백질 25 µg을 추가하여 최종 부피를 200 µL로 맞춥니다. 음성 대조군 반응 시료의 경우, 25 µg의 단백질을 1 µL의 800 µM Ac-DEVD-CHO 및 0.8 µL의 10 mM Ac-DEVD-AMC와 혼합합니다.모든 시료와 대조군을 37 °C에서 3시간 동안 암소 배양합니다. 배양 시간이 지나면, 각 시료와 대조군에 pH 10의 0.4 M glycine 및 0.4 M sodium hydroxide 600 µL를 넣어 반응을 중단시킵니다. 유리 큐벳에 담긴 각 반응액에 증류수 2 mL를 추가합니다.분광 형광 광도법으로 형광을 정량합니다. 대조군과 시료를 1초 간격으로 10초 동안 측정합니다. 마지막으로, 현재 화면에 표시된 공식에 따라 각 시료의 비활성을 정량합니다.이 히스토그램은 심근경색을 겪은 쥐의 편도체 내 caspase-3 활성을 보여줍니다. 데이터는 100%로 설정된 가짜 수술 대조군의 평균 활성 대비 백분율로 표시되었습니다. 각 그룹은 8마리의 쥐로 구성되었습니다. 별표는 p 값이 0.05 미만인 그룹 간의 유의미한 차이를 나타냅니다.숙련되면, 심근경색 수술과 조직 샘플링 사이의 간격을 제외하고 이 기술은 7시간 이내에 완료할 수 있습니다. 이 영상을 시청한 후에는 쥐에서 심근경색을 유도하는 방법과 분광형광광도법을 사용하여 쥐의 편도체에서 caspase-3 활성을 측정하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

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연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

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심근 경색 후 Spectrofluorometry에 의해 측정 된 쥐 편도체에서 카스파 제 3 활동

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