심근 경색 후 Spectrofluorometry에 의해 측정 된 쥐 편도체에서 카스파 제 3 활동

이 실험 절차의 전반적인 목표는 분광형광광도법을 사용하여 심근경색 후 쥐의 편도체 내 caspase-3 활성을 측정하는 것입니다. 이 방법은 심근경색이 인지 능력, 정신 건강, 노화 과정 및 수면에 미치는 영향과 같이 행동 신경과학 분야의 주요 질문들에 대한 답을 제시할 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 간단하고 신속하며 신뢰할 수 있다는 점입니다.

일반적으로 이 방법은 수술 및 조직 샘플링을 위한 정교한 손재주가 필요하기 때문에 처음 접하는 개인은 어려움을 겪을 수 있습니다. 본 절차의 시연은 저희 실험실의 연구원인 Kim Gilbert가 진행하겠습니다. 승인된 기관 프로토콜에 따라 마취를 유도한 후, 발가락 꼬집기 반사가 없는지 확인하여 마취가 적절히 되었는지 확인하십시오.

쥐의 기관에 기관내관을 삽입하고, 체온을 37 °C로 유지하기 위해 가열 패드 위에 동물을 복와위로 배치합니다. 기관내관을 2% isofluorane을 공급하는 마취기에 연결합니다. 다음으로, 클로르헥시딘 글루코네이트와 이소프로필 알코올로 수술 부위를 소독합니다.

그리고 건조함을 방지하기 위해 양쪽 눈에 안연고를 도포합니다. 수술 부위 주변에 멸균 구역을 만들기 위해 동물 위에 멸균 드레이프를 덮습니다. 그리고 동물 옆의 다른 멸균 구역에 필요한 멸균 수술 기구들을 배치합니다.

다음으로, 10번 메스 날이나 가위를 사용하여 피부를 절개합니다. 가위나 지혈 겸자를 사용하여 근육 조직을 벗겨냅니다. 그 다음, 가위나 지혈 겸자를 사용하여 흉벽을 열고 흉부 견인기를 배치한 뒤, 지혈 겸자로 심낭을 엽니다.

관상동맥 폐쇄를 유도하기 위해, 먼저 360 mm 길이의 4-0 실크 봉합사를 하행 관상동맥과 인접한 심근 조직 주위로 루프를 만들어 감습니다. 실크 봉합사의 양 끝을 14-gauge, 1.25 cm 길이의 플라스틱 튜브에 삽입합니다. 실크 봉합사의 양 끝을 잡아당기고 튜브를 동맥 쪽으로 밀어 넣어 동맥을 폐쇄합니다.

지혈 집게로 플라스틱 튜브를 집어 폐쇄 상태를 고정하고 40분 동안 유지합니다. 40분 후, 지혈 집게를 제거하여 폐쇄를 해제한 다음, 유연한 튜브와 실크 봉합사를 제거합니다. 2-0 봉합사로 흉부를 봉합하고, 흉강을 통해 유연한 카테터를 삽입한 뒤 10 milliliter 주사기로 흉부의 공기를 뽑아내어 기흉을 방지합니다.

근육은 4-0 실크 봉합사로, 피부는 3-0 실크 봉합사로 봉합합니다. 마지막 피부 봉합을 마무리하기 전, 10 mL 주사기와 카테터를 사용하여 흉강 내의 공기를 다시 한 번 제거합니다. 피부 봉합을 완료한 후 isofluorane 투여를 중단합니다.

쥐를 깨끗한 케이지에 넣고 마취에서 회복되는 동안 모니터링하십시오. 8시간마다 반복 투여하여 진통제를 처방하십시오. 승인된 절차에 따라 동물을 인도적으로 안락사(참수)시킨 후, 쥐의 머리를 분쇄 얼음 위에 놓인 접시에 올리십시오.

가위로 두개골을 엽니다. 그런 다음 론저(rongeurs)를 사용하여 아래쪽 조직이 손상되지 않도록 주의하며 뼈 조각들을 위로 끌어올려 분리합니다. 다음으로, 스패튤라의 평평한 날을 두개골 바닥과 뇌의 후복측 표면 사이에 배치하고, 날을 천천히 앞으로 밀어 뇌를 두개골에서 들어 올려 분리합니다.

뇌를 등쪽 표면이 닿게 놓습니다. 소뇌 앞에 위치한 시상하부를 확인하고, 시상하부의 후단 앞쪽과 전단 뒤쪽에서 뇌를 관상면으로 절단합니다. 시상하부 바로 옆 측두엽 아래에 있는 두 개의 작은 구체 형태인 양측 편도체를 확인합니다.

그런 다음 뇌를 전면부 쪽으로 납작하게 뒤집어 배측 표면이 실험자 반대 방향을 향하게 합니다. 다음으로, 양쪽 반구를 분리하고 연속적인 편도체에서 피질을 제거합니다. 편도체가 드러나면 메스로 편도체를 절제하여 제거합니다.

편도체를 가로지르는 어두운 봉합선을 따라 절개하여 기저외측부와 중심내측부를 분리한 다음, 두 부분을 각각 라벨이 부착된 튜브에 담아 얼음 위에 둡니다. 효소의 변성을 막기 위해 이 단계는 가능한 한 빠르게 수행해야 합니다. 다른 반구에 대해서도 동일한 해부 과정을 반복한 후, 4개의 튜브를 모두 액체 질소에 1분 동안 담갔다가 -80°C 냉동고에 보관합니다.

먼저 5~10 mg의 각 샘플에 150 µL의 용해 완충액(lysis buffer)을 얼음 위에서 첨가합니다. 각 샘플을 얼음 위에서 최대 강도로 5초 동안 초음파 처리(sonicate)합니다. 그 후 얼음 위에서 30분 동안 배양합니다.

배양하는 동안 5분마다 5초 동안 샘플을 볼텍싱합니다. 그 다음, 샘플을 액체 질소와 37 °C로 설정된 정온 가열판에 번갈아 배치하여 동결-해동 사이클을 3회 수행합니다. 마지막 동결-해동 사이클 후에, 조직 샘플을 4 °C에서 1300 Gs로 10분 동안 원심분리합니다.

다음으로, 상층액을 조심스럽게 흡입하여 얼음 위에 놓인 새 튜브로 옮깁니다. 서면 프로토콜의 지침에 따라 단백질 양을 정량한 후, 0.8 µL의 10 mM Ac-DEVD-AMC와 반응 버퍼가 들어 있는 반응 튜브에 단백질 25 µg을 추가하여 최종 부피를 200 µL로 맞춥니다. 음성 대조군 반응 시료의 경우, 25 µg의 단백질을 1 µL의 800 µM Ac-DEVD-CHO 및 0.8 µL의 10 mM Ac-DEVD-AMC와 혼합합니다.

모든 시료와 대조군을 37 °C에서 3시간 동안 암소 배양합니다. 배양 시간이 지나면, 각 시료와 대조군에 pH 10의 0.4 M glycine 및 0.4 M sodium hydroxide 600 µL를 넣어 반응을 중단시킵니다. 유리 큐벳에 담긴 각 반응액에 증류수 2 mL를 추가합니다.

분광 형광 광도법으로 형광을 정량합니다. 대조군과 시료를 1초 간격으로 10초 동안 측정합니다. 마지막으로, 현재 화면에 표시된 공식에 따라 각 시료의 비활성을 정량합니다.

이 히스토그램은 심근경색을 겪은 쥐의 편도체 내 caspase-3 활성을 보여줍니다. 데이터는 100%로 설정된 가짜 수술 대조군의 평균 활성 대비 백분율로 표시되었습니다. 각 그룹은 8마리의 쥐로 구성되었습니다. 별표는 p 값이 0.05 미만인 그룹 간의 유의미한 차이를 나타냅니다.

숙련되면, 심근경색 수술과 조직 샘플링 사이의 간격을 제외하고 이 기술은 7시간 이내에 완료할 수 있습니다. 이 영상을 시청한 후에는 쥐에서 심근경색을 유도하는 방법과 분광형광광도법을 사용하여 쥐의 편도체에서 caspase-3 활성을 측정하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.