Name: 치료를 위해 혈액 망막 장벽 위반 및 잠재적 인 마약을 평가하는 급성 망막 모델 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-13T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 33 s
Description: 배우세요 저비용 ex vivo 급성 망막 모델을 사용하여 혈액-망막 장벽 손상을 평가하고 lipoxin A4 같은 잠재적 치료제를 선별하는 방법을. 이 기술은 신경퇴행성 질환 연구와 약물 개발에 활용됩니다.

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Bringhurst Meats(뉴저지주 베를린)는 돼지 눈알을 제공하는 데 진정한 도움을 준 것으로 인정받고 있습니다.

모든 프로토콜이 적용 어디에 기관 동물 관리 및 사용위원회의 정책을 준수하여 수행 하였다. 1. 준비 <ol><li> 75 %로 안정화 매체를 준비 둘 베코의 수정 독수리 중간 (DMEM), 25 % 행크스 &#39;균형 소금 솔루션 (HBSS). 사용할 때까지 -20 ° C에서 잘 나누어지는 및 저장을 섞는다. </li><li> 인산염 완충 식염수 (PBS)를 준비하고 고압 증기 멸균에 의해 소독. 실온에서 용액을 저장한다. 실험 (물론 당 5 ㎖) 전에 37 ° C로 PBS를 따뜻하게. </li><li> 10 %, 20 % PBS 및 30 % 수 크로즈를 준비한다. 개별적으로 살균에 대한 별도의 0.22 μm의 필터를 통해 모든 솔루션을 필터링합니다. 4 ° C에서 솔루션을 저장합니다. </li><li> 90 mM의 농도로 PBS에 히스타민 스톡 용액을 제조 하였다. 0.22 μM 필터를 통해 용액을 여과에 의해 멸균. 나누어지는 및 -80 ° C에서 솔루션을 저장합니다. 여러 동결 및 해동 사이클을 피하십시오. </li><li> 실험 전에 PBS에 신선한 4 % 파라 포름 알데히드 (PFA)를 확인합니다. 얼음에 놓습니다. 주의 : 흄 후드에서 PFA를 유지하고 적절한 보호 장비를 착용하십시오. </li><li> 안정화 매체 (망막 당 20 ml)에 녹여. 100 U / ml의 최종 농도로 페니실린 - 스트렙토 마이신을 추가한다. 실험 전에 인큐베이터에서 37 ° C의 매체 (망막 당 15 ㎖)의 따뜻한 부분입니다. 얼음 매체의 나머지를 남겨주세요. </li><li> 얼음에 HBSS (망막 당 10 ml)에 놓습니다. </li></ol> 2. 망막의 Organotypic 문화 <ol><li> 조직 문화 후드에 샘플을 전송합니다. 렌즈 주위를 절단하여 아이 컵을 엽니 다. 브러쉬를 사용하여 부드럽게 망막을 당겨없이 유리체 유머를 제거합니다. 조심스럽게 시신경 유두를 노출 브러시로 절단 가장자리에서 망막을 분리합니다. 광학 면도기와 신경과 망막을 해제 심한. </li><li> 페트리 접시에 망막을 전송하고 조심스럽게 차가운 HBSS를 사용하여 한 번 망막을 씻어. i에서 HBSS에서 샘플을 배치가전​​. 단계 2.1 및이 공정을 반복하여 필요한만큼의 망막 해부. </li><li> 대칭 면도칼로 절반 망막을 잘라. 부드럽게 안정화 미디어의 3 ㎖로 6 웰 플레이트에 샘플을 전송할 당 잘. 5 % CO 2를 함유하는 분위기 인큐베이터에서 37 ° C에서 30 분 동안 평형을 허용한다. </li><li> 단계 2.3에서 배양하는 동안 다음과 같은 시약을 준비 : 따뜻한 매체에서 원하는 농도 (450 μM)에 히스타민 원액을 희석. 250 NG / ㎖의 최종 농도로 배지에 (아르곤하에 저장 됨) LXA4을 녹인다. 참고 LXA4의 효과를 측정 할 때, 나머지 절반은 LXA4과 히스타민을 위해 사용되는 반면, 하나의 망막에서 절반이 히스타민 단독으로 사용된다. </li><li> 조심스럽게 안정화 매체를 기음과 각 웰 (물론 당 3 ㎖)에 준비된 매체를 추가합니다. 5 % CO 2를 함유하는 분위기 인큐베이터에서 1 시간 동안 37 ° C에서 샘플을 인큐베이션. </li><li> 린스한 번 따뜻한, 멸균 PBS에서 샘플. </li></ol> 3. 면역 염색에 대한 샘플을 준비 <ol><li> 접시에서 대기음 PBS. 4 % PFA (웰 당 3 ㎖)를 첨가하고 실온에서 15 분 동안 배양한다. </li><li> 빠르게 PFA를 대기음. 한 번 PBS를 사용하여 샘​​플을 씻어. 10 % 자당에 샘플 (물론 당 5 ml)에 전송하고 4 ℃에서 2 시간 4 품어. </li><li> 30 %의 자당 (물론 당 5 ㎖)에 샘플을 전송하고 4 ℃에서 하룻밤 배양한다. 작업 동결 매질을 20 % 수 크로스의 두 부분으로 상업용 냉동 매체의 일부를 혼합한다. 거품이 사라 공기까지 4 ° C 하룻밤 이상에서 그것을 둡니다. </li><li> 작업 동결 배지 샘플을 옮기고 실온에서 5 분 동안 평형을 허용한다. 사각형으로 각 망막 (5mm로 약 3mm)를 낸다. </li><li> 조심스럽게 원통형 용기 (약 1cm 반경 × 2 cm 고도) 디바이스에 포함 된 작업 동결 미디어에 샘플을 전송알루미늄 호일에서에 다루지. 망막 슬라이스와 액체 질소에서 그들을 동결 (절편에 망막의 단면을 제공하기 위해 지향) 수직 있는지 확인합니다. 사용할 때까지 -80 ° C에서 블록을 저장합니다. </li><li> 제 각각 14 μm의 두께 조각으로 그라 이오 스탯에 블록은 유리 슬라이드에 섹션을 탑재합니다. 사용할 때까지 -80 ° C에서 슬라이드를 저장합니다. </li></ol> 4. 면역 염색 <ol><li> 한 번에 5 % 자당 인산 완충액 (SPB, PBS에서 5 % 자당, 산도 7.4)와 섹션을 씻으십시오. 실온에서 1 시간 동안 (10 % 정상 염소 혈청과 0.5 % 트리톤 X-100으로 5 % SPB) 버퍼 블록의 섹션을 인큐베이션하여 비특이적 결합 부위를 차단. </li><li> 해당 차 항체 (슬라이드) 섹션을 품어 (1 희석 GFAP 또는 MAP2을, 500을 버퍼를 차단에서) 1 시간 동안. 솔루션을 대기음. 5 % SPB에 세 번 씻으십시오. 내생 IgG의 염색의 경우,이 단계를 건너 뜁니다. </li><li> 해당 SECON와 섹션을 품어1 시간 :하기 Dary 항체 (블로킹 완충액 800 Cyanine3 / FITC 접합 된 당나귀 항 - 마우스 / 항 - 토끼 IgG를는 1 희석). </li><li> 철저하게 5 % SPB 3 회 섹션을 씻으십시오. 매체 장착 DAPI를 함유 된 커버로 덮고에서 그들을 장착하여 현미경 샘플을 준비합니다. </li><li> 그룹에서 등, 드웰 시간, 레이저 강도, 게인 값과 동일한 매개 변수 아래 20X 렌즈를 통해 레이저 공 초점 현미경, 캡처 이미지를 사용. 525분의 488 나노 미터로 785분의 561 나노 미터로 (Cyanine3를 검출) 적색 채널, 447분의 408 나노 미터로 (DAPI를 검출) 및 녹색 채널 (FITC를 검출) 블루 채널의 여기 / 방출 파장을 설정 . </li></ol> 5. 이미지 분석 <ol><li> 다음 조건 (12)에 의하면 새는 혈관의 백분율을 정량화 : 카운트 부에서의면 내의 내피 세포 핵에서만 혈관 포함; 이 AG 표시되면 혈관 누설을 고려용기를 둘러싼 면역 염색의 radient. </li><li> 발현 수준을 결정하기 위해, 관심 영역을 선택하고, 화상 해석 소프트웨어를 사용하여 회색의 평균 값을 측정한다. </li><li> 프로세스의 폭을 측정하기 위해 처리 (예를 들어, 외부 핵 층 ONL) 구별되는 구역의 영역을 선택한다. 다음과 같은 프로세스가 볼과 연속 광학 필드를 선택합니다. , 미세한 설정에 따라 눈금 막대를 설정하는 과정에서 선을 그리고 측정을 수행합니다. </li><li> 프로세스의 연속성을 분석하기 위해, 관심의 선택 영역, 그 주변의 분산과, 각 화소를 대체함으로써 이미지의 에지를 강화 분산이라는 필터를 적용한 자동 콘트라스트 및 밝기를 조정 라인 카운트에 의해 카운트를 정규화 지역. </li><li> 두 꼬리 학생의 t의 -test를 사용하여 통계적 유의성을 계산합니다. * P &lt;0.05; **, P &lt;0.01; ***, P &lt;0.001. 피많은 수단으로 결과를 ± SEM. </li></ol>

<ol><li>Cunha-Vaz, J., Bernardes, R., Lobo, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood-retinal+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22J+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Blood-retinal barrier.</a> J Ophthalmol. 21, 3(2011).</li>
<li>Kim, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood-neural+barrier%3A+intercellular+communication+at+glio-vascular+interface%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biochem+Molec+Biol%22%5BJournal%5D)">Blood-neural barrier: intercellular communication at glio-vascular interface.</a> J Biochem Molec Biol. 39, 339-345 (2006).</li>
<li>Kumagai, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glucose+transport+in+brain+and+retina%3A+implications+in+the+management+and+complications+of+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes+Metab+Res+Rev%22%5BJournal%5D)">Glucose transport in brain and retina: implications in the management and complications of diabetes.</a> Diabetes Metab Res Rev. 15, 261-273 (1999).</li>
<li>Runkle, E. A., Antonetti, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+blood-retinal+barrier%3A+structure+and+functional+significance%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Molec+Biol%22%5BJournal%5D)">The blood-retinal barrier: structure and functional significance.</a> Methods Molec Biol. 686, Clifton, N.J. 133-148 (2011).</li>
<li>Takata, K., Hirano, H., Kasahara, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transport+of+glucose+across+the+blood-tissue+barriers%5BTitle%5D)+AND+%22Int+Rev+Cytol%22%5BJournal%5D)">Transport of glucose across the blood-tissue barriers.</a> Int Rev Cytol. 172, 1-53 (1997).</li>
<li>Goncalves, A., Ambrosio, A. F., Fernandes, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+claudins+in+blood-tissue+barriers+under+physiological+and+pathological+states%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Barriers%22%5BJournal%5D)">Regulation of claudins in blood-tissue barriers under physiological and pathological states.</a> Tissue Barriers. 1, 24782(2013).</li>
<li>Patton, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinal+image+analysis%3A+concepts%2C+applications+and+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Ret+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Retinal image analysis: concepts, applications and potential.</a> Prog Ret Eye Res. 25, 99-127 (2006).</li>
<li>Di Marco, L. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascular+dysfunction+in+the+pathogenesis+of+Alzheimer%27s+disease--A+review+of+endothelium-mediated+mechanisms+and+ensuing+vicious+circles%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol+Dis%22%5BJournal%5D)">Vascular dysfunction in the pathogenesis of Alzheimer's disease--A review of endothelium-mediated mechanisms and ensuing vicious circles.</a> Neurobiol Dis. 82, 593-606 (2015).</li>
<li>Nagele, R. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain-reactive+autoantibodies+prevalent+in+human+sera+increase+intraneuronal+amyloid-beta%281-42%29+deposition%5BTitle%5D)+AND+%22J+Alzheimer%27s+Dis%3A+JAD%22%5BJournal%5D)">Brain-reactive autoantibodies prevalent in human sera increase intraneuronal amyloid-beta(1-42) deposition.</a> J Alzheimer's Dis: JAD. 25, 605-622 (2011).</li>
<li>Goldwaser, E., Acharya, N., Nagele, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cerebrovascular+and+blood-brain+barrier+compromise%3A+A+mechanistic+link+between+vascular+disease+and+Alzheimer%27s+disease+subtypes+of+neurocognitive+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22J+Parkinsons+Dis+Alzheimer%27s+Dis%22%5BJournal%5D)">Cerebrovascular and blood-brain barrier compromise: A mechanistic link between vascular disease and Alzheimer's disease subtypes of neurocognitive disorders.</a> J Parkinsons Dis Alzheimer's Dis. 2, 10(2015).</li>
<li>Horton, N. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+three-photon+microscopy+of+subcortical+structures+within+an+intact+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Photonics%22%5BJournal%5D)">In vivo three-photon microscopy of subcortical structures within an intact mouse brain.</a> Nat Photonics. 7, (2013).</li>
<li>Sedeyn, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histamine+Induces+Alzheimer%27s+Disease-Like+Blood+Brain+Barrier+Breach+and+Local+Cellular+Responses+in+Mouse+Brain+Organotypic+Cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Res+Int%22%5BJournal%5D)">Histamine Induces Alzheimer's Disease-Like Blood Brain Barrier Breach and Local Cellular Responses in Mouse Brain Organotypic Cultures.</a> Biomed Res Int. 2015, 937148(2015).</li>
<li>Avdeef, A., Deli, M. A., Neuhaus, W. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAvdeef%2C+A+%22Blood-Brain+Barrier+in+Drug+Discovery%3A+Optimizing+Brain+Exposure+of+CNS+Drugs+and+Minimizing+Brain+Side+Effects+for+Peripheral+Drugs%22">Blood-Brain Barrier in Drug Discovery: Optimizing Brain Exposure of CNS Drugs and Minimizing Brain Side Effects for Peripheral Drugs</a>. Di, L., Kerns, E. H. , John Wiley & Sons, Inc. Ch. 10 188(2014).</li>
<li>Eigenmann, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+study+of+four+immortalized+human+brain+capillary+endothelial+cell+lines%2C+hCMEC%2FD3%2C+hBMEC%2C+TY10%2C+and+BB19%2C+and+optimization+of+culture+conditions%2C+for+an+in+vitro+blood-brain+barrier+model+for+drug+permeability+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Fluids+Barriers+CNS%22%5BJournal%5D)">Comparative study of four immortalized human brain capillary endothelial cell lines, hCMEC/D3, hBMEC, TY10, and BB19, and optimization of culture conditions, for an in vitro blood-brain barrier model for drug permeability studies.</a> Fluids Barriers CNS. 10, 33(2013).</li>
<li>Takeshita, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+in+vitro+blood-brain+barrier+model+combining+shear+stress+and+endothelial+cell%2Fastrocyte+co-culture%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">An in vitro blood-brain barrier model combining shear stress and endothelial cell/astrocyte co-culture.</a> J Neurosci Methods. 232, 165-172 (2014).</li>
<li>Alberghina, M., Lupo, G., Anfuso, C. D., Moro, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Palmitate+transport+through+the+blood-retina+and+blood-brain+barrier+of+rat+visual+system+during+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci+Lett%22%5BJournal%5D)">Palmitate transport through the blood-retina and blood-brain barrier of rat visual system during aging.</a> Neurosci Lett. 150, 17-20 (1993).</li>
<li>Hosoya, K., Yamamoto, A., Akanuma, S., Tachikawa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipophilicity+and+transporter+influence+on+blood-retinal+barrier+permeability%3A+a+comparison+with+blood-brain+barrier+permeability%5BTitle%5D)+AND+%22Pharm+Res%22%5BJournal%5D)">Lipophilicity and transporter influence on blood-retinal barrier permeability: a comparison with blood-brain barrier permeability.</a> Pharm Res. 27, 2715-2724 (2010).</li>
<li>Minamizono, A., Tomi, M., Hosoya, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+dehydroascorbic+acid+transport+across+the+rat+blood-retinal+and+-brain+barriers+in+experimental+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Pharm+Bull%22%5BJournal%5D)">Inhibition of dehydroascorbic acid transport across the rat blood-retinal and -brain barriers in experimental diabetes.</a> Biol Pharm Bull. 29, 2148-2150 (2006).</li>
<li>Serlin, Y., Levy, J., Shalev, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascular+pathology+and+blood-brain+barrier+disruption+in+cognitive+and+psychiatric+complications+of+type+2+diabetes+mellitus%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovasc+Psychiatry+Neurol%22%5BJournal%5D)">Vascular pathology and blood-brain barrier disruption in cognitive and psychiatric complications of type 2 diabetes mellitus.</a> Cardiovasc Psychiatry Neurol. 2011, 609202(2011).</li>
<li>Kolb, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+the+retina+works+-+Much+of+the+construction+of+an+image+takes+place+in+the+retina+itself+through+the+use+of+specialized+neural+circuits%5BTitle%5D)+AND+%22Am+Sci%22%5BJournal%5D)">How the retina works - Much of the construction of an image takes place in the retina itself through the use of specialized neural circuits.</a> Am Sci. 91, 28-35 (2003).</li>
<li>Ikram, M. K., Cheung, C. Y., Wong, T. Y., Chen, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinal+pathology+as+biomarker+for+cognitive+impairment+and+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurol+Neurosurgery+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Retinal pathology as biomarker for cognitive impairment and Alzheimer's disease.</a> J Neurol Neurosurgery Psychiatry. 83, 917-922 (2012).</li>
<li>Tan, Z., Ge, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amyloid-beta%2C+the+retina%2C+and+mouse+models+of+Alzheimer+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Amyloid-beta, the retina, and mouse models of Alzheimer disease.</a> Am J Pathol. 176, 2055(2010).</li>
<li>Serhan, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pro-resolving+lipid+mediators+are+leads+for+resolution+physiology%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Pro-resolving lipid mediators are leads for resolution physiology.</a> Nature. 510, 92-101 (2014).</li>
<li>Bucolo, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+topical+indomethacin%2C+bromfenac+and+nepafenac+on+lipopolysaccharide-induced+ocular+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pharm+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Effects of topical indomethacin, bromfenac and nepafenac on lipopolysaccharide-induced ocular inflammation.</a> J Pharm Pharmacol. 66, 954-960 (2014).</li>
<li>Edelman, J. L., Lutz, D., Castro, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Corticosteroids+inhibit+VEGF-induced+vascular+leakage+in+a+rabbit+model+of+blood-retinal+and+blood-aqueous+barrier+breakdown%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Corticosteroids inhibit VEGF-induced vascular leakage in a rabbit model of blood-retinal and blood-aqueous barrier breakdown.</a> Exp Eye Res. 80, 249-258 (2005).</li>
</ol>

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이 보고서에서 우리는 돼지 망막을 사용하여 BRB 기능 장애의 강력한 생체 외 급성 망막 모델을 제시합니다. 이 모델 시스템은 특별한 기기가 필요하지 않으며 대부분의 실험실 환경에서 쉽게 조정할 수 있습니다. 그러나 성공적인 결과를 얻으려면 몇 가지 단계에 세심한 주의가 필요합니다. 소스에서 안구를 얻은 후에는 4°C 또는 얼음 위에 보관하고 가능한 한 빨리 처리해야 합니다. 치료의 효과를 분석할 때 동일한 망막의 두 반쪽을 사용해야 합니다 - 절반은 실험 절차(기준선)로 인한 변화를 감지하고 다른 절반은 치료 효과를 감지합니다. 이 접근 방식은 또한 연령, 성별 및 건강과 같은 동물 변형에 대한 수정을 허용합니다. 
이 프로토콜은 M. musculus 및 B. Taurus 와 같은 다양한 종의 망막에 성공적으로 적용될 수 있습니다(데이터는 표시되지 않음). 상업용 돼지 안구를 사용하는 것은 동물을 유지하는 것에 비해 상당한 비용 ...

증거의 성장 몸은 혈액 망막 장벽 (BRB) 1-5과 혈액 뇌 장벽 (BBB) ​​6,7과의 유사성의 존재를 지원합니다. BBB를의 타협은 단단히 이러한 정신 착란 (10)로 인과 적 또는 알츠하이머 병 (AD)과 같은 만성 신경 퇴행성 질환에 대한 진단 마커로 8,9 급성 조건을 연결되어 있습니다. 잠재적 인 약물 표적에 대한 이러한 병리 및 발견에 기계적인 통찰력은 일반적으로 뇌의 제한된 액세스 및 네트워크 복잡함에 의해 방해된다. 이러한 생체 내 이미징 (11), 뇌의 Organotypic 문화 (12), 차 세포 배양 13, 14 및 공동 문화 시스템 (15)과 같은 대안이 생성되었습니다. 그러나, 이러한 모델의 대부분은 세포를 식별하는 특수 장비, 긴 실험 기간 또는 여러 개의 마커를 필요로한다. 기능적 및 구조적 및 BBB BRB 유사성뿐만 아니라 DY 간의 상관이 둘의 sfunctions는 16-19을 주장하고있다. 또한, 쉽게 액세스 잘 정의 세포 유형 및 적층 구조는 뇌 윈도우로 잘 특성화 망막 수있다. BBB를하고 BRB의 구조적 및 기능적 아이덴티티 상세히 비교 남아. 그러나, 망막 병증은 특히 BRB 파기는 또한 밀접 당뇨병 18-19 및 AD (21, 22)을 포함하는 다양한 질병의 진행과 연관되어있다. 따라서, BRB는 부전 시스템 메커니즘을 묘사 할뿐만 아니라 잠재적 인 약물 스크리닝뿐만 아니라 확립 관심사이다. 이 보고서에서, 단순 급성 망막 문화를 사용하여 프로토콜 가능 BRB 부전을 개발하고 제공됩니다. 증가 BBB 투과성 및 AD와 같은 병리학 적 변화는 히스타민, 프로 염증 중재자 (12)와 함께 배양 뇌의 Organotypic 문화에 설립되었습니다. 따라서, 표시 시스템에서, 히스타민은 APPL이었다BRB 부전을 유도하기 위해 생체 망막 문화 IED. 이러한 뮤스의 musculus과 보스 황소 같은 여러 종에서 망막은, 테스트되었습니다. 때문에 상업적 가용성 및 인체 조직에 유사에 신선한 돼지의 시선은 여기에보고 된 데이터를 제공하기 위해 사용되었다. 히스타민 및 / 또는 다른 약물과 배양 한 후 망막은 면역 글로불린 G (IgG의) 혈액의 주요 구성 요소 중 하나로서 여러 단백질 (12)에 대한 면역 염색으로 평가 처리 하였다; glial fibrillary 산성 단백질 (GFAP), 아교 활성화를위한 잘 알려진 마커; 및 미세 소관 - 관련 단백질 2 (MAP2), 미세 소관의 조립에 필수적인 신경 세포 특이 적 세포 골격 단백질. 또한, 망막의 적층 구조는 그 폭과 연속성의 변화로 뮐러 세포 및 신경절 세포의 처리를 상세하게 분석 할 수있다. 따라서, 몇 가지 추가 매개 변수의 영향을 평가하기 위해 사용할BRB 위반 초기 단계에서뿐만 아니라 잠재적 인 치료의 반전 효과를 평가하는. 혈관 누출 (이어진), 아교 세포의 활성화 및 신경 세포의 손상 응답이 프로토콜에서, 약물 스크리닝의 전위 반전 효과는 세 가지 관점에서 평가된다. 몇몇 정량화 방법은 예를 들어, 발현이 면역, 프로세스 및 인핸스먼트 필터에 의해 도시 신경 프로세스 연속성 폭 측정 강도에 의해 도시 된 바와 같이, 사용된다. 더 나은 방법을 설명하기 위해 결과를 해석하는 데 도움이, 폭신 (lipoxin) A4 (LXA4), 내생 적 염증 부상에 대한 응답과 내피 기능 장애 (23)를 감쇠에서 합성 된 화합물은 데모 용으로 선택되었다.

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>라이프 테크놀로지스&nbsp;</td><td>11965-092</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>라이프 테크놀러지&nbsp;</td><td>14170-112</td><td></td></tr><tr><td>설탕</td><td>J.T.Baker</td><td>4072-05</td><td></td></tr><tr><td>히스타민&nbsp;</td><td>시그마</td><td>H7125-1G</td><td></td></tr><tr><td>페니실린-스트렙토마이신&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PFA</td><td>전자 현미경 과학</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>냉동 매체&nbsp;</td><td>트라이앵글 바이오메디컬 사이언스</td><td>TFM-5</td><td></td></tr><tr><td>일반 염소 혈청&nbsp;</td><td>Rockland</td><td>D104-00-0050</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>GFAP 항체</td><td>Millipore</td><td>AB5804</td><td></td></tr><tr><td>MAP2 항체</td><td>EMD Millipore</td><td>MAB3418</td><td></td></tr><tr><td>FITC conjugated Donkey anti-rabbit IgG</td><td>Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.</td><td>711-095-152</td><td></td></tr><tr><td>Cy3 활용 당나귀 안티 마우스 IgG</td><td>Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.</td><td>715-165-150</td><td></td></tr><tr>DAPI <td>Vector Laboratories, Inc.</td>를<td>포함하는 마운팅 미디어</td><td>H-1200</td><td></td></tr><tr><td>레이저 컨포칼 현미경</td><td>니콘</td><td>이클립스 Ti 현미경</td><td></td></tr><tr><td>이미지J</td><td>국립 보건원</td><td>1.45s</td><td></td></tr></tbody></table>

치료를 위해 혈액 망막 장벽 위반 및 잠재적 인 마약을 평가하는 급성 망막 모델

An Acute Retinal Model for Evaluating Blood Retinal Barrier Breach and Potential Drugs for Treatment

혈액 망막 장벽 파괴를 개선할 수 있는 잠재적 치료법을 평가하기 위해 저렴하고 사용하기 쉽고 강력한 모델 시스템이 구축되었습니다. 염증 인자인 히스타민(histamine)은 혈관 밖에서 IgG의 양성 염색을 통해 배양된 망막의 혈관 무결성을 손상시키는 것으로 입증되었습니다. 히스타민 자체와 리폭신 A4와 같은 잠재적 치료제를 위한 후보 약물의 효과는 IgG 면역 염색을 통한 혈관 누출, GFAP 염색을 통한 뮐러 세포 활성화, MAP2 염색을 통한 신경 수상돌기의 변화라는 세 가지 매개변수를 사용하여 평가됩니다. 또한, 망막의 층상 조직은 뮐러와 신경절 세포의 폭과 연속성의 변화와 같은 과정을 자세히 분석할 수 있게 해줍니다. 제시된 데이터는 돼지 망막 배양에 관한 것이지만 이 시스템은 여러 종에 적용할 수 있습니다. 따라서 이 모델은 다양한 세포 유형에 대한 손상된 망막 혈관 무결성의 초기 효과를 조사하고 치료를 위한 잠재적 약물 후보를 평가할 수 있는 신뢰할 수 있는 도구를 제공합니다.

우리는 히스타민에 의해 유도 된 BRB 유출을 방지 할 수 잠재적 치료를 평가하는 저비용 시간 효율적이고 사용하기 쉬운 시스템을 제시한다. IgG의 제어 망막 (도 1a)의 용기 내에 구속되지만, 모델이 성공적으로 설정되었음을 확인 히스타민 노출 (도 1b)시 혈관 밖으로 유출. LXA4는 제시된 시스템의 BRB 위반에 대한 의약품에 대한 심사를 입증하기 위해 선택되었다. BRB 부전은 그 자체로 큰 영향 (그림 1C)가없는 LXA4 (그림 1D)로 치료에 감쇠. 환입 누출 혈관의 비율로 정량하고, 그 결과 상당한 (도 1E)이다. 다른 두 망막 세포 유형, 뮐러 아교 세포 (그림 2)와</str...

낮은 - 비용, 사용하기 쉽고 강력한 시스템은 히스타민에 의해 유도 된 혈액 망막 장벽 위반을 개선 할 수 잠재적 인 치료를 평가하기 위해 설립된다. 혈관 누수, 뮐러 세포 활성화 및 신경 프로세스의 연속성 잠재적 약물 폭신 (lipoxin) A4를 갖는 손상 응답 및 역전을 평가하기 위해 이용된다.

A low-cost, easy-to-use and powerful model system is established to evaluate potential treatments that could ameliorate blood retinal barrier breach. An ...

이 ex vivo 망막 모델 시스템의 전반적인 목표는 혈액-신경 장벽(blood neural barrier) 파괴를 개선하는 약물을 스크리닝하는 것입니다. 이 방법은 초기 단계의 사건들이 무엇인지, 그리고 해당 환자들의 치료에 도움이 될 수 있는 약물을 어떻게 스크리닝할 수 있는지와 같은 신경 퇴행성 질환 분야의 몇 가지 핵심 질문에 답을 줄 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 비용이 저렴하고 사용이 간편하며 속도가 빠르고 적용 가능성이 높다는 점입니다.일반적으로 이 방법에 익숙하지 않은 연구자들은 신뢰할 수 있고 재현 가능한 데이터를 얻는 것이 양질의 샘플을 제작하는 기술적 숙련도에 달려 있기 때문에 어려움을 겪을 수 있습니다. 우선, 여기서는 상업적 공급처에서 확보한 돼지의 망막을 사용합니다. 공급처로부터 조달한 후, 안구는 4°C 또는 얼음 위에 보관해야 하며 가능한 한 빨리 처리해야 합니다.조직 배양 후드 내에서 수정체 주변을 절개하여 안구 캡을 열어 해부를 시작합니다. 그 다음, 망막을 잡아당기지 않도록 주의하며 브러시를 사용하여 유리체를 조심스럽게 제거합니다. 브러시로 절개된 가장자리에서 망막을 부드럽게 분리하여 시신경 유두를 노출시킵니다.면도날로 시신경을 절단하고 망막을 분리합니다. 망막을 페트리 접시에 옮기고 차가운 HBSS를 사용하여 조심스럽게 한 번 헹굽니다. 샘플을 얼음 위의 HBSS에 둡니다.다음으로, 면도날을 사용하여 망막을 대칭적으로 절반으로 자릅니다. 처리가 필요한 경우, 망막의 한쪽 절반은 처리하고, 동일한 망막의 나머지 절반은 기준선을 설정하고 동물 간의 개체 차이를 보정하기 위해 처리해야 합니다. 샘플을 웰당 3 mL의 안정화 배지가 들어 있는 6웰 플레이트로 조심스럽게 옮깁니다.5% 이산화탄소가 포함된 대기의 인큐베이터에서 37°C로 30분 동안 망막을 평형화합니다. 배양 후, 안정화 배지를 조심스럽게 흡입하여 제거하고, histamine과 LXA4가 포함된 배지 3 mL를 각 웰에 추가합니다. 샘플을 1시간 더 배양합니다.따뜻한 멸균 PBS로 헹군 후, 각 웰에 4% PFA 3 mL를 넣고 상온에서 15분 동안 배양합니다. 배양 시간이 지나면 PFA를 빠르게 흡입하여 제거하고 샘플을 PBS로 한 번 헹굽니다. 웰에 10% sucrose를 넣고 4 °C에서 2~4시간 동안 배양합니다.다음으로, 10%sucrose를 30%sucrose로 교체하고 4°C에서 하룻밤 동안 배양합니다. 그 후, 상용 동결 배지와 20%sucrose를 1:2 비율로 혼합하여 작동 동결 배지를 만듭니다. 기포가 사라질 때까지 4°C에서 하룻밤 또는 그 이상 보관합니다.다음 날, 30% sucrose를 작동 동결 매질(working freezing medium)로 교체하고, 실온에서 5분 동안 평형을 맞춥니다. 평형 도달 후, 각 망막을 3mm x 5mm 직사각형 모양으로 다듬은 다음, 알루미늄 호일 실린더에 담긴 동결 매질에 망막 절편을 넣어 동결시킵니다. 절단 시 망막의 횡단면이 나타날 수 있도록 망막 절편을 수직으로 세운 뒤, 액체 질소에서 동결시킵니다.크라이오스탯(cryostat)을 사용하여 각 블록을 14 micron 두께의 절편으로 자르고, 절편을 유리 슬라이드에 부착합니다. 슬라이드는 사용 전까지 negative 80 degree Celsius에서 보관하십시오. 절편을 5%sucrose phosphate buffer(SPB)로 세척하여 면역염색을 시작합니다.그런 다음 절편과 블로킹 버퍼를 실온에서 1시간 동안 반응시켜 비특이적 결합 부위를 블로킹합니다. 이어서 적절한 1차 항체와 함께 절편을 1시간 동안 반응시킵니다. 1시간이 지나면 용액을 흡입하여 제거하고 5% SPB로 절편을 3회 세척합니다.그 후, 빛을 차단한 상태에서 해당 2차 항체와 함께 절편을 1시간 동안 배양합니다. 5% SPB로 절편을 3회 세척한 후, DAPI가 포함된 마운팅 용액으로 샘플을 마운팅하고 커버슬립으로 덮어 현미경 관찰을 준비합니다. 마지막으로, 공초점 현미경을 사용하여 이미지를 캡처합니다.돌기의 너비를 측정하려면 돋보기 도구를 사용하여 외핵층과 같이 돌기가 형성되어 있는 단면 영역을 선택하십시오. 그런 다음 이러한 돌기들이 보이고 연속적으로 이어져 있는 광학 시야를 선택하십시오. 메인 메뉴에서 분석 도구를 클릭한 다음 하위 메뉴에서 스케일 설정(set scale)을 클릭하여 현미경 설정에 맞게 스케일 바를 설정하십시오.메인 메뉴에서 선(line) 기능을 선택하고 공정 전체에 걸쳐 선을 그립니다. 메인 메뉴의 분석(analyze)을 클릭한 다음, 하위 메뉴의 측정(measure)을 클릭하여 측정을 수행합니다. 공정의 연속성을 분석하려면 메인 메뉴로 돌아가 다각형(polygon) 기능을 사용하여 내망상층(inner plexiform layer)을 관심 영역(region of interest)으로 선택합니다.분석(analyze)을 클릭한 다음 측정(measure)을 클릭하여 면적을 측정하십시오. 프로세스(process), 필터(filter), 변형(variants)을 순서대로 클릭하여 각 픽셀을 주변 변형값으로 대체함으로써 이미지의 경계선을 강화하십시오. 그 다음 이미지(image), 조정(adjust), 밝기 및 대비(brightness and contrast)를 클릭하고 하위 메뉴에서 자동(auto)을 클릭하여 대비와 밝기를 자동으로 조정하십시오.그런 다음 선의 개수를 셉니다. 이 이미지들에서 IGG 면역 반응성은 빨간색으로 나타납니다. 대조군에서는 IGG가 혈관 내로 국한되어 나타납니다.히스타민 처리군에서는 IGG가 혈관 밖으로 검출되며, 점선 원으로 표시된 누출 구름을 형성합니다. LXA4 처리군에서는 IGG가 다시 혈관 내로 제한됩니다. LXA4를 추가로 처리하면 히스타민에 의해 유도된 혈관 기능 저하가 회복됩니다.이 히스토그램은 테스트 그룹 간의 혈관 누출 백분율을 보여줍니다. 이 이미지들은 Muller 세포를 염색하는 GFAP의 면역염색 결과를 나타냅니다. 양성 염색은 망막 전반에 걸친 Muller 세포의 돌기 및 혈관 주변에서 확인됩니다.모든 그룹의 뮐러 세포 돌기 너비가 제시되었습니다. 히스타민 또는 LXA4를 단독으로 처리했을 때 돌기 너비가 감소했습니다. 그러나 두 시약을 함께 처리했을 때 돌기 너비가 회복되었습니다.이 이미지들에서는 MAP2에 대한 면역염색 결과가 제시되어 있습니다. 신경절 세포의 돌기 및 세포체에서 양성 염색이 관찰됩니다. 모든 그룹에서 연속적인 MAP2 양성 신경절 세포 돌기의 밀도가 제시되어 있습니다.히스타민 처리는 수지상 돌기의 연속성을 감소시키지만, LXA4는 유의미한 영향을 미치지 않습니다. 이 실험 숙달 후 적절히 수행한다면, 망막 개당 5분의 박리 시간, 6분의 처리 시간, 그리고 이어지는 절편 제작, 면역 염색 및 분석을 포함하여 3~5일 내에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 시도할 때는 신선한 조직과 적절한 대조군을 사용하는 것이 중요합니다.이 절차 이후에 라이브 이미징과 같은 다른 방법을 추가하여 칼슘 수치 및 미토콘드리아 특성의 실시간 변화를 추적할 수 있습니다. 이 영상을 시청하신 후에는 이 ex vivo 급성 망막 배양 모델을 사용하여 BRB 기능 장애를 유도하고, 손상 정도를 평가하며, 잠재적인 약물을 스크리닝하는 방법에 대해 충분히 이해하셨을 것입니다. 시청해 주셔서 감사드리며, 귀하의 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Medicine

의학

, 분리의 재현성 및 유지 높이 실험 망막 박리를 작성하고, 망막 하 출혈없이하는 망막 질환의 광 수용체 세포 손실의 병태 생리를 공부하고 잠재적 인 치료 개입을 평가하는 것이 중요합니다. 여기, 우리는 세부 사항에 이러한 방법을보고한다.

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당뇨병성 망막증은 실명의 주요 원인 중 하나입니다. 조직학, 혈액-망막 장벽 파괴 분석, 및 형광 혈관조영술은 망막의 병태생리학을 이해하는 데 유용한 기술이며, 이는 당뇨병성 망막병증에 대한 효율적인 약물 스크리닝을 더욱 향상시킬 수 있다.

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산화 스트레스 및 사이토카인과 같은 당뇨병/당뇨병성 망막병증 관련 모욕으로 인한 사망에 대한 망막 혈관의 복원력을 모니터링하기 위해 보호 분석법이 개발되었습니다.

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배우세요 저비용 ex vivo 급성 망막 모델을 사용하여 혈액-망막 장벽 손상을 평가하고 lipoxin A4 같은 잠재적 치료제를 선별하는 방법을. 이 기술은 신경퇴행성 질환 연구와 약물 개발에 활용됩니다.

치료를 위해 혈액 망막 장벽 위반 및 잠재적 인 마약을 평가하는 급성 망막 모델

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