치료를 위해 혈액 망막 장벽 위반 및 잠재적 인 마약을 평가하는 급성 망막 모델

낮은 - 비용, 사용하기 쉽고 강력한 시스템은 히스타민에 의해 유도 된 혈액 망막 장벽 위반을 개선 할 수 잠재적 인 치료를 평가하기 위해 설립된다. 혈관 누수, 뮐러 세포 활성화 및 신경 프로세스의 연속성 잠재적 약물 폭신 (lipoxin) A4를 갖는 손상 응답 및 역전을 평가하기 위해 이용된다.

이 생체 외 망막 모델 시스템의 전반적인 목표는 혈액 신경 장벽 파괴를 개선하는 약물을 스크리닝하는 것입니다. 이 방법은 초기 증상이 무엇인지, 이러한 환자를 치료하는 데 도움이 될 수 있는 약물을 어떻게 선별할 수 있는지와 같은 신경 퇴행성 질환 분야의 몇 가지 주요 질문에 답할 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 저렴하고 사용하기 쉽고 빠르고 적응력이 뛰어나다는 것입니다.

일반적으로 이 방법을 처음 접하는 개인은 신뢰할 수 있고 재현 가능한 데이터를 얻는 것이 좋은 샘플을 생성하기 위한 기술에 달려 있기 때문에 어려움을 겪을 것입니다. 상업적인 출처에서 얻은 첫 번째 돼지 망막이 여기에 사용됩니다. 출처에서 조달한 후 안구는 4도 또는 얼음 위에 보관하고 가능한 한 빨리 처리해야 합니다.

조직 배양 후드에서 렌즈 주위를 잘라 안구 캡을 열어 해부를 시작합니다. 그런 다음 브러시를 사용하여 망막을 당기지 않고 유리체액을 부드럽게 제거합니다. 브러시를 사용하여 절단된 가장자리에서 망막을 부드럽게 분리하여 시신경 디스크를 노출시킵니다.

면도칼로 시신경을 절단하고 망막을 풀어줍니다. 망막을 페트리 접시에 옮기고 차가운 HBSS를 사용하여 망막을 한 번 조심스럽게 헹굽니다. 샘플을 얼음 위에 HBSS에 놓습니다.

그런 다음 면도기를 사용하여 망막을 대칭으로 반으로 자릅니다. 치료가 필요한 경우 망막의 절반을 치료하고 동일한 망막의 나머지 절반을 처리하여 기준선을 설정하고 동물 변이를 교정해야 합니다. 샘플을 웰당 3ml의 안정화 배지가 들어 있는 6웰 플레이트로 부드럽게 옮깁니다.

인큐베이터에서 섭씨 37도에서 30분 동안 5%의 이산화탄소가 포함된 대기와 망막을 평형을 이룹니다. 배양 후 안정화 배지를 조심스럽게 흡인하고 히스타민과 LXA4를 함유한 배지 3ml를 각 웰에 첨가합니다. 샘플을 한 시간 더 배양합니다.

따뜻한 멸균 PBS로 헹군 후 각 웰에 3ml의 4%PFA를 넣고 실온에서 15분 동안 배양합니다. 배양 시간이 경과하면 PFA를 빠르게 흡입하고 PBS로 샘플을 한 번 헹굽니다. 웰에 10%자당을 넣고 섭씨 4도에서 2-4시간 동안 배양합니다.

다음으로, 10% 자당을 30% 자당으로 대체하고 섭씨 4도에서 밤새 배양합니다. 그런 다음 1개 부품 상업용 냉동 매체와 2개 부품 20% 자당을 혼합하여 작동 냉동 매체를 만듭니다. 기포가 사라질 때까지 하룻밤 동안 섭씨 4도에서 방치하십시오.

다음날, 30% 자당을 작동하는 냉동 매체로 교체하고 실온에서 5분 동안 평형을 이룹니다. 평형 후 각 망막을 3mm x 5mm 직사각형으로 자른 다음 알루미늄 호일 실린더에 들어 있는 냉동 매체에 넣어 망막 조각을 동결합니다. 절편 시 망막의 단면을 제공할 수 있도록 망막 절편이 수직인지 확인하고 액체 질소로 동결합니다.

저온 유지 장치의 각 블록을 14미크론 조각으로 절단하고 유리 슬라이드에 섹션을 장착합니다. 슬라이드를 사용할 때까지 섭씨 음의 80도에서 보관하십시오. 5% 자당 인산염 완충액 또는 SPB로 섹션을 세척하여 면역염색을 시작합니다.

그런 다음 절편을 배양하고 실온에서 1시간 동안 완충액을 차단하여 비특이적 결합 부위를 차단합니다. 다음으로, 적절한 1차 항체가 있는 절편을 1시간 동안 배양합니다. 시간이 경과하면 용액을 흡입하고 5% SPB로 섹션을 세 번 세척합니다.

그런 다음 빛으로부터 보호된 상태에서 해당 2차 항체와 함께 섹션을 1시간 동안 배양합니다. 5% SPB로 절편을 3회 세척한 후 DAPI가 포함된 배지에 장착하고 커버 슬립으로 덮어 현미경 검사를 위해 샘플을 준비합니다. 마지막으로 컨포칼 현미경을 사용하여 이미지를 캡처합니다.

프로세스의 너비를 측정하려면 돋보기 도구를 사용하여 외부 핵층과 같이 프로세스가 테스트되는 섹션의 영역을 선택합니다. 그런 다음 이러한 프로세스가 보이고 연속적인 광학 필드를 선택합니다. 메인 메뉴에서 분석 도구를 클릭한 다음 하위 메뉴에서 스케일 설정을 클릭하여 미시적 설정에 따라 스케일 바를 설정합니다.

메인 메뉴에서 line 기능을 선택하고 프로세스 전체에 선을 그립니다. 기본 메뉴에서 analyze(분석)를 클릭한 다음 하위 메뉴에서 measure(측정)를 클릭하여 측정을 수행합니다. 이 과정의 연속성을 분석하려면 메인 메뉴로 돌아가서 polygon 함수를 사용하여 내부 망상 계층을 관심 영역으로 선택하십시오.

분석을 클릭하여 면적을 측정한 다음 측정합니다. process, filter, variants를 차례로 클릭하여 각 픽셀을 이웃 변형으로 대체하여 이미지의 가장자리를 향상시킵니다. 그런 다음 이미지를 클릭하여 대비와 밝기를 자동으로 조정하고 밝기 및 대비를 조정한 다음 하위 메뉴에서 자동으로 조정합니다.

그런 다음 줄을 세십시오. 이 이미지에서 IGG 면역 반응성은 빨간색으로 표시됩니다. 대조군에서 IGG는 혈관 내에서 제한됩니다.

히스타민 그룹에서는 IGG가 혈관 밖에서 검출되어 점선 원으로 표시된 누출 구름을 형성합니다. LXA4 투여군에서는 IGG가 혈관 내에서 다시 제한됩니다. LXA4를 추가로 추가하면 히스타민에 의해 유도된 혈관의 기능을 복구할 수 있습니다.

이 히스토그램은 테스트된 그룹에서 누출된 혈관의 비율을 보여줍니다. 이 이미지에서는 Muller 세포를 염색하는 GFAP에 대한 면역 염색이 제시되어 있습니다. 양성 염색은 Muller 세포의 과정, 망막 전체, 혈관 주변에서 얻어집니다.

모든 그룹에서 Muller 세포 과정의 폭은 선물된다. 히스타민 또는 LXA4 단독 처리는 공정 폭을 줄였습니다. 그러나 두 시약을 함께 적용했을 때 공정 폭이 절약되었습니다.

이 이미지에서는 MAP2에 대한 면역염색이 제시되어 있습니다. 신경절 세포의 돌기와 세포체에서 양성 염색이 관찰됩니다. 모든 그룹에서 연속적인 MAP2 양성 신경절 세포 돌기의 밀도가 제시됩니다.

히스타민으로 처리하면 수지상 과정의 연속성이 감소하는 반면 LXA4는 큰 효과가 없습니다. 이 실험은 일단 숙달되면 3일에서 5일 이내에 완료할 수 있으며, 망막당 5분씩 박리, 6분은 치료, 절편, 면역염색 및 분석을 수행합니다. 이 절차를 시도하는 동안 새로운 조직과 적절한 대조군을 사용하는 것이 중요합니다.

이 절차에 따라 라이브 이미징과 같은 다른 방법을 추가하여 칼슘 및 미토콘드리아 특성 수준의 실시간 변화를 추적할 수 있습니다. 이 동영상을 시청한 후에는 이 생체 외 급성 망막 배양 모델을 사용하여 BRB 기능 장애를 일으키고, 손상을 평가하고, 잠재적 약물을 스크리닝하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 시청해 주셔서 대단히 감사드리며 실험에 최선을 다해 주십시오.