Name: 메서드 및 Adeno 관련 바이러스를 쥐의 정 맥 관리 및 중앙 신경 전달의 평가 대 한 팁 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-08-25T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 11 s
Description: 학습하세요 쥐의 중추신경계에 아데노관련바이러스 벡터를 이용한 광범위 유전자 전달 방법을. 이 기법은 말초 정맥 주사를 통해 뇌와 척수를 유전적으로 조작하여 신경계 질환 연구와 유전자 치료에 활용됩니다.

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이 작품은 ALS 협회, Karyopharm 치료제, Inc., Meira GTx, 토마스 Lawson을 우리는 감사에서 ALS 연구에 대 한 자선 기부에 의해 투자 되었다. 우리 감사 Elysse 과수원과도 나 Burney 조언과 훈련. JAS 거짓말 재단이 지원 하 고 건강의 국가 학회 GM103418를 부여 합니다.

모든 절차에 따라 적절 한 NIH 지침. 모든 절차는 동물 관리 및 사용 위원회 위조에 LSU 건강 과학 센터에 의해 승인 된 동물 프로토콜을 따 랐 다. 여성 Sprague-Dawley 쥐 나이의 6 주에는이 절차에 대 한 사용 되었다.
 1. 필요한 벡터의 복용량/볼륨 결정 <ol><li>무게 벡터 준비 titer (농도)를 기반으로 하는 주입 각 동물에 필요한 바이러스 성 벡터의 크기를 결정 하 쥐. 이전 쥐 CNS에에서 효율적인 식 성공 했습니다 벡터 복용량을 사용 하 여 (잭슨 외를 참조 하십시오. 6). 참고: AAV9 TDP-43 또는 AAV9 GFP, 전형적인 복용량은 3 × 10 13-1 x 10 14 벡터 게놈/kg 사이. 나이의 6 주에 젊은 성인 쥐 무게 약 150 g.</li>
	<li>체계적인 비교에 대 한 모든 동물에 kg 당 동등한 복용량을 확인합니다. 볼륨 표준 권고 주입 볼륨 (250 g 쥐 250-500 µ L)를 초과 하지 않는 확인 하십시오. 전형적인 주입 볼륨은 젊은 성인 쥐에 200 μ.</li>
</ol> 2. 준비 작업 역 <ol><li>필요한 모든 용품을 수집: 한 파라핀 영화 동물, 동물, 거 즈 패드 (2-3 동물 당) 당 하나의 알코올 준비 패드 당 (약 5 x 5 cm) 사각 피펫으로 팁, 그리고는 micropipette.</li>
	<li>70% 에탄올으로 표면 청소 작업 면을 준비 합니다. (~ 37 ° C) 낮은 설정 온도 아래로 열 패드를 놓습니다. 벤치 패드 난방 패드 위에 놓습니다.</li>
	<li>가스 마 취 (isoflurane) 준비합니다. 적절 한 산소와 절차에 대 한 마 취 가스를 확인 합니다. 70% 에탄올, 유도 약 실 및 마 취 마스크를 청소 하 고 벤치 패드에 마 취 마스크를 놓습니다.</li>
</ol> 3. 벡터를 준비 <ol><li>벡터 실 온에서 해 동 하 고 각 동물에 대 한 살 균 microcentrifuge 튜브 라벨.</li>
	<li>피펫으로 AAV의 볼륨에 결정 1.1 적절 한 관을 원하는 주입 볼륨 (여기, 200 μ)까지 볼륨 lactated 벨소리가지고 &#39; s 솔루션 또는 염 분.</li>
	<li>소용돌이 1-2에 대 한 샘플 펄스와 다음 펄스 5 원심 분리기 튜브의 하단에 샘플을가지고 s.</li>
	<li>피펫으로 튜브와 파라핀 영화의 광장에 쥐에 대 한 총 주입 볼륨.</li>
	<li>1 mL 주사기 30 게이지 바늘 위.</li>
	<li>는 파라핀 영화에 벡터에 아래로 향하게 하는 경사와 바늘을 놓습니다. 때까지 모든 바이러스 바늘과 주사기 주사기 플런저에 다시 당겨. 연습 쉽게 되는 바늘으로 공기 방울 그리기 않도록 주의 하십시오.</li>
</ol> 4. 쥐를 준비 <ol><li>1 L/min까지 산소 고 isoflurane 마 취 5%로 설정. 모든 연결 호스 및 자 지의 방향을 확인 하 여 가스 마 취 유도 챔버를 흐르는입니다 확인 하십시오.</li>
	<li>쥐 응답 하지 않는 때까지 약 3 분, 가스 마 취 유도 실에서 쥐를 장소.</li>
	<li>는 발가락을 곤란 하 게 하 여 마 취의 적절 한 깊이 확인 합니다. 발가락 핀치 후 발 또는 다리에 운동 되어야 합니다.</li>
	<li>Isoflurane 마 취 마 취의 유지 보수에 대 한 2%로 감소 하 고는 자 지를 조정 하는 마 취는 마 취 마스크를 흐르는.</li>
	<li>쥐 장소 &#39; s 마 취 마스크에서 코와 그것의 측면에 거짓말은 쥐를 조정.</li>
	<li>식별 측면 꼬리 정 맥. 
	참고: 약 10 2 o에서 측면 꼬리 정 맥 거짓말 &#39; 12 꼬리의 지 느 러 미 상단 시계 o &#39; 시계. 쥐의 측면에 누워와 측면 꼬리 정 맥 한다 직면 자책점</li>
	<li>는 알코올 준비 패드 주입 영역을 닦으십시오. 주사 부는 꼬리의 길이 아래로 2/3.</li>
</ol> 5. 벡터를 주입 <ol><li>단단히 잡고 꼬리 약간 한 손가락으로 주입 영역 위에 측면 꼬리 정 맥에 직접;이 정 맥을 팽창 합니다.</li>
	<li>빗면 위로 향하도록 정렬 같은 방향으로 보이는 꼬리 정 맥으로 바늘.</li>
	<li>을 피하기 위해 다른 한편으로는 꼬리를 잡고 고 꼬리 정 맥에 큰 관심을 복용 하는 동안 꼬리 정 맥을 통해 피부를 피어스.</li>
	<li>정상 혈액 흐름 수 있도록 꼬리 정 맥에서 압력을 풀어.</li>
	<li>정 맥에 바늘을 이동합니다. 바늘 꼬리 정 맥 구멍은 되도록 뒤로 당겨 약간 플런저 합니다. 정 맥에 바늘 있으면 바늘으로 혈액 흐름 것입니다.
	<li>조정 필요에 따라 바늘 <ol>입니다. 바늘을 안정, 사출 사이트 아래에 주사 부 위에 손을 이동 그리고 꼬리에 대 한 주사기의 끝을 잡고.</li>
	</ol></li> <li>꼬리 (약 20 µ L/s)에 벡터를 천천히 주입. 
	참고: 정 맥은 그것을 통해 벡터 흐름으로 색상을 잃을 수 있습니다. 징후는 솔루션 혈관 밖에 주입 했다 포함 blebbing, 벡터를 주입 하는 경우는 피부, 또는 저항의 창백. 연습으로, 여분 혈관 노출 최소화 될 수 있다.</li>
	<li>벡터를 투여 후 쥐에서 바늘을 제거 하 고 30-60 미에 대 한 출혈을 막기 위해 주사 사이트에 대 한 거 즈 패드를 눌러</li>
</ol> 6. 정리 <ol><li>해제는 isoflurane 마 취와 산소. 의식, 차릴 때까지 쥐를 모니터링 하 고 다음 그것의 감 금에 반환.</li>
	<li>신중 하 게 sharps 컨테이너에 모든 바늘을 배치합니다. 잠재적으로 오염 된 AAV 적절 한 생물 용기에 다른 모든 일회용 재료의 처분. 70% 에탄올과 작업 역 청소.</li>
</ol> 7. 평가 hindlimb 탈출 반사 참고: Hindlimb 적자 일반적으로 발생 하는 벡터 복용량에 따라 TDP-43 유전자 이동 후 2-6 주.
<ol><li>두 손가락으로 파편의 평면 클리어에는 쥐를 잡아 &#39; s는 몸에서 약 2 cm 꼬리. 앞 발은 쥐의 복 부 아래쪽을 보는 동안 걸려 때까지 쥐를 부드럽게 들어올립니다.
	<ol><li>수행 주간 과정에 걸쳐 실험 시간-유전자 이동 후 절차 (예를 들어, 유전자 이동 후 12 주까지). 
		참고:이 방법으로 또한 점수를 forelimb 적자 하지만 hindlimb 적자는이 모델을 사용 하는 벡터 복용량에 따라에서 발생할 가능성이 높습니다.</li>
	</ol></li> <li>하나 또는 둘 모두 hindlimbs 10 동안 중간 선 향해 닥 10 미 메모는 hindlimbs 관찰 s.</li>
	<li>반복 30 세 번의 총에 대 한이 테스트 시험 사이 s. 하나 또는 둘 모두 hindlimbs는 3 개의 시험의 각각에 대 한 꽉, 쥐 모터 역 기능을 보이고 있다. 경우에 모든 3 개의 시험에서 떨림 일관 된 어느 일방 또는 양자 hindlimb 적자 존재로 (주)에서 수동으로 데이터를 기록.</li>
</ol> 8. 평가 rotarod에 모터 기능 <ol><li>rotarod, 설정 하는 rotarod 아래 벤치 패드를 배치 하 고 2 분 이상 (속도 증가 ~0.3 rpm/s) 4-40 분당 회전 (rpm)를 가속 설정. 12 주 시간-과정, 2, 4, 8에서 주제를 실행 하 고 유전자 후 12 주 전송.</li>
	<li>허용 20 분에 대 한 테스트 룸에 두었던 쥐</li>
	<li>는 rotarod 처음으로 사용 하 여 쥐를 훈련 하는 먼저 4 rpm의 설정된 속도에서 rotarod 시작 다음는 rotarod에 쥐를 놓고. 쥐 4 rpm에서 한 전체 혁명에 대 한 걸 다음 가속을 시작 하 고 쥐 그것 떨어지 때까지 rotarod에 걸을 수 있도록. 쥐 적어도 40에 대 한 지속적으로 걸을 수 있을 때까지 훈련을 계속 s. 건강 한, 젊은 성인 쥐 쉽게 이러한 방식으로 훈련 될 것 이다.
	<ol><li>눈에 띄는 모터 손상 된 쥐의 경우는 기준 대기 시간 40의가을 달성에서 쥐를 되지 않을 수 있습니다 s, 쥐 rotarod 득점을 시작 하기 전에 3-5 교육 시도 제공.</li>
	</ol></li> <li>Rotarod 테스트를 시작 하는 쥐에는 rotarod 놓고는 rotarod의 가속을 시작. 참고 rotarod;에서 쥐가는 시간 이것은을에 대기 시간 이다. 쥐 120 후는 rotarod에 남아 경우 s,이 시점에서 세션 모자는 rotarod에서 쥐를 제거 하 고 120의가 대기 시간을 기록 s.</li>
	<li>테스트 3 재판의 총에 대 한 두 번 더 반복 합니다. 피로의 효과 최소화 하기 위해 떨어져 재판 적어도 5 분 간격. 3 시험의 점수를 평균 한다. 손상 되지 않은 성인 쥐 일반적으로의을에 평균 대기 시간을가지고 &#62; 40 s.</li>
	<li>장에 다시 쥐를 놓고 rotarod 및 70% 에탄올과 주변 지역 청소.</li>
</ol> 9. 소 뇌에 GFP 식의 정량화 <ol><li>Anesthetize 쥐 및 버퍼링 하는 인산 염 (PBS)와 다음 4% paraformaldehyde perfuse. 두뇌 및 척수를 dissect 하 고는 정착 액에 담가 하룻밤 조직 30% 자당 해결책에 그들을 이동. 평형, 후에 동결 단계 4 , , 5 6와 슬라이딩 톰 50 μ m 코로나 섹션 컷.</li>
	<li>는 Vermis, 소 뇌의 중앙 엽에에서 균등 하 게 배치 하는 소 뇌의 3-6 섹션을 선택 합니다. 신호를 최대화 하기 위해 GFP 레이블을 붙일. 1: 500에 GFP에 대 한 1 차적인 항 체를 사용 하 고 알 렉 사-488 활용 된 이차 항 체를 사용 하 여 1:300 4 , , 5 6의 희석에. 
	참고: 참조 참조 4 , , 5 6 자세히는 샘플링에 대 한 단면, 그리고 절차를 얼룩.</li>
	<li>낮은 배율 렌즈 현미경을 사용 하 여 관심의 정의 된 영역에 각 섹션을 photomicrograph. 2.5 X 목표 (0.12 없음)를 사용 하 여 필터 설정 10, 450-490/515-565 여기/방출). 카메라 설정 (노출 시간, 예를 들어, 2 s) 샘플 분석을 통해 동일. 다른 이름으로 저장 한. TIF 파일.</li>
	<li>널리 귀 공자 이미지 프로그램에는 photomicrograph를 열고; 2 개의 창이 열립니다. 닫기 창으로 표시 &#34; 인덱스 색상 &#34;.</li>
	<li>선택 &#34; 옵션 &#34;, 다음 &#34; 밀도 SliceŔ 그늘의 범위는 룩 업 테이블 (LUT) 창에 빨간색으로 표시 됩니다. 창에서 커서를 사용 하는 특정 GFP 라벨만 입력 하 고 일반적인 배경 이미지에 뽑 시작 중지. 
	참고:이 측정할 수를 photomicrograph에 형광 영역을 강조 표시 됩니다. 설정을은 구체적으로 모든 가시 형광 셀을 잡으려고 최적화 되어야 합니다. 연습으로,이 방법은 정확 하 게 특정 형광 강조 수 있습니다.</li>
	<li>형광 영역을 측정 하기 전에 먼저 올바른 단위 (픽셀)는 측정 인지 확인. 이렇게 하려면 &#34; 분석 &#34;, 다음 &#34; 설정 ScaleŔ 네 번째 줄 라고 한다 &#34; 단위 &#34;. 픽셀 픽셀 단위로 측정을 클릭을 선택 드롭-다운 목록에서 &#34; 확인 &#34;. 분석 옵션을 설정/해제 &#34; 인테리어 구멍 포함 &#34; 분석에서 몸 전체 세포의 포함 되도록.</li>
	<li>형광 면적 측정 클릭 &#34; 분석 &#34;을 클릭 하 고 &#34; 측정 &#34;. 이 값을 표시 하려면 &#34; 분석 &#34; 클릭 &#34; 표시 ResultsŔ 결과 창이 나타납니다. 라는 제목 아래 형광 영역 측정 될 것입니다 &#34; 지역 &#34;.</li>
	<li>측정에 걸쳐 표준화를 위해 LUT 창에서 강조 표시 된 값을 변경 하지 마십시오.</li>
	<li>모든 측정 기록 되었습니다, 일단 평균 (동물 당 3-6 절)에서 각 동물에 대 한 값입니다. 적절 한 통계 테스트를 사용 하 여 그룹 간의 transduced 영역 비교. 6</li></ol>

<ol><li>Foust, K., Nurre, E., Montgomery, C., Hernandez, A., Chan, C., Kaspar, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravascular+AAV9+preferentially+targets+neonatal+neurons+and+adult+astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Intravascular AAV9 preferentially targets neonatal neurons and adult astrocytes.</a> Nat. Biotechnol. 27 (1), 59-65 (2009).</li>
<li>Duque, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravenous+administration+of+self-complementary+AAV9+enables+transgene+delivery+to+adult+motor+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Ther%22%5BJournal%5D)">Intravenous administration of self-complementary AAV9 enables transgene delivery to adult motor neurons.</a> Mol. Ther. 17 (7), 1187-1196 (2009).</li>
<li>Gombash Lampe, S., Kaspar, B., Foust, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravenous+injections+in+neonatal+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Intravenous injections in neonatal mice.</a> J. Vis. Exp. (93), e52037(2014).</li>
<li>Wang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expansive+gene+transfer+in+the+rat+CNS+rapidly+produces+amyotrophic+lateral+sclerosis+relevant+sequelae+when+TDP-43+is+overexpressed%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Ther%22%5BJournal%5D)">Expansive gene transfer in the rat CNS rapidly produces amyotrophic lateral sclerosis relevant sequelae when TDP-43 is overexpressed.</a> Mol. Ther. 18 (12), 2064-2074 (2010).</li>
<li>Dayton, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+forelimb+impairment+in+rats+expressing+a+pathological+TDP-43+25+kDa+C-terminal+fragment+to+mimic+amyotrophic+lateral+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Ther%22%5BJournal%5D)">Selective forelimb impairment in rats expressing a pathological TDP-43 25 kDa C-terminal fragment to mimic amyotrophic lateral sclerosis.</a> Mol. Ther. 21 (7), 1324-1334 (2013).</li>
<li>Jackson, K., Dayton, R., Klein, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AAV9+supports+wide-scale+transduction+of+the+CNS+and+TDP-43+disease+modeling+in+adult+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Ther.+Methods+Clin.+Dev%22%5BJournal%5D)">AAV9 supports wide-scale transduction of the CNS and TDP-43 disease modeling in adult rats.</a> Mol. Ther. Methods Clin. Dev. 2, 15036(2015).</li>
<li>Jackson, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preservation+of+forelimb+function+by+UPF1+gene+therapy+in+a+rat+model+of+TDP-43-induced+paralysis%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Preservation of forelimb function by UPF1 gene therapy in a rat model of TDP-43-induced paralysis.</a> Gene Therapy. 22 (1), 20-28 (2015).</li>
<li>Jackson, K., Dayton, R., Deverman, B., Klein, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Better+targeting%2C+better+efficiency+for+wide-scale+neuronal+transduction+with+the+synapsin+promoter+and+AAV-PHP.B%5BTitle%5D)+AND+%22Front.+Mol.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Better targeting, better efficiency for wide-scale neuronal transduction with the synapsin promoter and AAV-PHP.B.</a> Front. Mol. Neurosci. 9, 116(2016).</li>
<li>Jackson, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Severe+respiratory+changes+at+end+stage+in+a+FUS-induced+disease+state+in+adult+rats%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Severe respiratory changes at end stage in a FUS-induced disease state in adult rats.</a> BMC Neuroscience. 17 (1), 69(2016).</li>
<li>Xu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CMV-beta-actin+promoter+directs+higher+expression+from+an+adeno-associated+viral+vector+in+the+liver+than+the+cytomegalovirus+or+elongation+factor+1+alpha+promoter+and+results+in+therapeutic+levels+of+human+factor+X+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">CMV-beta-actin promoter directs higher expression from an adeno-associated viral vector in the liver than the cytomegalovirus or elongation factor 1 alpha promoter and results in therapeutic levels of human factor X in mice.</a> Hum Gene Ther. 12 (5), 563-573 (2001).</li>
<li>Jackson, K., Dayton, R., Klein, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+vector+%26%2334%3Bmagic+bullet%26%2334%3B%3A+targeted+expression+in+the+central+nervous+system+after+peripheral+delivery+using+the+synapsin+promoter%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opin+Ther+Targets%22%5BJournal%5D)">Gene vector &#34;magic bullet&#34;: targeted expression in the central nervous system after peripheral delivery using the synapsin promoter.</a> Expert Opin Ther Targets. 20 (10), 1153-1154 (2016).</li>
<li>van Hulst, R., Klein, J., Lachmann, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gas+embolism%3A+pathophysiology+and+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Physiol.+Funct.+Imaging%22%5BJournal%5D)">Gas embolism: pathophysiology and treatment.</a> Clin. Physiol. Funct. Imaging. 23 (5), 237-246 (2003).</li>
</ol>

저자는 공개 없다.

다양 한 전달 경로 AAV 벡터에 대 한 테스트 되었습니다: 내부 parenchymal 내부-cerebroventricular, 내부 thecal, 정 맥, intranasal, 내부 근육, 등. 각 경로 특정 장점 뿐만 아니라 단점으로 할 수 있습니다. AAV의 성인 쥐의 꼬리 정 맥 행정은 CNS의 일관 된 변환 달성 하기 위한 신뢰할 수 있는 방법입니다. 주변 주입 방법 CNS 조직으로는 주입 정 맥의 소개를 방지 하 고 최소 침 습 이므로. 이 방법으로 얻을 수 있는 효율적인 CNS 식 기법의 가장 큰 장점은입니다. 다른 실용적인 장점은 주입 방법은 매우 빨리 처음부터 끝까지 동물 당 (약 10 분)와 꼬리 정 맥 주사는 매우 기술 및 따라서 신속 하 게 마스터 수 있습니다. 물론, 주요 단점은 AAV preps 1 x 1013 벡터 게놈/ml 미만입니다 경우 타당성 문제를 될 것입니다 높은 titer 벡터의 많은 필요 하다는 점입니다. 추가 기능을 대상으로 하는 벡터의 구체화,이 이렇게 유리한 임상 ...

왜냐하면 그들은 너무 신경 vivo에서 시험에 대 한 효율적인 재조합 형 adeno 관련 바이러스 (AAV) 벡터 CNS 연구를 위한 필수적인 도구는. AAV 벡터는 매우 다른 transgenes 및 단백질 isoforms, 다른 조직, 다른 호스트 종, 그리고 관리의 다른 노선 공부에 대 한 다양 한. 예를 들어, AAV 관리할 수 마우스 주변 기기로, 상대적으로 비-침략 적, 처음으로 신경 통해 CNS transduce를 정 맥 주사 설명 Foust 외 에 두 끼 외. Gombash 그 외 여러분 에 의해 (참조 정돈 종이 (2014))입니다. 1 , 2 , 3 이 유전자 납품 방법은 어느 녹색 형광 단백질 (GFP)를 효율적으로 표현 하 쥐에 사용 됩니다 또는 ALS 관련 단백질, 양자가 응답 CNS에서 43 kDa (TDP-43)의 DNA 묶는 단백질. 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 중요 한는 쥐에서 일 쥐의 생리 및 대사 매개 변수는 마우스에 비해 인 간에 게 가까이 있으며 행동 및 독물학 분석 실험 쥐를 위해 특별히 설계 된 때문입니다. 또한, 더 많은 유전자 변형 쥐 라인 제공 되고있다는 AAV 유전자 전달 연구에 이용 될 수 있다.
메서드는 쥐, 그리고 결과의 신속 하 고 신뢰할 수 있는 정량화에 광대 한 CNS 유전자 이동에 대 한 자세한. 대규모 CNS 변환 척수 전체 TDP-43으로 표현 하 여 쥐에서 ALS의 징후를 모방 하는 데 사용 됩니다. 방법은 TDP-43 벡터 잭슨 외 에 사용으로 젊은 성인 쥐의 꼬리 정 맥 주사 6 , 8 , 9 몇 주 후, TDP-43-유도 모터 적자는 승리 두 가지 방법으로: 반사와 데이 턴 외 에 잭슨 그 외 여러분 사용 rotarod 탈출 5 , 6 , 7 , 9 사후 분석, 제어 GFP 벡터에 대 한 소 뇌의 형광 영역으로 계산 됩니다 변환 효율 잭슨 외 에서 사용 되는 인덱스 6 , 8 소 뇌의 분석 주변 유전자 납품 후 CNS 변환의 정도의 신속 하 고 신뢰할 수 있는 색인 것을 입증 했다 고 주변 중앙 유전자 전송을 시도 하는 접근의 다양 한에 적용 해야 합니다.

<table><tbody><tr><td>Scale</td><td>Pelouze</td><td>SP5</td><td></td></tr><tr><td>Nalgene 버킷</td><td>Thermo Scientific</td><td>12014000</td><td>4000 mL</td></tr><tr><td>마이크로 원심분리기 튜브</td><td>USA Scientific</td><td>1615-5500</td><td></td></tr><tr><td>젖산 링거 용액</td><td>Baxter Healthcare</td><td>0338-0114-04</td><td></td></tr><tr><td>Mini vortexer</td><td>Fisher Scientific</td><td>128101</td><td></td></tr><tr><td>원심분리기</td><td>Eppendorf</td><td>22624415</td><td></td></tr><tr><td>Laboratory film</td><td>Bemis</td><td>PM996</td><td></td></tr><tr><td>1-mL 주사기</td><td>BD</td><td>309626</td><td>25g 바늘이 부착된 상태로 제공됩니다. 주입용 27-30g 바늘로 교체</td></tr><tr><td>30g 바늘</td><td>BD</td><td>305106</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Piramal Healthcare</td><td>66794-013-25</td><td>Isoflurane USP 250 mL</td></tr><tr><td>마취 마스크</td><td>Kopf Instruments</td><td>906</td><td></td></tr><tr><td>Gauze</td><td>Henry Schein</td><td>100-2524</td><td>2" x 2" (5cm x 5cm)</td></tr><tr><td>피펫 팁</td><td>USA Scientific</td><td>1111-0816</td><td></td></tr><tr><td>Micropipet</td><td>Gilson</td><td>4642080</td><td></td></tr><tr><td>가스 마취 기화기</td><td>SurgiVet</td><td>4214322</td><td>Classic T3</td></tr><tr><td>가스 마취 청소기</td><td>SurgiVet</td><td>32373B10</td><td>Enviro-PURE</td></tr><tr><td>가열 패드</td><td>Sears</td><td>17280</td><td></td></tr><tr><td>벤치 패드</td><td>VWR</td><td>56617-006</td><td></td></tr><tr><td>Rotarod</td><td>Panlab/Harvard Apparatus</td><td>76-0772</td><td>쥐 4마리/ 생쥐 4</td></tr>마리 <tr><td>70% 에탄올</td><td>Decon Laboratories, Inc.</td><td>2401</td><td>140 증거</td></tr><tr><td>70% 이소프로판올</td><td>VWR</td><td>89108-160</td><td></td></tr><tr><td>Scion Image</td><td>Scion Corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>GFP 태그 다클론 항체</td><td>Invitrogen</td><td>A11122</td><td>1차 항체 - 1:500 희석</td></tr><tr><td>AlexaFluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>A11070</td><td>2차 항체 - 1:300 희석</td></tr><tr><td>Axioskop 40 현미경</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

메서드 및 adeno 관련 바이러스를 쥐의 정 맥 관리 및 중앙 신경 전달의 평가 대 한 팁

Methods and Tips for Intravenous Administration of Adeno-associated Virus to Rats and Evaluation of Central Nervous System Transduction

정기적으로 interspaced 짧은 구조 반복 (CRISPR), optogenetics, cre lox 타겟팅, 등 클러스터 Adeno 관련 바이러스 (AAV) 벡터는 신경 과학에 키 시는. 이 원고의 목적은 AAV의 꼬리 정 맥 주입을 통해 쥐에 광대 한 중앙 신경 시스템 (CNS) 유전자 전송을 시도 하는 탐정을 원조 하기 위하여. 대규모 식 광범위 한 병 리, 조건에 대 한 관련 이며 쥐 모델은 중요 한 그것의 큰 크기와 쥐에 비해 인 간에 게 생리 적인 유사성 때문입니다. 이 예제에서는 응용 프로그램에서 대규모 신경 전달 전체 척수, 루 경화 증 (ALS)에 영향을 미치는 신경 질환을 모방 하는 데 사용 됩니다. 효율적인 대규모 CNS 변환 전 임상 연구에서 치료 단백질 요소를 전달 하기 위해 사용할 수 있습니다. 몇 주 후 주입 식 간격 후 변환의 효과 평가 됩니다. 녹색 형광 단백질 (GFP) 제어 벡터에 대 한 소 뇌에 GFP 양의 기본적인 이미징 프로그램에 의해 신속 하 고 안정적으로 추정 된다. ALS에 의해 유도 모터 질병 고기 관련 단백질 양자가 응답 43 kDa (TDP-43)의 DNA 묶는 단백질, 적자 탈출 반사와 rotarod에 의해 득점 된다. 질병 모델링 및 유전자 치료, 대규모 진 여기에 설명 된 대상에 대 한 다양 한 잠재적인 신청이 있다. 이 메서드를 사용 하 여 확장 된 가설 신경 과학에서 neurogenetics 테스트를 신속에 도움이 됩니다.

TDP-43 유도 모터 장애 AAV TDP-43 사용 (그림 1)의 복용량에 따라 2-6 주 이내에 발생 한다. 실패 한 꼬리 정 맥 주사 될 부분 또는 없음; AAV 효과 생산 하기 위해 혈 류를 도달 해야 합니다. AAV GFP의 성공적인 주입 벡터 복용량 의존 방식으로 뇌와 척수에 걸쳐 GFP 식에서 발생 합니다. 드라이브 식, 세포 치킨 베타 걸 하이브리드 발기인, CAG 발기인 라고도 강한 재조합 발기인을 사용 하는 경우 CNS 간, 심장 등 다른 여러 조직에 효율적인 표현이 이다. 4 , 5 , 10 내 쥐 CNS, AAV9 또는 AAV PHP를 사용 하는 경우. B 벡터, 패턴은 주로 신경 전달만 스파스, 산발적 glial 변환. <sup ...

쥐에서 대규모 중앙 신경 유전자 배달 방법 적용 됩니다. 이 예제에서는 목적은 전체 척수에 영향을 미치는 질병을 모방 이다. 광범위 한 변환, 주변 관리에서 CNS에 치료 단백질을 전달 하기 위해 사용할 수 있습니다.

메서드 및 Adeno 관련 바이러스를 쥐의 정 맥 관리 및 중앙 신경 전달의 평가 대 한 팁

Adeno-associated virus (AAV) vectors are a key reagent in the neurosciences for clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR), ...

이 아데노 부속 바이러스(adeno-associated virus) 벡터 유전자 전달의 전반적인 목표는 쥐의 뇌와 척수를 광범위한 규모로 유전적으로 조작하는 것입니다. 이 방법은 유전자 전달 분야의 핵심적인 질문들에 대한 답을 찾는 데 도움을 줄 수 있습니다. 이는 생체 내(in-vivo)에 유전자를 도입하는 매우 효율적인 방법이며, 따라서 매우 강력하고 다용도로 활용 가능한 기술입니다.이 절차는 신속하며 재현성이 매우 높습니다. 저희는 여러 논문을 통해 쥐의 척수 전체에 근위축성 측삭 경화증 관련 단백질을 발현시키기 위해 이 광범위한 유전자 전달 방식을 사용해 왔습니다. 제 동료인 Robert Dayton이 해당 절차를 시연하겠습니다.Mychal Grames가 Robert를 도울 것입니다. 먼저 70% ethanol로 표면을 닦아 워크스테이션을 준비하십시오. 그 다음 작업 영역에 히팅 패드를 배치하고 온도를 37 degree celsius로 설정하십시오.가열 패드 위에 벤치 패드를 놓습니다. 시술에 필요한 산소와 이소플루레인이 충분한지 확인합니다. 유도 챔버와 마취 마스크를 70% ethanol로 세척하고, 마취 마스크를 벤치 패드 위에 놓습니다.동물당 약 5 x 5 cm 크기의 파라핀 필름 한 장, 알코올 솜 한 개, 거즈 패드 두세 개, 피펫 팁 및 마이크로피펫이 준비되었는지 확인하십시오. 그다음, 벡터를 실온에서 해동하고 동물별로 사용할 멸균 마이크로원심분리 튜브에 라벨을 부착하십시오. 필요한 양의 AAV를 해당 튜브에 피펫팅하고, 젖산 링거액 또는 식염수를 사용하여 원하는 주입 용량까지 부피를 맞추십시오.샘플을 1~2초간 볼텍싱한 후, 5초 동안 짧게 원심분리하여 샘플을 튜브 바닥으로 모읍니다. 전체 주입 부피를 튜브에서 파라핀 필름의 사각형 영역 위로 파이펫팅하여 옮깁니다. 그다음, 1mL 주사기에 30게이지 바늘을 장착합니다.파라핀 필름 위의 벡터에 바늘의 사면이 아래를 향하도록 배치합니다. 모든 바이러스가 바늘과 주사기 안으로 들어올 때까지 주사기 플런저를 뒤로 당깁니다. 마취 시스템을 사용하여 쥐를 적절히 마취합니다.발가락을 꼬집었을 때 반응이 없는 것을 통해 마취 수준이 적절한지 확인하십시오. 그런 다음, 쥐를 작업 영역에 옆으로 눕히고 노즈콘을 사용하여 마취 상태를 유지하십시오. 쥐가 옆으로 누운 상태에서 한쪽 측면 꼬리 정맥이 위를 향하게 됩니다.주사 부위는 꼬리 길이의 2/3 지점입니다. 알코올 솜으로 주사 부위를 닦아냅니다. 주사 부위보다 약간 위쪽의 꼬리를 단단히 잡고, 손가락 하나를 외측 꼬리 정맥 바로 위에 올려 정맥을 확장시킵니다.베벨(사면)이 위를 향하게 하여, 바늘을 육안으로 확인되는 꼬리 정맥과 같은 방향으로 정렬합니다. 꼬리를 잡고 있는 다른 쪽 손이 꼬리 정맥을 누르지 않도록 각별히 주의하면서, 꼬리 정맥 위의 피부를 뚫습니다. 꼬리 정맥에 가해진 압박을 풀어 정상적인 혈류가 흐르도록 합니다.그다음 바늘을 정맥 안으로 이동시킵니다. 바늘이 꼬리 정맥을 관통했는지 확인하기 위해 플런저를 약간 뒤로 당깁니다. 바늘이 정맥 내에 제대로 위치했다면 혈액이 바늘 안으로 흘러 들어옵니다.필요한 경우 바늘의 위치를 다시 조정한 후, 시린지의 끝부분을 꼬리에 밀착시켜 바늘을 고정합니다. 벡터를 초당 약 20 µL의 속도로 꼬리에 천천히 주입합니다. 주입이 제대로 이루어지지 않은 경우, 동물에게 부분적으로만 형질전환이 일어나 결과가 유용하지 않을 가능성이 높습니다.하지만 연습을 통해 숙달되면, 정교한 주사는 매우 재현 가능하고 신뢰할 수 있습니다. 벡터 주입이 완료되면 꼬리에서 바늘을 제거하고, 주사 부위를 거즈 패드로 30~60초 동안 눌러 지혈을 돕습니다. 그 다음 이소플루란 마취와 산소 공급을 중단합니다.쥐가 의식을 회복할 때까지 모니터링한 후 케이지로 돌려보냅니다. AAV에 오염되었을 가능성이 있는 재료는 적절한 생물학적 위험물 컨테이너에 폐기하고, 작업대를 70% ethanol로 닦아 냅니다. 냉동 스테이지가 장착된 슬라이딩 마이크로톰을 사용하여, AAV가 주입된 동물의 고정 및 동결 보호 처리된 뇌에서 50 micron 두께의 관상면 절편을 얻습니다.GFP 면역염색 후 슬라이드에 마운팅한 뒤, 현미경의 저배율 렌즈를 사용하여 정의된 관심 영역 내의 각 섹션을 사진 촬영합니다. 분석할 모든 샘플에 대해 카메라 설정을 동일하게 유지하고 데이터를 TIFF 파일로 저장하십시오. 널리 사용되는 Scion Image 프로그램을 통해 촬영한 사진을 엽니다.두 개의 창이 열리면 index color로 표시된 창을 닫으십시오. options를 선택한 후 density slice를 선택하십시오. 룩업 테이블(look up table) 창에 색조 범위가 빨간색으로 표시됩니다.창에서 커서를 사용하여 특정 GFP 라벨링 영역만 채우고, 이미지에서 비특이적 배경이 잡히기 시작하면 멈춥니다. 다음으로 analyze를 클릭하고 scale을 설정합니다. 네 번째 줄의 units 항목에서 드롭다운 목록을 통해 pixels를 선택한 후 okay를 클릭합니다.형광 면적을 측정하려면 'analyze(분석)'를 클릭한 다음 'measure(측정)'를 클릭하십시오. 그런 다음 'analyze(분석)'와 'show results(결과 보기)'를 클릭하십시오. 결과 창이 나타나며, 형광 면적 측정값은 'area(면적)'라고 표시된 항목 아래에 나타납니다.모든 측정값이 기록되면, 동물당 3~6개 구역의 평균값을 구합니다. 적절한 통계 테스트를 사용하여 그룹 간의 형질전환 영역을 비교하십시오. 이 대표 이미지는 AAV 9 GFP를 꼬리 정맥에 주입한 4주 후 쥐의 소뇌에서 나타난 GFP 면역형광을 보여줍니다.이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 형광 영역을 선택적으로 강조하고 강조된 픽셀의 수를 정량화하였습니다. 이것은 형질전환되지 않은 동물의 GFP 이미지입니다. GFP가 주입된 동물과 동일한 파라미터를 사용하여 이 이미지를 분석한 결과, 매우 낮은 수준의 배경 신호가 검출되었습니다.숙달되면 쥐 한 마리당 약 5분 이내에 주사를 완료할 수 있습니다. 결론적으로, 이 기술은 쥐의 CNS에 유전자를 효율적으로 도입하는 방법을 설명하며, 한 번의 유전자 전달로 지속적인 발현과 장기적인 효과를 유도합니다. 가장 중요한 점은 말초에서 중추 신경계를 조절할 수 있다는 것입니다.비교적 비침습적인 정맥 내 벡터 주입은 뇌와 척수, 즉 중추신경계(CNS)에 도달합니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

여기서 우리는 시각 피질의 뉴런과 glia의 형광 라벨에 대한 AAV 벡터의 intracranial 주사를 제시한다.

Adeno - 관련 바이러스성 벡터의 Intracranial 분사

이 비디오는 파킨슨병을 모델링하기 위해 쥐의 흑질에 바이러스 벡터를 주입하는 과정을 보여줍니다. 쥐를 준비하고, 바이러스 벡터를 흑질에 미세주입하는 단계와 회수 절차를 간략하게 설명합니다.

신경퇴행성 질환 모델링을 위한 Rat substantia nigra에 바이러스 벡터 주입

출처: Li, D., et al. 성인 마우스에서 재조합 아데노 관련 바이러스의 직접 척수강내 주사. J. Vis. 경험. (2019년)이 비디오는 깨어 있는 마우스의 뇌척수액(CSF)에 아데노 관련 바이러스(AAV)를 척수강내 주사하는 절차를 보여주며 주사기 준비, 척추 정렬 및 정확한 바늘 삽입을 다룹니다. 이 방법은 표적 유전자 전달을 검증하여 CNS 치료의 잠재력을 뒷받침합니다.

중추신경계 질환 치료를 위한 마우스 모델에서 바이러스의 척수강내 전달

출처: Grames, MS, et al. 쥐에게 아데노 관련 바이러스의 정맥 투여 방법 및 팁 및 중추신경계 형질도입 평가. J. Vis. 경험. (2017년)이 비디오는 쥐에서 재조합 아데노 관련 바이러스(AAV)의 꼬리 정맥 주사를 보여줍니다. 외측 꼬리 정맥에 주입된 후 바이러스는 혈류로 들어가 심장을 순환한 후 뇌에 도달하여 뉴런으로 들어가 신경 치료 응용을 위한 표적 단백질 생산을 촉진합니다.

 쥐 모델에서 재조합 아데노 관련 바이러스 벡터의 정맥 투여 

여기서 우리는 신생아 마우스 뇌에 아데노 관련 바이러스를 뇌실 내 주입하여 광범위한 신경 세포 전달을 위한 기술을 보여줍니다.  이 방법은 바이러스로 전달된 transgenes의 평생 발현을 달성하는 빠르고 쉬운 방법을 제공합니다.

영구와 광범위한 신경 세포의 형질 도입에 대한 신생아 마우스 뇌의 뇌실 바이러스 감염

이 원고는 바이러스 벡터 매개 국소 유전자 전달이 어떻게 중추 신경계에서 전이 유전자를 발현하는 매력적인 방법을 제공하는지 설명합니다.  이 프로토콜은 파킨슨병에 대한 바이러스 벡터 기반 동물 모델을 개발하기 위해 쥐의 흑질에 바이러스 벡터 주입을 수행하기 위한 모든 중요한 단계를 설명합니다.

재조합 아데노 - 관련 바이러스 성 벡터의 정위 주사를 통해 파킨슨 병에 대한 알파 - 시누 클레인 기반 쥐 모델 개발

여기에 우리가 작은 동물에 게 효율적인 adeno 관련 바이러스 전달 되도록 하 여 중앙에서 변환 효율 예측 점수 시스템 구축 바이러스 솔루션에서 1 %lidocaine 염 산 염을 사용 하 여 직접 intrathecal 사출 기법 제시 lidocaine에 의해 유도 된 과도 함의 정도 따라 신경 시스템.

성인 쥐에 있는 재조합 형 Adeno 관련 바이러스의 직접 Intrathecal 주입

어린 쥐의 요추 수조에 주사를 놓는 수술 절차가 설명되어 있습니다. 이 접근법은 유전자 치료 벡터의 척수강내 전달에 사용되어 왔지만, 이 접근법은 세포 및 약물을 포함한 다양한 치료제에 사용될 수 있을 것으로 예상됩니다.

Intrathecal vector delivery in juvenile rats via lumbar cistern injection(요추 수조 주입을 통한 어린 쥐의 척수강내 벡터 전달)

이 원고는 최적화된 헤파린 기반 친화성 크로마토그래피 방법을 사용하여 아데노 관련 바이러스 벡터의 생성 및 정제를 위한 자세한 프로토콜을 설명합니다. 간단하고 확장 가능하며 비용 효율적인 접근 방식을 제시하여 초원심분리가 필요하지 않습니다. 생성된 벡터는 높은 순도와 생물학적 활성을 나타내며 전임상 연구에서 그 가치를 입증합니다.

단일 단계 및 반자동 Heparin Affinity Chromatography Protocol을 통한 Adeno-associated viral vectors 분리

여기에서는 성체 마우스에서 아데노 관련 바이러스(AAV)를 체계적으로 투여하기 위해 마우스 측면 꼬리 정맥 주입에 최적화된 프로토콜에 대해 자세히 설명합니다. 또한 AAV transduction을 평가하기 위해 일반적으로 사용되는 분석 프로토콜에 대해 설명합니다.

성체 마우스에서 측면 꼬리 정맥 주입을 통한 아데노 관련 바이러스의 일관된 전달

우리는 쥐에서 직접 미주신경 주사를 위한 프로토콜을 제시하여 주사 후 합병증 없이 신경으로 직접 약물을 전달할 수 있도록 합니다. 이 방법은 자율신경계 조작과 관련된 전임상 신경학적 연구에 적용됩니다. 필요한 수정을 통해 쥐 및 다른 종의 다른 신경에 대한 직접 신경 주입에 사용할 수 있습니다.

쥐를 위한 직접 미주신경 주사 프로토콜

학습하세요 쥐의 중추신경계에 아데노관련바이러스 벡터를 이용한 광범위 유전자 전달 방법을. 이 기법은 말초 정맥 주사를 통해 뇌와 척수를 유전적으로 조작하여 신경계 질환 연구와 유전자 치료에 활용됩니다.

메서드 및 Adeno 관련 바이러스를 쥐의 정 맥 관리 및 중앙 신경 전달의 평가 대 한 팁

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