메서드 및 Adeno 관련 바이러스를 쥐의 정 맥 관리 및 중앙 신경 전달의 평가 대 한 팁

이 아데노 부속 바이러스(adeno-associated virus) 벡터 유전자 전달의 전반적인 목표는 쥐의 뇌와 척수를 광범위한 규모로 유전적으로 조작하는 것입니다. 이 방법은 유전자 전달 분야의 핵심적인 질문들에 대한 답을 찾는 데 도움을 줄 수 있습니다. 이는 생체 내(in-vivo)에 유전자를 도입하는 매우 효율적인 방법이며, 따라서 매우 강력하고 다용도로 활용 가능한 기술입니다.

이 절차는 신속하며 재현성이 매우 높습니다. 저희는 여러 논문을 통해 쥐의 척수 전체에 근위축성 측삭 경화증 관련 단백질을 발현시키기 위해 이 광범위한 유전자 전달 방식을 사용해 왔습니다. 제 동료인 Robert Dayton이 해당 절차를 시연하겠습니다.

Mychal Grames가 Robert를 도울 것입니다. 먼저 70% ethanol로 표면을 닦아 워크스테이션을 준비하십시오. 그 다음 작업 영역에 히팅 패드를 배치하고 온도를 37 degree celsius로 설정하십시오.

가열 패드 위에 벤치 패드를 놓습니다. 시술에 필요한 산소와 이소플루레인이 충분한지 확인합니다. 유도 챔버와 마취 마스크를 70% ethanol로 세척하고, 마취 마스크를 벤치 패드 위에 놓습니다.

동물당 약 5 x 5 cm 크기의 파라핀 필름 한 장, 알코올 솜 한 개, 거즈 패드 두세 개, 피펫 팁 및 마이크로피펫이 준비되었는지 확인하십시오. 그다음, 벡터를 실온에서 해동하고 동물별로 사용할 멸균 마이크로원심분리 튜브에 라벨을 부착하십시오. 필요한 양의 AAV를 해당 튜브에 피펫팅하고, 젖산 링거액 또는 식염수를 사용하여 원하는 주입 용량까지 부피를 맞추십시오.

샘플을 1~2초간 볼텍싱한 후, 5초 동안 짧게 원심분리하여 샘플을 튜브 바닥으로 모읍니다. 전체 주입 부피를 튜브에서 파라핀 필름의 사각형 영역 위로 파이펫팅하여 옮깁니다. 그다음, 1mL 주사기에 30게이지 바늘을 장착합니다.

파라핀 필름 위의 벡터에 바늘의 사면이 아래를 향하도록 배치합니다. 모든 바이러스가 바늘과 주사기 안으로 들어올 때까지 주사기 플런저를 뒤로 당깁니다. 마취 시스템을 사용하여 쥐를 적절히 마취합니다.

발가락을 꼬집었을 때 반응이 없는 것을 통해 마취 수준이 적절한지 확인하십시오. 그런 다음, 쥐를 작업 영역에 옆으로 눕히고 노즈콘을 사용하여 마취 상태를 유지하십시오. 쥐가 옆으로 누운 상태에서 한쪽 측면 꼬리 정맥이 위를 향하게 됩니다.

주사 부위는 꼬리 길이의 2/3 지점입니다. 알코올 솜으로 주사 부위를 닦아냅니다. 주사 부위보다 약간 위쪽의 꼬리를 단단히 잡고, 손가락 하나를 외측 꼬리 정맥 바로 위에 올려 정맥을 확장시킵니다.

베벨(사면)이 위를 향하게 하여, 바늘을 육안으로 확인되는 꼬리 정맥과 같은 방향으로 정렬합니다. 꼬리를 잡고 있는 다른 쪽 손이 꼬리 정맥을 누르지 않도록 각별히 주의하면서, 꼬리 정맥 위의 피부를 뚫습니다. 꼬리 정맥에 가해진 압박을 풀어 정상적인 혈류가 흐르도록 합니다.

그다음 바늘을 정맥 안으로 이동시킵니다. 바늘이 꼬리 정맥을 관통했는지 확인하기 위해 플런저를 약간 뒤로 당깁니다. 바늘이 정맥 내에 제대로 위치했다면 혈액이 바늘 안으로 흘러 들어옵니다.

필요한 경우 바늘의 위치를 다시 조정한 후, 시린지의 끝부분을 꼬리에 밀착시켜 바늘을 고정합니다. 벡터를 초당 약 20 µL의 속도로 꼬리에 천천히 주입합니다. 주입이 제대로 이루어지지 않은 경우, 동물에게 부분적으로만 형질전환이 일어나 결과가 유용하지 않을 가능성이 높습니다.

하지만 연습을 통해 숙달되면, 정교한 주사는 매우 재현 가능하고 신뢰할 수 있습니다. 벡터 주입이 완료되면 꼬리에서 바늘을 제거하고, 주사 부위를 거즈 패드로 30~60초 동안 눌러 지혈을 돕습니다. 그 다음 이소플루란 마취와 산소 공급을 중단합니다.

쥐가 의식을 회복할 때까지 모니터링한 후 케이지로 돌려보냅니다. AAV에 오염되었을 가능성이 있는 재료는 적절한 생물학적 위험물 컨테이너에 폐기하고, 작업대를 70% ethanol로 닦아 냅니다. 냉동 스테이지가 장착된 슬라이딩 마이크로톰을 사용하여, AAV가 주입된 동물의 고정 및 동결 보호 처리된 뇌에서 50 micron 두께의 관상면 절편을 얻습니다.

GFP 면역염색 후 슬라이드에 마운팅한 뒤, 현미경의 저배율 렌즈를 사용하여 정의된 관심 영역 내의 각 섹션을 사진 촬영합니다. 분석할 모든 샘플에 대해 카메라 설정을 동일하게 유지하고 데이터를 TIFF 파일로 저장하십시오. 널리 사용되는 Scion Image 프로그램을 통해 촬영한 사진을 엽니다.

두 개의 창이 열리면 index color로 표시된 창을 닫으십시오. options를 선택한 후 density slice를 선택하십시오. 룩업 테이블(look up table) 창에 색조 범위가 빨간색으로 표시됩니다.

창에서 커서를 사용하여 특정 GFP 라벨링 영역만 채우고, 이미지에서 비특이적 배경이 잡히기 시작하면 멈춥니다. 다음으로 analyze를 클릭하고 scale을 설정합니다. 네 번째 줄의 units 항목에서 드롭다운 목록을 통해 pixels를 선택한 후 okay를 클릭합니다.

형광 면적을 측정하려면 'analyze(분석)'를 클릭한 다음 'measure(측정)'를 클릭하십시오. 그런 다음 'analyze(분석)'와 'show results(결과 보기)'를 클릭하십시오. 결과 창이 나타나며, 형광 면적 측정값은 'area(면적)'라고 표시된 항목 아래에 나타납니다.

모든 측정값이 기록되면, 동물당 3~6개 구역의 평균값을 구합니다. 적절한 통계 테스트를 사용하여 그룹 간의 형질전환 영역을 비교하십시오. 이 대표 이미지는 AAV 9 GFP를 꼬리 정맥에 주입한 4주 후 쥐의 소뇌에서 나타난 GFP 면역형광을 보여줍니다.

이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 형광 영역을 선택적으로 강조하고 강조된 픽셀의 수를 정량화하였습니다. 이것은 형질전환되지 않은 동물의 GFP 이미지입니다. GFP가 주입된 동물과 동일한 파라미터를 사용하여 이 이미지를 분석한 결과, 매우 낮은 수준의 배경 신호가 검출되었습니다.

숙달되면 쥐 한 마리당 약 5분 이내에 주사를 완료할 수 있습니다. 결론적으로, 이 기술은 쥐의 CNS에 유전자를 효율적으로 도입하는 방법을 설명하며, 한 번의 유전자 전달로 지속적인 발현과 장기적인 효과를 유도합니다. 가장 중요한 점은 말초에서 중추 신경계를 조절할 수 있다는 것입니다.

비교적 비침습적인 정맥 내 벡터 주입은 뇌와 척수, 즉 중추신경계(CNS)에 도달합니다.