메서드 및 Adeno 관련 바이러스를 쥐의 정 맥 관리 및 중앙 신경 전달의 평가 대 한 팁

이 아데노 관련 바이러스 벡터 유전자 전달의 전반적인 목표는 쥐의 뇌와 척수를 광범위하게 유전적으로 조작하는 것입니다. 이 방법은 유전자 전달 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이는 유전자를 생체 내에 도입하는 매우 효율적인 방법이며, 따라서 매우 강력하고 다재다능한 기술입니다.

이 절차는 빠르고 재현성이 높습니다. 우리는 여러 출판물에서 쥐의 척수 전체에 걸쳐 근위축성 측삭 경화증 관련 단백질을 발현하기 위해 이 광범위한 유전자 전달 접근법을 사용했습니다. 제 동료인 로버트 데이턴(Robert Dayton)이 시연을 할 것입니다.

Mychal Grames가 Robert를 도울 것입니다. 워크 스테이션을 준비하는 것으로 시작하여 먼저 70 % 에탄올로 표면을 청소하십시오. 그런 다음 작업 영역에 가열 패드를 놓고 섭씨 37도까지 따뜻하게 설정합니다.

가열 패드 위에 벤치 패드를 놓습니다. 시술에 적합한 산소와 이소플루란이 있는지 확인하십시오. 인덕션 챔버와 마취 마스크를 70% 에탄올로 세척하고 마취 마스크를 벤치 패드에 놓습니다.

동물당 약 5 x 5cm의 파라핀 필름 정사각형 1개, 알코올 준비 패드 1개, 동물당 거즈 패드 2개 또는 3개, 피펫 팁 및 마이크로피펫이 있는지 확인하십시오. 그런 다음 실온에서 벡터를 해동하고 각 동물에 대해 하나의 멸균 마이크로 원심분리기 튜브에 라벨을 붙입니다. 필요한 부피의 AAV를 적절한 튜브에 피펫으로 넣고 젖산 링거 용액 또는 식염수로 원하는 주입 부피까지 부피를 높입니다.

와류 후 샘플을 1초 또는 2초 동안 가열한 다음 5초 동안 원심 분리기를 펄스하여 샘플을 튜브 바닥으로 가져옵니다. 튜브에서 총 주입량을 파라핀 필름의 사각형에 피펫팅합니다. 다음으로, 1mm 주사기에 30게이지 바늘을 놓습니다.

베벨이 아래를 향하도록 바늘을 파라핀 필름의 벡터에 놓습니다. 모든 바이러스가 바늘과 주사기에 들어갈 때까지 주사기 플런저를 뒤로 당깁니다. 마취 시스템을 사용하여 쥐를 적절하게 마취합니다.

발가락 꼬집음에 대한 반응이 없도록 적절한 마취 평면을 보장합니다. 그런 다음 쥐를 작업장에 옆으로 눕히고 노즈 콘을 사용하여 마취를 유지합니다. 쥐가 옆으로 누워 있을 때 한쪽 꼬리 정맥이 위를 향해야 합니다.

주입은 꼬리 길이의 2/3 아래입니다. 알코올 조제 패드로 주사 부위를 닦습니다. 꼬리를 주입 부위보다 약간 위로 단단히 잡고 한 손가락을 측면 꼬리 정맥 바로 위에 올리면 정맥이 확장됩니다.

경사가 위를 향하게 하여 바늘을 보이는 꼬리 정맥과 같은 방향으로 정렬합니다. 꼬리 정맥 위의 피부를 뚫고 다른 손으로 꼬리를 잡고 꼬리 정맥을 누르지 않도록 세심한 주의를 기울입니다. 정상적인 혈류를 허용하기 위해 꼬리 정맥의 압력을 해제합니다.

그런 다음 바늘을 정맥으로 옮깁니다. 바늘이 꼬리 정맥을 뚫었는지 확인하려면 플런저를 약간 뒤로 당깁니다. 바늘이 정맥에 있으면 혈액이 바늘로 흘러 들어갑니다.

필요한 경우 바늘의 위치를 변경한 후 주사기 끝을 꼬리에 대고 바늘을 고정합니다. 초당 약 20마이크로리터의 속도로 벡터를 꼬리에 천천히 주입합니다. 주사가 불량한 경우, 동물은 부분적으로만 형질전환되며 결과는 아마도 유용하지 않을 것입니다.

그러나 연습을 통해 좋은 주사는 매우 재현 가능하고 신뢰할 수 있습니다. 벡터를 투여한 경우 꼬리에서 바늘을 제거하고 거즈 패드를 주사 부위에 대고 눌러 30-60초 동안 출혈을 막는 데 도움이 됩니다. 이소플루란 마취제와 산소를 끕니다.

쥐가 의식을 되찾을 때까지 관찰한 다음 우리로 되돌려 놓습니다. AAV로 오염되었을 수 있는 물질을 적절한 생물학적 위험 용기에 버리고 70% 에탄올로 워크스테이션을 청소하십시오. 동결 단계가 있는 슬라이딩 마이크로톰을 사용하여 AAV 주입 동물의 고정되고 극저온 보호된 뇌에서 50미크론 코로나 절편을 얻습니다.

GFP에 대한 면역 염색 및 슬라이드에 장착한 후, 현미경을 사용하여 저배율 렌즈로 정의된 관심 영역의 각 섹션을 현미경 사진으로 촬영합니다. 분석할 모든 샘플에서 카메라 설정을 동일하게 유지하고 데이터를 TIFF 파일로 저장합니다. 널리 사용 가능한 Scion Image 프로그램에서 현미경 사진을 엽니다.

두 개의 창이 열리면 인덱스 색상으로 표시된 창이 닫힙니다. 옵션을 선택한 다음 밀도 슬라이스를 선택합니다. 음영 범위는 조회 테이블 창에 빨간색으로 표시됩니다.

창에서 커서를 사용하여 특정 GFP 레이블만 채우고 이미지에서 불특정 배경이 선택되기 시작하면 중지합니다. 그런 다음 분석을 클릭하고 배율을 설정합니다. 네 번째 줄에는 단위가 표시되어야 하며, 드롭다운 목록에서 픽셀을 선택한 다음 확인을 클릭합니다.

형광 영역을 측정하려면 analyze(분석)를 클릭한 다음 measure(측정)를 클릭합니다. 그런 다음 분석을 클릭하고 결과를 표시합니다. 결과 창이 나타나고 형광 영역 측정이 area라고 표시된 제목 아래에 있습니다.

모든 측정값이 기록되면 동물당 3개에서 6개 섹션의 평균을 구합니다. 적절한 통계 테스트를 사용하여 그룹 간의 형질전환 영역을 비교합니다. 이 대표적인 이미지는 AAV 9 GFP의 꼬리 정맥 주입 후 4주 후 쥐 소뇌에서 GFP 면역형광을 보여줍니다.

이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 형광 영역을 선택적으로 강조하고 강조 표시된 픽셀을 정량화했습니다. 이것은 형질도입되지 않은 동물의 GFP 이미지입니다. GFP를 주입한 동물에 대해 동일한 매개변수를 사용하여 이 이미지를 분석하면 매우 낮은 수준의 배경 신호를 감지할 수 있습니다.

일단 숙달되면 쥐 한 마리당 약 5분 안에 주사를 할 수 있습니다. 결론적으로, 이 기술은 쥐의 CNS에 유전자를 효율적으로 도입하는 방법을 설명하며, 일회성 유전자 전달은 지속적인 발현과 장기적인 효과를 생성합니다. 가장 중요한 것은 중추 신경계가 주변부에서 조작된다는 것입니다.

상대적으로 비침습적인 정맥 주사 벡터 주사는 뇌와 척수, CNS에 도달합니다.