Overview
בדיקת משמרות ניידות אלקטרופורטית (EMSA) הוא הליך ביוכימי המשמש לביאור כריכה בין חלבונים וחומצות גרעין. בבדיקה זו תערובת של חומצת גרעין עם תווית רדיו וחלבון בדיקה. הכריכה נקבעת באמצעות אלקטרופורזה ג'ל המפרידה בין רכיבים המבוססים על מסה, מטען וקונפורמציה.
וידאו זה מציג את המושגים של EMSA והליך כללי, כולל הכנת ג'ל וחלבון, כריכה, אלקטרופורזה וזיהוי. יישומים המכוסים בסרטון זה כוללים ניתוח של אנזימים לשיפוץ כרומטין, EMSA שונה המשלב ביונטינילציה, ומחקר של אתרים מחייבים של רגולטורים תגובה חיידקית.
EMSA, תפילת הניידות האלקטרופורטית, הידועה גם בשם בדיקות הזזת ג'ל, היא הליך ביוכימי רב-תכליתי ורגיש. EMSA מדרכת כריכה בין חלבונים וחומצות גרעין על ידי זיהוי שינוי ברצועות באלקטרופורזה של ג'ל.
סרטון וידאו זה מתאר את העקרונות של EMSA, מספק הליך כללי, ודן ביישומים מסוימים.
שכפול DNA, שעתוק ותיקון, כמו גם עיבוד RNA הם כולם תהליכים ביוכימיים קריטיים. כולם כרוכים בכריכה בין חלבונים וחומצות גרעין. מחלות והפרעות חמורות רבות קשורות לשינויים בכריכה זו. EMSA היא טכניקה לקביעת איכות אם חלבון מסוים נקשר לחומצת גרעין ספציפית. ראשית, חומצת הגרעין מסומנת, בדרך כלל עם זרחן רדיואקטיבי-32, כדי ליצור בדיקה. ואז חלבון הבדיקה וחפצת גרעין מעורבבים. כאשר חלבון נקשר לבדיקת חומצת גרעין, לתסביך המתקבל יש מסה גדולה יותר וקונפורמציה שונה מחומצת הגרעין בלבד.
לאחר כבול, המתחמים מנותחים עם אלקטרופורזה ג'ל. בטכניקה זו, שדה חשמלי מאלץ מקרומולקולים לעבור דרך מטריצת ג'ל. הרכיבים נפרדים בהתבסס על מסה, טעינה וקונפורמציה. אלקטרופורזה יכולה להפריד בין קומפלקסים של חלבון-דנ"א לבדיקות לא מאוגדות. מכיוון שיש להם מסות וקונפורמציות שונות, הם יעברו דרך הג'ל בקצבים שונים וינפרדו. ההפרדה מזוהה בקלות, הודות לנוכחות של הזרחן הרדיואקטיבי, ומוכיחה שהחלבון נקשר בהצלחה לחומצת הגרעין הנתונה. כדי לאמת את זיהוי החלבון, "בדיקה על-גופית" משתמשת בנוגדן בעל זיקה ידועה לחלבון. יש לכך יתרון נוסף של הסטה נוספת של הרזולוציה המורכבת וההולכת וגדלה.
עכשיו שראינו את העקרונות, בואו נראה את זה במעבדה.
כדי להתחיל את ההליך, החלבון חייב להיות מבודד. כדי לעשות זאת, טכניקות ביולוגיה מולקולרית משמשות כדי לבטא את החלבון בתאים, ולאחר מכן לטהר.
חומצת הגרעין מוגברת ומסומנת כדי ליצור בדיקה. תיוג נעשה באמצעות דגירה במשך 10 דקות עם dCTP המכיל זרחן רדיואקטיבי-32. יש צורך בכס עבודה בטוח לקרינה וציוד מגן.
לאחר מכן מכינים את הג'ל. הג'ל צריך להיות לא denaturing, כדי למנוע את החלבון משינוי קונפורמציה ואולי להתיר מן הבדיקה במהלך אלקטרופורזה. ג'ל Polyacrylamide יש גדלי נקבוביות של 5 עד 20 ננומטר והם שימושיים עבור בדיקות קצרות עד 100 זוגות בסיס אורך. ג'לים אגרוז יש גדלי נקבוביות של 70-700 ננומטר והם שימושיים עבור בדיקות גדולות יותר.
עם החלבון וחומצת הגרעין מוכנה כעת, אנו ממשיכים בכריכה. פתרון חיץ TRIS מוכן ואת החלבון ואת הבדיקה מתווספים. ה- pH צריך להיות דומה לתנאים פיזיולוגיים, וריכוז מלח מספיק כדי למנוע מהחלבון ליצור קשרים חלשים עם חומצות גרעין שאינן ממוקדות. התגובה ממשיכה במשך 20-30 דקות ב 4 °C (50 °F).
השלב הבא הוא אלקטרופורזה. מאגר של חוזק יוני נמוך ו- pH דומה לזה המשמש בתגובת האיגוד מנוצל. היא מניבה "אפקט הזדקנות" המייצב מתחמים, מגביר את הניידות ומפחית את ייצור החום. לאחר אלקטרופורזה, רכיבי הג'ל מועברים על נייר מסנן. בחדר חשוך, נייר הסינון נחשף לאחר מכן לסרט. אם החלבון נקשר לגשוש, שני אזורים מסומנים נפרדים יהיו גלויים בהעברה. אחד המייצג את המתחם, ואחד נפרד המייצג את הבדיקה הלא מאוגדת. ההפרדה מדגימה כי החלבון קשור בהצלחה לחומצת הגרעין.
עכשיו שראינו את ההליך הבסיסי, בואו נסתכל על כמה יישומים.
כרומטין הוא קומפלקס צפוף של DNA וחלבונים שנמצאו תאים אאוקריוטים. אנזימי שיפוץ כרומטין משנים את המבנה כדי לפתוח את הדנ"א לתעתיק. כמו זה משנה את הניידות של המתחם, EMSA יכול לשמש כדי לחקור את הפעילות המחייבת של האנזים.
גישה חלופית לתיוג מנצלת את האינטראקציה בין DNA לבין האנזים מתיל-רנספראז. קופקטור יכול להיות שונה כדי להיקשר לצמיתות לדנ"א באמצעות מתילטרנספראז. במקום תיוג עם זרחן-32, קופקטור הוא מצומד ביוטין, וזה יתרון כי זה לא רדיואקטיבי. מכיוון שהשופץ הוא ספציפי לאתר בקובץ המצורף שלו, הוא רלוונטי לגנוטיפינג, זיהוי מתילציה ואספקת גנים. חומצות הגרעין הביוטיליטיות מזוהות באמצעות פלואורסצנטיות אולטרה סגולה.
כאשר גירויים סביבתיים להפעיל קינאז היסטידין, "רגולטור תגובה" הוא זרחן. זה בתורו נקשר לדנ"א, המשפיע על שעתוק, אשר ניתן ללמוד על ידי EMSA. לדוגמה, רגולטור תגובה Desulfovibrio וולגריס הוכח להיקשר לגן של עניין. EMSA שימש כדי לוודא שהאיגוד התקיים.
הרגע צפית בסרטון של ג'וב על משמרת הניידות האלקטרופורטית. כעת עליך להבין את עקרונות הפעולה שלו, את השלבים בהליך שלה ואת הפרמטרים העיקריים של ההפעלה.
תודה שצפיתם!
Procedure
בדיקת משמרות ניידות אלקטרופורטית (EMSA) הוא הליך ביוכימי המשמש לביאור כריכה בין חלבונים וחומצות גרעין. בבדיקה זו תערובת של חומצת גרעין עם תווית רדיו וחלבון בדיקה. הכריכה נקבעת באמצעות אלקטרופורזה ג'ל המפרידה בין רכיבים המבוססים על מסה, מטען וקונפורמציה.
וידאו זה מציג את המושגים של EMSA והליך כללי, כולל הכנת ג'ל וחלבון, כריכה, אלקטרופורזה וזיהוי. יישומים המכוסים בסרטון זה כוללים ניתוח של אנזימים לשיפוץ כרומטין, EMSA שונה המשלב ביונטינילציה, ומחקר של אתרים מחייבים של רגולטורים תגובה חיידקית.
EMSA, תפילת הניידות האלקטרופורטית, הידועה גם בשם בדיקות הזזת ג'ל, היא הליך ביוכימי רב-תכליתי ורגיש. EMSA מדרכת כריכה בין חלבונים וחומצות גרעין על ידי זיהוי שינוי ברצועות באלקטרופורזה של ג'ל.
סרטון וידאו זה מתאר את העקרונות של EMSA, מספק הליך כללי, ודן ביישומים מסוימים.
שכפול DNA, שעתוק ותיקון, כמו גם עיבוד RNA הם כולם תהליכים ביוכימיים קריטיים. כולם כרוכים בכריכה בין חלבונים וחומצות גרעין. מחלות והפרעות חמורות רבות קשורות לשינויים בכריכה זו. EMSA היא טכניקה לקביעת איכות אם חלבון מסוים נקשר לחומצת גרעין ספציפית. ראשית, חומצת הגרעין מסומנת, בדרך כלל עם זרחן רדיואקטיבי-32, כדי ליצור בדיקה. ואז חלבון הבדיקה וחפצת גרעין מעורבבים. כאשר חלבון נקשר לבדיקת חומצת גרעין, לתסביך המתקבל יש מסה גדולה יותר וקונפורמציה שונה מחומצת הגרעין בלבד.
לאחר כבול, המתחמים מנותחים עם אלקטרופורזה ג'ל. בטכניקה זו, שדה חשמלי מאלץ מקרומולקולים לעבור דרך מטריצת ג'ל. הרכיבים נפרדים בהתבסס על מסה, טעינה וקונפורמציה. אלקטרופורזה יכולה להפריד בין קומפלקסים של חלבון-דנ"א לבדיקות לא מאוגדות. מכיוון שיש להם מסות וקונפורמציות שונות, הם יעברו דרך הג'ל בקצבים שונים וינפרדו. ההפרדה מזוהה בקלות, הודות לנוכחות של הזרחן הרדיואקטיבי, ומוכיחה שהחלבון נקשר בהצלחה לחומצת הגרעין הנתונה. כדי לאמת את זיהוי החלבון, "בדיקה על-גופית" משתמשת בנוגדן בעל זיקה ידועה לחלבון. יש לכך יתרון נוסף של הסטה נוספת של הרזולוציה המורכבת וההולכת וגדלה.
עכשיו שראינו את העקרונות, בואו נראה את זה במעבדה.
כדי להתחיל את ההליך, החלבון חייב להיות מבודד. כדי לעשות זאת, טכניקות ביולוגיה מולקולרית משמשות כדי לבטא את החלבון בתאים, ולאחר מכן לטהר.
חומצת הגרעין מוגברת ומסומנת כדי ליצור בדיקה. תיוג נעשה באמצעות דגירה במשך 10 דקות עם dCTP המכיל זרחן רדיואקטיבי-32. יש צורך בכס עבודה בטוח לקרינה וציוד מגן.
לאחר מכן מכינים את הג'ל. הג'ל צריך להיות לא denaturing, כדי למנוע את החלבון משינוי קונפורמציה ואולי להתיר מן הבדיקה במהלך אלקטרופורזה. ג'ל Polyacrylamide יש גדלי נקבוביות של 5 עד 20 ננומטר והם שימושיים עבור בדיקות קצרות עד 100 זוגות בסיס אורך. ג'לים אגרוז יש גדלי נקבוביות של 70-700 ננומטר והם שימושיים עבור בדיקות גדולות יותר.
עם החלבון וחומצת הגרעין מוכנה כעת, אנו ממשיכים בכריכה. פתרון חיץ TRIS מוכן ואת החלבון ואת הבדיקה מתווספים. ה- pH צריך להיות דומה לתנאים פיזיולוגיים, וריכוז מלח מספיק כדי למנוע מהחלבון ליצור קשרים חלשים עם חומצות גרעין שאינן ממוקדות. התגובה ממשיכה במשך 20-30 דקות ב 4 °C (50 °F).
השלב הבא הוא אלקטרופורזה. מאגר של חוזק יוני נמוך ו- pH דומה לזה המשמש בתגובת האיגוד מנוצל. היא מניבה "אפקט הזדקנות" המייצב מתחמים, מגביר את הניידות ומפחית את ייצור החום. לאחר אלקטרופורזה, רכיבי הג'ל מועברים על נייר מסנן. בחדר חשוך, נייר הסינון נחשף לאחר מכן לסרט. אם החלבון נקשר לגשוש, שני אזורים מסומנים נפרדים יהיו גלויים בהעברה. אחד המייצג את המתחם, ואחד נפרד המייצג את הבדיקה הלא מאוגדת. ההפרדה מדגימה כי החלבון קשור בהצלחה לחומצת הגרעין.
עכשיו שראינו את ההליך הבסיסי, בואו נסתכל על כמה יישומים.
כרומטין הוא קומפלקס צפוף של DNA וחלבונים שנמצאו תאים אאוקריוטים. אנזימי שיפוץ כרומטין משנים את המבנה כדי לפתוח את הדנ"א לתעתיק. כמו זה משנה את הניידות של המתחם, EMSA יכול לשמש כדי לחקור את הפעילות המחייבת של האנזים.
גישה חלופית לתיוג מנצלת את האינטראקציה בין DNA לבין האנזים מתיל-רנספראז. קופקטור יכול להיות שונה כדי להיקשר לצמיתות לדנ"א באמצעות מתילטרנספראז. במקום תיוג עם זרחן-32, קופקטור הוא מצומד ביוטין, וזה יתרון כי זה לא רדיואקטיבי. מכיוון שהשופץ הוא ספציפי לאתר בקובץ המצורף שלו, הוא רלוונטי לגנוטיפינג, זיהוי מתילציה ואספקת גנים. חומצות הגרעין הביוטיליטיות מזוהות באמצעות פלואורסצנטיות אולטרה סגולה.
כאשר גירויים סביבתיים להפעיל קינאז היסטידין, "רגולטור תגובה" הוא זרחן. זה בתורו נקשר לדנ"א, המשפיע על שעתוק, אשר ניתן ללמוד על ידי EMSA. לדוגמה, רגולטור תגובה Desulfovibrio וולגריס הוכח להיקשר לגן של עניין. EMSA שימש כדי לוודא שהאיגוד התקיים.
הרגע צפית בסרטון של ג'וב על משמרת הניידות האלקטרופורטית. כעת עליך להבין את עקרונות הפעולה שלו, את השלבים בהליך שלה ואת הפרמטרים העיקריים של ההפעלה.
תודה שצפיתם!
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
לא הוכרזו ניגודי אינטרסים.
