급성 심근 경색 및 심혈 관 질환 MicroRNAs 순환 측정을 위한 디지털 PCR
2018년 7월 3일
순환 microRNAs는 심혈 관 질환 및 급성 심근 경색에 대 한 생체로 약속을 보여주었다. 이 연구에서 우리는 미르 추출, 반전 녹음 방송 및 심혈 관 질환 환자의 혈 청에서 miRNAs의 절대 정량화에 대 한 디지털 PCR 프로토콜을 설명합니다.
이 방법은 마이크로 RNA가 심혈관 질환에서 유효한 바이오마커인지 여부와 같은 진단 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 정량적 real-time PCR과 비교했을 때, 디지털 PCR은 순환 중 microRNA를 정량화하는 데 있어 우수한 기술적 품질을 보여줍니다. 표본이 대략 20, 000의 작은 물방울로 분할되기 때문에, 아무 중복 측정도 필요하지 않으며, 정량화를 위해 표준 곡선 아무 필요도 없다.
이 방법은 심혈관 환자에서 microRNA의 정량화에 대한 통찰력을 제공할 수 있지만, 다른 microRNA가 암 진행의 바이오마커로 가능성을 보여주었기 때문에 다른 환자 및 질병에도 적용될 수 있으며 종양 환자에게도 적용될 수 있습니다. 일반적으로 이 방법을 처음 접하는 개인은 생성된 비말이 깨지기 쉽고 주의해서 다루어야 하기 때문에 어려움을 겪을 것입니다. 혈청 샘플에서 RNA를 분리한 후 역전사를 계속하여 dPCR에 대한 보다 안정적인 상보적 DNA를 얻습니다.
시작하려면 역전사 키트를 얼음 위에서 해동합니다. 그런 다음 효소와 프라이머를 스핀다운합니다. 다음으로, 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 마스터 믹스를 준비합니다.
96웰 플레이트의 각 웰에 10마이크로리터의 마스터 믹스와 추출된 RNA 5마이크로리터를 결합합니다. 그런 다음 2, 000xg에서 2분 동안 섭씨 4도에서 플레이트를 원심분리하십시오. 텍스트 프로토콜에 자세히 설명된 대로 역방향 전사를 진행합니다.
먼저, 시판되는 dPCR 믹스, cDNA 및 PCR 프라이머를 얼음과 원심분리기에서 사용 직전에 해동합니다. 그런 다음 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 마스터 믹스를 준비합니다. 1.33 마이크로리터 부피의 역전사 생성물을 18.67 마이크로리터 부피의 마스터 믹스 및 원심분리기에 간단히 추가합니다.
피펫을 사용하여 20마이크로리터의 샘플을 8웰 카세트의 중간 줄의 각 웰로 옮깁니다. 그런 다음 70마이크로리터의 액적 생성 오일을 카세트의 유정에 피펫으로 주입합니다. 다음으로, 카세트 위에 개스킷을 놓고 액적 발생기에 놓습니다.
액적 생성기를 닫고 세 개의 표시등이 녹색으로 고정될 때까지 기다립니다. 피펫을 사용하여 액적 형성 시료 40마이크로리터를 96웰 플레이트의 별도 웰로 조심스럽게 옮깁니다. 그런 다음 섭씨 180도에서 4초 동안 dPCR 호일로 플레이트를 밀봉합니다.
밀봉된 PCR 플레이트를 cycler에 놓고 텍스트 프로토콜에 설명된 사이클링 지침을 따릅니다. 열순환기에서 플레이트를 제거하고 플레이트 홀더 바닥으로 옮깁니다. 그런 다음 플레이트 홀더의 상단을 PCR 플레이트에 놓습니다.
마지막으로 상용 dPCR 소프트웨어를 시작합니다. 이 프로토콜에서는 디지털 PCR을 사용하여 심혈관 질환 환자의 혈청에서 microRNA를 정량화했습니다. 샘플은 경피적 개입 전, 8시간 후, 16시간 후에 16명의 환자로부터 채취했습니다.
ST-상승 심근경색 환자는 안정적인 관상동맥 질환 환자에 비해 miR-499 수치가 유의하게 증가했다. 일단 숙달되면 이 기술은 올바르게 수행되면 96개 샘플의 액적 형성을 위해 약 한 시간 안에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안 비말을 주의해서 다루는 것을 염두에 두는 것이 중요합니다.
이 비디오를 시청한 후에는 올바른 액적 형성, 사이클링, 읽기 및 분석을 통해 디지털 PCR을 올바르게 수행하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.
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개요
본 연구는 심혈관 질환의 잠재적 바이오마커인 혈중 microRNA의 추출 및 정량을 위한 프로토콜을 제시합니다. 디지털 PCR을 활용하여, 심혈관 질환 환자의 혈청 샘플 내 miRNA 측정의 정확도를 높이는 것을 목표로 합니다.
주요 연구 구성 요소
과학 분야
- 심혈관 질환
- 바이오마커
- MicroRNA 분석
배경
- MicroRNA는 유전자 조절에 관여하는 작은 비코딩 RNA입니다.
- 이들은 심혈관 질환을 포함한 다양한 질병의 잠재적 바이오마커로 부상했습니다.
- 디지털 PCR은 microRNA를 정량화하는 데 있어 전통적인 방법보다 장점을 제공합니다.
- miRNA 프로파일을 이해하면 심혈관 질환의 진단 및 관리에 도움이 될 수 있습니다.
연구 목적
- 심혈관 질환의 바이오마커로서 microRNA를 검증하기 위함입니다.
- 순환 miRNAs의 정량 분석에 있어 digital PCR의 효과를 입증하기 위함입니다.
- 해당 분야의 연구자들에게 신뢰할 수 있는 프로토콜을 제공하기 위함입니다.
사용된 방법
- 혈청 샘플로부터의 miRNA 추출.
- 상보적 DNA 합성을 위한 역전사.
- miRNA의 절대 정량을 위한 디지털 PCR.
- 디지털 PCR과 정량적 실시간 PCR의 비교.
주요 결과
- Digital PCR은 miRNA 정량 분석에서 우수한 정확도를 보였습니다.
- 이 방법은 표준 곡선 없이도 수천 개의 드롭렛을 분석할 수 있게 합니다.
- 이 방법의 잠재적 적용 가능성은 심혈관 질환을 넘어 암과 같은 다른 질환으로 확대됩니다.
- 해당 기술의 신규 사용자의 경우, 깨지기 쉬운 드롭렛을 다루는 데 어려움이 있음이 확인되었습니다.
결론
- 본 연구는 순환 마이크로RNA를 심혈관 질환의 바이오마커로 활용하는 것을 뒷받침합니다.
- 디지털 PCR은 정밀한 miRNA 정량을 위한 유망한 도구입니다.
- 추후 연구를 통해 이 방법의 적용 범위를 다른 질병으로 확대할 수 있을 것입니다.
자주 묻는 질문
산업 관련성 요약
디지털 PCR을 이용한 혈중 microRNA의 정량 분석은 심혈관 질환 연구에서 바이오마커 검증을 위한 재현성 높고 민감도가 뛰어난 접근법을 제공합니다. 이 방법은 표준 곡선 없이도 절대 정량을 가능하게 하여 다기관 연구의 변동성을 줄임으로써, 타겟 검증 및 분석법 개발을 지원합니다. 또한, miRNA 발현과 병리적 상태를 연결하여 초기 발견 단계에서의 예측 신뢰도를 높이며, 치료 가설 검증 시 추진 또는 중단 여부를 결정하는 판단 근거를 제공합니다.
바이오 제약 R&D의 전략적 응용
초기 발견 및 타겟 검증
- 과학적 가치: AMI에서 miR-499와 같은 질환 특이적 miRNA를 정량화함으로써 치료 가설의 검증을 가능하게 합니다.
- 운영적 가치: 표준 곡선 없이 절대적인 miRNA 복제 수를 제공하여, 여러 기관 간의 재현성을 향상시킵니다.
- 예측적 가치: miRNA 수치를 심혈관 병리학과 연결함으로써 바이오마커 중심의 포트폴리오 선별을 지원합니다.
스크리닝 및 분석법 개발
- 과학적 가치: 하위 스크리닝 워크플로우를 위한 검증된 생물학적 시스템(혈청 RNA 유래 cDNA)을 생성합니다.
- 운영적 가치: 분석 표준화에 적합한 높은 선형성과 낮은 변동성의 결과물을 제공합니다.
- 확장성: 마스터 믹스 조제 후 약 1시간 이내에 96개 샘플의 처리가 가능하여 중간 처리량 스크리닝을 지원합니다.
중개 및 전임상 연구
- 중개적 연속성: 질병 관련 혈청 바이오마커를 통해 발견 단계의 miRNA 정량을 전임상 검증으로 연결합니다.
- 기전적 리스크 감소: miRNA 발현과 심혈관 손상을 상관 분석하여 타겟 검증의 모호성을 줄입니다.
- 바이오마커 정렬: 조직 및 질병 특이성이 높은 miRNA를 정량화하여 중개 바이오마커 개발을 지원합니다.
파이프라인 및 워크플로우 통합
이 방법은 가설 검증부터 리드 화합물 발굴에 이르는 발견 연속체 내에 적합하며, 타겟 신뢰도와 분석 준비 상태를 판단할 수 있는 정량적 miRNA 데이터를 제공합니다.
- 발견 생물학: 심혈관 세포에서 혈액 순환계로 방출되는 miRNA를 정량화하여 가설 검증을 지원합니다.
- 스크리닝: 바이오마커 후보군을 평가하기 위해 고감도의 표준화된 분석 준비 완료 출력물을 생성합니다.
- 분석: 표준 곡선 없이 절대 정량을 사용하여 다양한 조건 간의 miRNA 수준을 직접 비교할 수 있게 합니다.
- 중개 연구: 순환 miRNA 프로파일을 심혈관 병리와 연결함으로써 바이오마커의 연속성을 발전시킵니다.
- 기업적 재사용: 심혈관 및 종양학적 적응증 전반에 적용 가능한 재사용 가능한 정량화 플랫폼을 구축합니다.
운영 및 기업 영향
- 과학적 가치: 변동성이 낮고 민감도가 높은 miRNA 정량을 통해 바이오마커 유효성에 대한 예측 신뢰도를 높입니다.
- 운영적 가치: 중복 측정을 배제하는 드롭렛 기반 분할 방식을 통해 재현성과 표준화를 보장합니다.
- 전략적 가치: 바이오마커-타겟 관계의 기전적 모호성을 줄여 go/no-go 결정 능력을 향상시킵니다.
- 포트폴리오 영향: 정량적이고 병리적으로 연계된 miRNA 데이터를 통해 리스크가 조정된 연구 진전을 가능하게 합니다.
실행 시 고려 사항
- 시료 손실을 방지하기 위해 RNA 분리, 역전사 및 드롭렛 핸들링에 관한 전문 지식이 필요합니다.
- 정확한 정량을 위해 드롭렛 생성 장비, PCR 사이클러 및 dPCR 소프트웨어가 필요합니다.
- 재현성 있는 결과를 얻으려면 드롭렛 형성 및 밀봉 프로토콜에 대한 팀 간 표준화가 필요합니다.
- 혈청 외에 혈장이나 조직 용해물과 같은 다른 시료 유형에 적용할 때 적응 단계에 대한 고려가 필요합니다.
- 취약한 드롭렛 핸들링과 같은 현실적인 제약이 있으며, 이는 숙련되지 않은 사용자의 처리량에 영향을 줄 수 있습니다.
