급성 심근 경색 및 심혈 관 질환 MicroRNAs 순환 측정을 위한 디지털 PCR

이 방법은 마이크로 RNA가 심혈관 질환에서 유효한 바이오마커인지 여부와 같은 진단 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 정량적 real-time PCR과 비교했을 때, 디지털 PCR은 순환 중 microRNA를 정량화하는 데 있어 우수한 기술적 품질을 보여줍니다. 표본이 대략 20, 000의 작은 물방울로 분할되기 때문에, 아무 중복 측정도 필요하지 않으며, 정량화를 위해 표준 곡선 아무 필요도 없다.

이 방법은 심혈관 환자에서 microRNA의 정량화에 대한 통찰력을 제공할 수 있지만, 다른 microRNA가 암 진행의 바이오마커로 가능성을 보여주었기 때문에 다른 환자 및 질병에도 적용될 수 있으며 종양 환자에게도 적용될 수 있습니다. 일반적으로 이 방법을 처음 접하는 개인은 생성된 비말이 깨지기 쉽고 주의해서 다루어야 하기 때문에 어려움을 겪을 것입니다. 혈청 샘플에서 RNA를 분리한 후 역전사를 계속하여 dPCR에 대한 보다 안정적인 상보적 DNA를 얻습니다.

시작하려면 역전사 키트를 얼음 위에서 해동합니다. 그런 다음 효소와 프라이머를 스핀다운합니다. 다음으로, 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 마스터 믹스를 준비합니다.

96웰 플레이트의 각 웰에 10마이크로리터의 마스터 믹스와 추출된 RNA 5마이크로리터를 결합합니다. 그런 다음 2, 000xg에서 2분 동안 섭씨 4도에서 플레이트를 원심분리하십시오. 텍스트 프로토콜에 자세히 설명된 대로 역방향 전사를 진행합니다.

먼저, 시판되는 dPCR 믹스, cDNA 및 PCR 프라이머를 얼음과 원심분리기에서 사용 직전에 해동합니다. 그런 다음 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 마스터 믹스를 준비합니다. 1.33 마이크로리터 부피의 역전사 생성물을 18.67 마이크로리터 부피의 마스터 믹스 및 원심분리기에 간단히 추가합니다.

피펫을 사용하여 20마이크로리터의 샘플을 8웰 카세트의 중간 줄의 각 웰로 옮깁니다. 그런 다음 70마이크로리터의 액적 생성 오일을 카세트의 유정에 피펫으로 주입합니다. 다음으로, 카세트 위에 개스킷을 놓고 액적 발생기에 놓습니다.

액적 생성기를 닫고 세 개의 표시등이 녹색으로 고정될 때까지 기다립니다. 피펫을 사용하여 액적 형성 시료 40마이크로리터를 96웰 플레이트의 별도 웰로 조심스럽게 옮깁니다. 그런 다음 섭씨 180도에서 4초 동안 dPCR 호일로 플레이트를 밀봉합니다.

밀봉된 PCR 플레이트를 cycler에 놓고 텍스트 프로토콜에 설명된 사이클링 지침을 따릅니다. 열순환기에서 플레이트를 제거하고 플레이트 홀더 바닥으로 옮깁니다. 그런 다음 플레이트 홀더의 상단을 PCR 플레이트에 놓습니다.

마지막으로 상용 dPCR 소프트웨어를 시작합니다. 이 프로토콜에서는 디지털 PCR을 사용하여 심혈관 질환 환자의 혈청에서 microRNA를 정량화했습니다. 샘플은 경피적 개입 전, 8시간 후, 16시간 후에 16명의 환자로부터 채취했습니다.

ST-상승 심근경색 환자는 안정적인 관상동맥 질환 환자에 비해 miR-499 수치가 유의하게 증가했다. 일단 숙달되면 이 기술은 올바르게 수행되면 96개 샘플의 액적 형성을 위해 약 한 시간 안에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안 비말을 주의해서 다루는 것을 염두에 두는 것이 중요합니다.

이 비디오를 시청한 후에는 올바른 액적 형성, 사이클링, 읽기 및 분석을 통해 디지털 PCR을 올바르게 수행하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.