화학유전학적으로 조작된 피질 인터뉴런 선조를 출생 후 마우스 뇌로 이식
August 26th, 2019
여기에서 우리는 초기 출생 후 마우스의 피질로 이식된 피질 interneuron 선조의 활동을 조작하기 위하여 화학유전학 공구를 이용하기 위하여 디자인된 프로토콜을 제시합니다.
이 방법을 사용하면 피질 인터뉴런 전구체의 성숙에 대한 본질적인 활동의 효과를 연구할 수 있습니다. 이 기술은 대부분의 과학 공동체에 접근 할 수있는 피질 인터뉴런 전구의 세포 특성을 타겟팅하고 조작하기위한 효율적인 방법을 제공합니다. 이 프로토콜은 샘플 과 장비의 세심한 처리를 포함, 그것은 가장 시각적 데모에 의해 평가 될 수있다.
방수 펜을 사용하여 6개의 35mm 페트리 접시의 하단 면 의 중간을 가로질러 직선으로 그립니다. PBS에 액체 4% 낮은 겔화 아가로즈 10밀리터를 35mm 페트리 접시 2개에 넣고 각 샘플 사이에 3~5밀리미터의 공간을 남기고 후각 전구가 있는 아가로즈에 3~4개의 해부된 두뇌를 포함시합니다. 모든 뇌가 내장되었을 때, 아가로즈가 아가로즈를 한 블록에 매립시키고 조각할 수 있도록 섭씨 4도에 접시를 놓고 샘플 가장자리 주위에 약 3밀리미터의 젤을 남깁니다.
마이크로톤베이스의 표면에 블록을 접착하고 수술용 블레이드를 사용하여 각 조직 샘플 사이의 블록 의 바닥을 끝까지 잘라 세 개의 독립적인 블록을 얻습니다. 다음으로, 진동 블레이드 마이크로톤을 사용하여 얼음 차가운 크렙스 용액의 블록을 250마이크로미터 두께의 슬라이스로 분할하고, 구부러진 평평한 마이크로스patula를 사용하여 내측 또는 caudal ganglionic 저울을 함유한 조각만 수집합니다. 그런 다음 각 섹션을 개별 13 마이크로미터 직경, 8 마이크로미터 모공 크기 필터 멤브레인을 개별 폴리스티렌 센터에서 최소한의 필수 배지에 띄우는 개별 폴리스티렌 센터웰 장기 배양 접시에 놓습니다.
모든 구간을 수득하면 1시간 동안 37°C의 이산화탄소 조직 배양배인 인큐베이터에 접시를 놓습니다. 초점 DNA 주입 전에, 얼음 차가운 크렙스 용액에 유리 225 밀리미터 길이, 2 밀리리터 용량 유리 파이펫으로 펀치 10 밀리미터 긴 아가로즈 컬럼, 10 밀리미터 긴 아가로즈 컬럼을 배치합니다. 수술용 블레이드를 사용하여, 전포 전극의 표면에 맞게 아가로즈의 작은 조각 1 개와 초점 DNA 주사의 기초로 사용되는 하나의 더 큰 조각을 잘라.
그런 다음 아가로즈 블록을 얼음 차가운 크렙스 솔루션에 넣습니다. 주사를 위해, 각 벡터에 대한 마이크로리터 농도당 1마이크로그램에 발현 및 제어 벡터 DNA를 혼합하고 1-10 희석에서 빠른 녹색 스톡 용액을 추가한다. 0.5밀리미터 의 내경, 1밀리리터 외경 유리 마이크로파이프를 DNA 혼합물의 10마이크로리터로 채우고 마이크로파이프를 공압 피코펌프 인젝터에 넣습니다.
스테레오 현미경 아래에 아가로즈의 더 큰 블록을 배치하고 아가로즈 의 조각에 주입 할 슬라이스를 배치합니다. 이어서, 슬라이스의 선택된 내측 간리온 또는 카우달 신경절 저명 부위에 25~50나노리터 부피를 주입한다. 주입 직후, 페트리 접시 전극에 작은 아가로즈 블록을 놓고 평평한 마이크로스파툴라를 사용하여 아가로즈 컬럼을 모바일 커버 전극에 부착합니다.
주입된 슬라이스를 지지막으로 아가로즈 블록에 옮기고 선택한 부위 위에 아가로즈 컬럼이 있는 상부 전극을 놓습니다. 그런 다음 125볼트의 5밀리초 펄스 2개, 500밀리초 간격으로 영역을 전기화합니다. 전기 기화 후, 그 지지 막으로 슬라이스를 다시 보유 접시에 넣고 조직 배양 인큐베이터로 접시를 반환합니다.
1 시간 후, 기본 신경 배양에 적합한 기본 매체로 최소한의 필수 매체를 교체하고 하룻밤 인큐베이터에 조각을 반환합니다. 이러한 전기기 실험에서, GFP 양성 뉴런의 약 50%가 RFP 양성 주입 단백질을 공동 발현한 결과, GFP 양성 RFP 음성 집단은 주입된 DNA 리간드의 효과에 대한 내부 통제역할을 하였다. 클로자핀 및 산화물 투여는 이러한 신생아 관상 조직 섹션에서 활성 의존성 단백질 c-Fos의 발현에 의해 입증된 바와 같이, 전감염된 RFP 양성 세포의 활성을 선택적으로 증가시킨다.
클로자핀 및 산화물 처리는 또한 차량 투여 된 쓰레기류에 비해 GFP 양성 RFP -음수 세포의 수에 비해 GFP 양성 RFP 양성 세포의 비율의 증가를 초래한다. 이 절차는 호스트의 순환 가소성과 두뇌 기능에 활동 변조 접목 된 인터뉴런의 효과를 연구하는 데 사용할 수 있습니다.
개요
이 연구는 초기 출생 후 마우스에서 화학유전학적 도구를 사용하여 피질 간질 전구 세포의 활동을 조절하는 프로토콜을 제시합니다. 이 방법을 통해 연구자들은 이러한 간질 전구 세포의 성숙에 대한 내재된 활동의 영향을 탐구할 수 있으며, 이는 피질 기능에 대한 더 깊은 이해에 기여합니다.
주요 연구 구성 요소
과학 분야
- 신경과학
- 피질 발달
- 화학유전학
배경
- 피질 간질 세포는 뇌 기능에서 중요한 역할을 합니다.
- 그들의 성숙을 이해하는 것은 신경학 연구에 기여할 수 있습니다.
- 화학유전학은 신경 활동의 정밀한 조절을 제공합니다.
- 출생 후 마우스는 피질 발달 연구를 위한 관련 모델로 작용합니다.
연구 목적
- 이식된 피질 간질 전구 세포의 활동을 조절하기 위함입니다.
- 간질 성숙에 대한 내재된 활동 영향을 검토하기 위함입니다.
- 연구자들에게 널리 사용 가능한 프로토콜을 제공하기 위함입니다.
사용된 방법
- 조작을 위해 초기 출생 후 마우스에서 ex vivo 뇌 슬라이스를 준비했습니다.
- 생물학적 모델에는 이식된 피질 간질 전구 세포가 포함되었습니다.
- 주요 단계에는 아가로스에 조직 포함, 표적 DNA 주입 및 이어지는 전기 포레이션이 포함되었습니다.
- 조작 후, 슬라이스는 배양되고 신경 활동 반응에 대해 분석되었습니다.
주요 결과
- 대략 50%의 신경 세포가 GFP와 RFP의 공동 발현을 보여, 성공적인 조작을 나타냅니다.
- 클로자핀 및 옥사이드 처리는 RFP 양성 세포의 활동을 증강시키고, c-Fos 발현을 증가시켰습니다.
- 이 방법은 이식된 간질 세포가 숙주 뇌 기능에 어떻게 영향을 미치는지에 대한 통찰력을 제공합니다.
결론
- 이 연구는 간질 전구 세포를 조작하는 효과적인 프로토콜을 보여주며, 이는 피질 가소성에서의 그들의 역할에 대한 추가 연구를 가능하게 합니다.
- 활동 조절 간질 세포의 메커니즘을 이해하는 것은 신경과학 지식을 발전시킬 수 있습니다.
자주 묻는 질문
Executive Industry Relevance
Genetic and chemogenetic manipulation of cortical interneuron progenitors enables precise interrogation of neuronal maturation mechanisms, supporting early-stage target validation in neurodevelopmental research. This approach provides predictive confidence for understanding how intrinsic activity and environmental factors influence integration and function of inhibitory circuits. The protocol's ability to dissect gene-environment interactions in a controlled, transplantable system positions it as a valuable tool for de-risking neurobiological targets in preclinical pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables functional interrogation of interneuron maturation and integration in disease-relevant neural circuits.
- Supports mechanistic de-risking by isolating genetic and environmental contributions to neuronal development.
- Facilitates predictive assessment of target modulation effects on inhibitory network assembly.
Screening & Assay Development
- Provides a validated system for quantitative measurement of neuronal activity and gene expression in engineered progenitors.
- Enables reproducible manipulation and tracking of transplanted cell populations using fluorescent reporters.
- Supports assay standardization for evaluating chemogenetic tool efficacy and specificity in neural tissue.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with translational biomarker strategies by enabling in situ analysis of activity-dependent protein expression (e.g., c-Fos).
- Offers continuity from discovery to preclinical validation by modeling integration of engineered cells in host brain circuits.
- De-risks advancement decisions by providing quantitative readouts of graft function and host response.
Pipeline & Workflow Integration
This protocol bridges early discovery and preclinical research by enabling genetic manipulation, transplantation, and functional analysis of interneuron progenitors in a single workflow.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on gene-environment interactions in interneuron maturation.
- Screening: Delivers quantitative, reproducible outputs for evaluating chemogenetic modulation in neural tissue.
- Analytics: Provides molecular and cellular readouts (e.g., co-expression of fluorescent proteins, c-Fos induction) for comparative analysis.
- Translational Research: Models integration and function of engineered cells in vivo, supporting biomarker alignment.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for testing diverse genetic constructs and activity modulators in neural progenitors.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation and reduces mechanistic ambiguity in neuronal development.
- Operational Value: Standardizes manipulation and analysis of neural progenitors for scalable, reproducible studies.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions by providing robust, quantitative data on engineered cell integration and function.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of neurodevelopmental targets and interventions.
Implementation Considerations
- Requires expertise in ex vivo electroporation, transplantation, and chemogenetic manipulation of neural tissue.
- Demands access to specialized instrumentation for tissue sectioning, microinjection, and fluorescence imaging.
- Necessitates cross-team standardization of protocols for reproducibility and data comparability.
- Adaptation may be needed for different interneuron subtypes or host models.
- Potential limitations include variability in graft integration and chemogenetic tool specificity.
