Name: 신경 발달 장애를 완화하기 위해 인간 줄기 세포 유래 GABA 성 뉴런을 출생 후 초기 마우스 해마에 이식 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-11-11T13:40:00.000+00:00
Duration: 5 min
Description: 학습하세요 인간 줄기세포 유래 GABA 성 뉴런을 신생아 마우스 해마에 이식하여 신경 발달 장애의 세포 치료 가능성을 평가하는 방법입니다. 이 기술은 장기간 생존 및 뇌 통합 메커니즘 연구에 활용됩니다.

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이 프로젝트는 스웨덴 연구 위원회(보조금 번호: 2016-02605, 석사), 스웨덴 뇌 재단 F02021-0369(석사), 크라포드 재단(석사) 및 유럽 연합 호라이즌 2020 프로그램(H2020-MSCA-ITN-2016)이 Marie Skłodowska-Curie 혁신 교육 네트워크 프로젝트 Training4CRM No. 722779(M.K.)에 따라 자금을 지원했습니다. 우리는 P2 신생아 마우스에서 정위 세포 이식을 가르치기 위해 Josep Maria Canals의 실험실 (바르셀로나 대학 줄기 세포 및 재생 의학 실험실)의 Andrés Miguez와 오스틴에있는 텍사스 대학의 그룹 리더 인 Mackenzie Howard의 도움에 매우 감사드립니다. 동물 관리를 도와준 Susanne Geres와 조직 처리에 도움을 준 Ling Cao, 그리고 연구에 어떤 식으로든 기여한 학생들, 특히 Diana Hatamian에게 감사드립니다. 마지막으로,이 문서를 설명하는 데 사용 된 그래픽 중 일부는 BioRender.com 로 만들어졌습니다.

모든 실험 절차는 Malmö / Lund 동물 연구 윤리위원회, 윤리 허가 번호 12548-19의 승인을 받았으며 동물 실험에 대한 스웨덴 동물 복지국 규정 및 EU 지침 2010 / 63 / EU에 따라 수행되었습니다. C57BL6/J 및 접촉-관련 단백질-유사 2 (Cntnap2) 녹아웃 (KO) 마우스, 수컷 및 암컷 모두, 본 연구를 위해 출생 후 날 (P) 2에 사용되었다. 인간 배아 줄기 세포 (hESCs)가 사용되었다. 동물 및 줄기 세포는 상업적 공급원으로부터 수득하였다( 재료 표 참조).
1. hdIN 전구체의 생성
참고: 이 섹션의 모든 단계는 세포 배양 후드에서 수행됩니다. hESCs는 줄기 세포 배양 배지를 사용하여 코팅 된 플레이트에서 피더가없는 세포로 유지되고 콜로니로 계대 배양되었습니다.
<ol><li>hESC를 hdIN 전구체로 순방향 프로그래밍을 수행합니다(그림 1). 참고: 순방향 프로그래밍 접근 방식은 Gonzalez-Ramos et al.8 및 Yang et al.9에 설명된 절차를 기반으로 합니다.<ol><li>10μM의 ROCK 억제제(RI)를 함유한 새로운 줄기세포 배양 배지에서 Tet-On 시스템을 포함하는 렌티바이러스 벡터로 hESC를 형질도입합니다( 재료 표 참조). 인큐베이터에서 37 °C로 유지하십시오.</li>
		<li>형질도입 후 16시간 후에 배지를 새로운 줄기세포 배양액으로 변경하고 형질도입된 세포를 형질도입되지 않은 hESCs와 동일한 방법으로 유지한다.</li>
		<li>합류할 때, 세포 분리 용액(재료 표 참조)을 사용하여 hESC를 단일 세포로 분리하고 시험관내(DIV) -1에 10μM의 RI를 포함하는 줄기 세포 배양 배지에서 3 x 105 세포/웰의 밀도로 코팅된 6웰 플레이트에 플레이트합니다.</li>
		<li>1 DIV에서 배양 배지를 2 g/L의 독시사이클린(DOX, 재료 표 참조)이 포함된 N2 배지로 교체합니다. 참고: DOX는 Ascl1 및 Dlx29의 도입유전자 발현을 1 DIV에서 7 DIV로 유도하는 데 사용되며, 이어서 음용수25에 첨가함으로써 생체내에서 계속된다.</li>
		<li>2 DIV에서 항생제 내성 선택 기간이 시작되어 5 DIV까지 지속됩니다. 퓨로마이신(푸로)과 하이그로마이신(하이그로)을 새로운 배지에 추가합니다( 재료 표 참조). 2 DIV, 4 DIV 및 5 DIV에서 미디어를 변경합니다. 참고: 항생제 내성 카세트를 운반하는 세포만 생존할 수 있도록 형질도입 및 비형질도입 hESC를 사용하여 분화 프로토콜 전에 퓨로 및 하이그로의 농도를 최적화합니다. 이 프로토콜에서는 0.5μg/mL의 퓨로와 750μg/mL의 하이그로가 사용되었습니다.</li>
		<li>5 DIV에서 항생제 선택 기간이 끝납니다. 2g/L의 DOX와 4μM의 시토신 β-D-아라비노푸라노사이드(Ara-C, 재료 표 참조)가 보충된 N2 배지로 변경합니다.</li>
	</ol></li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64272/64272fig01.jpg"> 그림 1: Ascl1 및 Dlx2를 과발현하여 hESC에서 hdIN 전구체 생성. (A) hdIN 전구체의 생성에 사용되는 차별화 프로토콜의 개략도. (B-E) (B) 뉴런 마커 MAP2, (C) 증식성 마커 Ki67, (D) 일반 핵 염색, 및 (E) 이전 마커의 병합에 대한 7 DIV에서의 hdIN 전구체의 면역세포화학. 스케일 바: 50 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64272/64272fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
2. 이식용 단세포 현탁액의 제조
참고: 이 섹션의 모든 단계는 세포 배양 후드에서 수행됩니다. 7 DIV에서 hdIN 전구체는 해리되어 이식에 사용됩니다.
<ol><li>아래 단계에 따라 셀 분리를 수행하십시오.<ol><li>배지를 제거하고 칼슘과 마그네슘이없는 DPBS로 세포를 조심스럽게 헹굽니다.</li>
		<li>400μL의 세포 분리 용액( 재료 표 참조)을 6웰 플레이트의 각 웰에 추가합니다. 알림: 용액으로 전체 표면을 덮으십시오.</li>
		<li>세포의 경계가 반짝이기 시작할 때까지 인큐베이터에서 37 ° C에서 2-3 분 동안 배양하여 세포 표면 단백질의 효소 분해 및 웰 표면에서 분리를 나타냅니다. 알림: 세포 생존율을 높이려면 모든 세포가 완전히 분리되어 떠 다닐 때까지 너무 오래 기다리지 마십시오.</li>
		<li>그런 다음 6웰 플레이트의 각 웰에 600μL의 신선한 N2 배지를 추가하여 효소를 중지하고 피펫으로 기계적으로 세포를 분리하여 단일 세포 현탁액을 얻습니다.</li>
		<li>세포 현탁액을 플라스틱 튜브(15mL)로 옮기고 실온(RT)에서 4분 동안 180 x g 로 원심분리합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>세포의 재현탁을 수행하십시오.<ol><li>진공 시스템을 사용하여 상청액을 폐기하고(펠릿을 방해하지 않고 조심스럽게) 10μM의 RI, 1μg/mL의 DNase 및 2μg/μL의 DOX가 포함된 이식 배지에 펠릿을 재현탁합니다.</li>
		<li>계수 챔버와 수동 세포 카운터를 사용하여 현탁액의 총 세포를 계수하고 부피를 최종 농도 100,000 cells/μL로 조정합니다.</li>
		<li>이식 할 때까지 얼음 위의 밀폐 된 튜브에 세포 현탁액을 최대 4 시간 동안 보관하십시오. 참고: 이식은 세포 현탁액(7 DIV)의 준비와 같은 날에 수행해야 합니다.</li>
	</ol></li>
</ol>3. 해마 세포 이식
참고: 이 섹션의 모든 단계는 동물 시설의 세포 배양 후드 외부에서 수행됩니다. 출생 후 세포의 뇌로의 조기 이식은 출생 당일 P0를 고려하여 P2에서 수행되었습니다.
<ol><li>아래 단계에 따라 이식 실험을 준비하십시오.<ol><li>모든 수술 재료를 오토 클레이브하거나 가능하지 않은 경우 승인 된 다른 방법으로 멸균하십시오.</li>
		<li>유리 모세관 없이 홀더에 주입 주사기를 장착합니다. 바늘을 물로 헹굽니다. 알림: 바늘은 33G 여야합니다.</li>
		<li>90G 인슐린 바늘 끝을 30° 구부립니다.</li>
		<li>머리를 평평하게 한 상태에서 강아지를 배치하기 위해 집에서 Play-Doh와 같은 무대를 만듭니다 (그림 2A).</li>
		<li>새로운 환경에 적응할 수 있도록 수술을 준비하기 전에 어미와 새끼와 함께 쥐 케이지를 가져옵니다.</li>
		<li>젖은 얼음이 담긴 트레이와 이소 플루 란 용 종이가있는 빈 케이지를 준비하십시오.</li>
	</ol></li>
	<li>마우스 강아지를 마취하십시오.<ol><li>종이에 이소플루란( 재료 표 참조)을 적셔 빈 케이지 안에 넣습니다. 조심스럽게 강아지 한 마리를 데리고 이소 플루 란에 적신 종이와 함께 새장에 넣으십시오. 알림: 엄마와 함께 강아지를 세 마리 미만으로 두지 마십시오. 이소 플루 란 마취 20-30 초를 초과하지 않으면 강아지가 죽을 수 있습니다.</li>
		<li>운동 중단으로 마취의 효과를 확인하십시오.</li>
		<li>마취 직후 강아지를 젖은 얼음 표면의 젖은 티슈에 놓습니다. 상지가 하얗게 될 때까지 동물을 3 분 동안 얼음 위에 두십시오 (그림 2B, 파란색 화살표). 보통 2-3 분이 걸립니다.</li>
		<li>이 시간을 사용하여 주사기에 세포 현탁액을 로드합니다. 전에 피펫으로 세포를 조심스럽게 재현 탁하십시오.</li>
		<li>강아지를 입체 프레임에 놓습니다. 이어바를 반대 방향으로 사용합니다(그림 2A, 자홍색 화살표). 알림: 이어 바의 뒷면은 덜 뾰족하고 P2 강아지에는 귀가 없으므로 동물이 다치지 않도록 평평한 쪽을 사용하십시오.</li>
		<li>측면에서 머리가 똑바로 있는지 확인하십시오. 머리는 평평해야합니다. Play-Doh와 같은 단계를 사용하여 조정하십시오. 참고 :이 나이의 새끼는 아직 눈을 뜨지 않았으므로 이와 관련하여 추가 단계를 수행 할 필요가 없습니다. 강아지는이 나이에 모피가 없으므로 면도가 필요하지 않습니다. 피부에 대한 개방 절개가 아니기 때문에 특별한 통증 치료가 제공되지 않으며 봉합이 필요하지 않습니다.</li>
		<li>수술 기간 동안 강아지를 얼음 (티슈 페이퍼 위에)으로 덮으십시오. 알림: 얼음을 강아지의 피부에 직접 닿지 않도록하십시오.</li>
	</ol></li>
	<li>주입을 수행하십시오.<ol><li>에탄올에 담근 연조직을 사용하여 피부 표면을 청소하십시오.</li>
		<li>람다를 식별하고 스테레오택시 기기의 디지털 디스플레이 콘솔에서 좌표를 0으로 설정합니다(그림 2C, 노란색 점선). 시상 및 람도이드 봉합사는 혈관 화되어 있기 때문에 눈으로 쉽게 볼 수 있습니다. 알림: 람다를 시각화하는 데 어려움이 있는 경우 피부에 작은 얼음 조각을 놓고 식을 때까지 몇 분 정도 기다리십시오. 그런 다음 얼음 조각을 제거하면 피부의 미묘한 미백으로 시각화 할 수 있습니다.</li>
		<li>주사 바늘을 원하는 좌표로 재배치하십시오. 설명 된 프로토콜에서 표적 영역은 해마였으며 좌표는 전방 후방 (AP) +0.85 및 중간 측면 (ML) +1.35였습니다.</li>
		<li>90° 구부러진 인슐린 바늘을 사용하여 두개골을 관통하고 작은 구멍을 만듭니다.</li>
		<li>주사 바늘이 두개골을 통과 할 때까지 내리고 배-복부 (DV) 좌표를 0으로 만듭니다. 원하는 DV 좌표가 될 때까지 바늘을 내립니다. 설명된 프로토콜에서, 좌표는 DV-1.1이었다.</li>
		<li>미리 정해진 시간 간격에 따라 주입하십시오. 참고: 설명된 프로토콜에서 정확한 타이밍은 다음과 같습니다: (i) DV 좌표로 내려간 후 3분 대기, (ii) 1μL의 부피를 5분 동안 주입, (iii) 모든 부피가 주입된 후 3분 동안 기다립니다.</li>
		<li>바늘을 천천히 집어 넣으십시오.</li>
	</ol></li>
	<li>절차를 종료합니다. 알림: 수술은 강아지의 생존을 보장하고 저체온증에 의한 마취로 인한 손상을 피하기 위해 15 분 이상 지속될 수 없습니다.<ol><li>강아지가 움직이기 시작할 때까지 손으로 강아지를 따뜻하게 한 후 어미에게 돌려줍니다.</li>
		<li>생체 내에서 세포 분화를 계속하기 위해 이식(PT) 전 최소 2일 및 이식 후 3주 동안 0.5% 자당 용액에 1mg/mL의 농도로 DOX를 음용수로 제공합니다.</li>
	</ol></li>
</ol><img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64272/64272fig02.jpg"> 그림 2: P2에서 신생아 마우스 새끼의 정위 이식. (A) 강아지의 몸을 제자리에 고정하고 거꾸로 된 이어 바 (자홍색 화살표)를 유지하기위한 Play-Doh와 같은 단계. (B) 강아지가 저체온증에 의한 마취를 경험하도록 해당 부위의 혈류 감소를 나타내는 흰색 앞발 (파란색 화살표). (C) 강아지가 이미 연조직 종이 위에 얼음으로 덮인 설정 개요. (다#) 주사 바늘이 이미 뇌에 삽입 된 강아지 머리의 폐쇄 확대 / 축소 (람다 및 람도이드 봉합사를 나타내는 노란색 점선). 이 수치는 Gonzalez Ramos et al. 27. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64272/64272fig02large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

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저자는 경쟁 이익이 없다고 선언합니다.

본 프로토콜은 시험관 내에서 hdIN 전구체를 생성하고 신경 발달 장애의 전임상 모델에서 조기 중재 세포 요법으로 사용하는 강력하고 빠르며 간단하고 널리 접근 가능한 방법론을 설명합니다.
신경 발달 장애의 특징적인 표현형 중 일부는 청소년기 또는 성인기에 발생하지만 초기 발달 과정에서 병태 생리 학적 변화가 이미 존재합니다. 이러한 이유로 조기 개입은 증상 또는 임상 증상이 나타나기 전에 중요한 뇌 발달 기간에 행동함으로써 유익한 효과를 달성하는 데 매우 타당합니다. 미래에는 유전자 스크리닝과 바이오마커 개발로 예방 또는 증상 전 치료가 가능해질 것이며, 이는 이러한 환자들에게 게임 체인저가 될 것입니다. 따라서, hdIN 전구체는 뉴런 네트워크의 간질 변화가 진행될 수 있을 때 Cntnap2 KO 마우스 모델에서 출생 후 초기에 이식되었고(28 ) 세포 변화가 이 동물 모델29에서 기술된 시점에 이식되었다. 그러나 연령 외삽의 잠재적 인 함정과 마우스 대 인간 뇌의 특정 과정의시기를 고려하는 것이 중요합니다.
절차 자체에 초점을 맞추면, 여기에 제시된 분화 프로토콜은 전사 인자의 사용을 기반으로하며, 이는 소분자10,30을 기반으로하는 다른 프로토콜과 비교하여 줄기 세포의 빠르고 효율적인 프로그래밍을 허용합니다. 이 접근법의 잠재적 인 단점은 삽입 돌연변이 유발의 위험을 수반하는 렌티 바이러스 벡터에 대한 요구 사항 일 수 있습니다. 프로토콜의 두 가지 중요한 단계는 항생제와 항 유사 분열제를 배지에 첨가하여 전사 인자를 발현하는 세포를 선택하고 증식 세포를 제거하여 각각 기형 종 형성의 위험을 피하는 것입니다. 이 연구에서는 hdIN 전구체만 테스트되었지만 이 절차는 다른 세포 공급원 및 프로그래밍/분화 프로토콜과 함께 실현 가능할 것으로 예상됩니다. 그럼에도 불구하고 다른 뉴런 아형 및/또는 모델을 검증해야 합니다.
이식을 위한 hdIN 전구체의 연령인 7 DIV는 (i) Ki67에 대한 면역반응성에 의해 평가된 증식성 세포의 부재, (ii) POU5F1과 같은 만능 유전자의 발현 감소에 대한 이전에 보고된 관찰 및 그 시점에서 뉴런 마커 MAP2 및 인터뉴런 마커 GAD1의 출현에 기초하여 결정되었다.8 . 그러나 이 프로토콜을 설명하는 원래 작업은 DOX 철회 후 14DIV에서 이식을 수행했습니다.9. 이것은 어미의 식수에 있는 DOX가 우유를 통해 수유 강아지의 뇌에 이식된 세포에 도달할 수 있는지 또는 DOX 유도의 7DIV가 GABAergic 운명을 확립하기에 충분한지에 대한 질문을 제기합니다. Yang 등은 시험관 내9에서 안정한 신경 세포를 생성하기에 충분한 14일간의 DOX를 확인했지만, Gonzalez-Ramos 등8은 이미 7DIV에서 GAD1 유전자 발현을 검출했으며, 이는 Ascl1 및 Dlx2에 의한 GAD67의 다운스트림 활성화가 이 시점에서 이미 발생했음을 나타냅니다. 따라서 패터닝은 7 DIV에서 시작되었으며 DOX 처리에 덜 의존 할 수 있습니다. 또한, 설치류와 인간에서의 증거는 모유 31,32에서 DOX의 존재를 나타내며, 여기에 제시된 결과는 이식 된 hdIN이 2 주 및 2 개월 PT에서Ascl1에 대해 면역 반응성을 나타내고 나중에 9 개월 PT에서 interneuron 마커에 대해 면역 반응성을 나타냄을 보여줍니다. 이식 된 집단 내에서 PV 및 SST 양성 뉴런 외에도 칼 레티 닌 (CR) 및 칼 빈딘 (CB)과 같은 인터 뉴런의 하위 집단에 대한 다른 마커도 더 적은 양으로 발견되었습니다.
이 절차의 어려운 측면은 강아지의 분화와 나이에 대한 타이밍을 조정하는 것입니다. 일반적으로 마우스 임신은 짝짓기 케이지를 설정 한 후 21 일이 걸리지 만 때로는 다를 수 있습니다. 이 시나리오는 모든 것이 신중하게 계획되고 준비 될 수있는 성인 설치류에서 세포 이식을 수행 할 때 발생하지 않습니다. 그럼에도 불구하고 이는 2일 간격으로 2-3개의 짝짓기 케이지를 설정하거나 2일 타임랩스가 있는 2-3개의 차별화 배치를 서로 설정하여 쉽게 완화할 수 있습니다.
이 연구에 사용 된 마우스는 면역 결핍이나 면역 억제가 아니었지만 이식 된 세포는 생체 내에서 최대 9 개월까지 생존했으며 이종 세포 또는 국소 염증에 대한 면역 반응 마커는 P14 또는 2 개월 PT에서 관찰되지 않았습니다. 이식 된 이종 세포의 면역 거부는 MHC / 펩티드에 대해 촉발되며, 이식 거부의 주요 세포 매개체는 T 림프구 및 소교 세포33, 34. 따라서, T 세포의 마커에 대한 면역 반응성 및 반응성 미세 아교 세포가 탐구되었다. 숙주 조직에서 이식 된 세포의 면역 거부 징후는 반응성 미세 아교 세포의 수준 또는 P14 또는 2 개월에 WT 마우스에서 T 림프구의 존재에 의해 검출되지 않았다. 또한, 평가된 성상교세포 증 및 염증성 사이토카인의 수준에 기초한 국소 염증은 관찰되지 않았다. 이러한 결과는 부분적으로 다른 세포 정체성, 위치 및 동물 모델(35,38)에 의해 관찰된 신생아 면역 관용(35,36,37)에 의존할 수 있다. Englund et al.은 인접한 백질35에서 이식 된 세포의 관찰을 포함하여 이동 및 성숙 측면에서 이식 된 세포의 결과에서 지역적 차이를 확인했습니다.
마지막으로, hdIN이 이식 된 코어25로 남아있는 성인 설치류에 이식 한 다른 연구에 비해 해마 내에서 이식 된 세포의 더 큰 분산이 관찰되었다. 이 분산은 또한 이전에 Yang et al.9에 의해 관찰 된 결과와 달랐으며,이 경우 이식시 세포의 나이로 설명 될 수 있습니다.

뉴런 네트워크의 확립, 성숙 및 개선은 주 산기 및 출생 후 초기에 발생하며 뇌 발달에 중요한 시간 창을 나타냅니다1. 출생 후 연결성의 풍요로움에서 뇌는청소년기까지 연장되는 연결의 미세 조정으로 진화합니다2. 결과적으로이 기간 동안 발현 된 유전자의 변화와 외부 요인 또는 모욕은 여러 신경 발달 장애에 대한 개인의 소인을 정의합니다. 인지 및 운동 기능의 손상은 시간이 지남에 따라 전개되며 약리학 적 치료는 제한적이며 대부분은 심각한 부작용의 위험이있는 증상을 표적으로 삼습니다.
감마-아미노부티르산(GABA)성 억제의 기능 장애는 취약 X 증후군, Angelman 증후군, 간질, 정신분열증 및 자폐증과 같은 다양한 신경 발달 장애3의 근본 원인에 주요 기여하는 것으로 나타났습니다. GABA는 중추 신경계의 주요 억제 전달 물질이며 흥분성 / 억제 성 (E / I) 균형, 신경 발사의 동기화 및 계산을 유지하는 데 도움이됩니다. GABA 성 인터 뉴런은 이질적인 뉴런 집단으로, 더 복잡한 뇌 영역4 및 진화 5,6에서 기능적 복잡성이 증가합니다. 인간 뇌의 제한된 내인성 재생 능력과 여러 신경 장애에서 인터 뉴런 기능 장애의 의미를 고려할 때, GABA 성 인터 뉴런의 이식은 탐구 할 유망한 치료 방법이 될 수 있습니다. 이 라인을 따라, 인간 줄기 세포 유래 GABA 성 인터 뉴런 유사 세포 (hdIN)는 설치류 동종 뉴런 전구체 또는 다른 곳에서 사용 된 다른 공급원과 비교하여이 목적을위한 가장 번역 가능하고 실행 가능한 공급원 인 것으로 보인다7. 다양한 세포 공급원으로부터 GABA 성 뉴런을 생성하기위한 프로토콜은 8,9,10,11,12,13을 사용할 수 있지만, hdIN이 발달중인 병리학 적 뇌에서 시간이 지남에 따라 성숙, 통합 및 기능하는 방법에 대한 더 많은 지식이 필요합니다. 여러 연구에서 피질 패턴 동안 활성화된 유전자의 변화, 뉴런 연결성14 확립, 생리적 E/I 균형조정 15을 확인했습니다. 상응하는 유전 적 섭동이있는 마우스 모델에 hdIN의 신생아 이식을 통해 숙주와 이식편 사이의 상호 작용을 추적 할 수 있으며, 이는 잠재적 인 치료 전략을 결정하는 데 필요한 지식입니다.
면역조절은 숙주 면역 반응 및 거부 반응을 유발하는 것을 피하기 위해 이종이식 이식에 통상적으로 그리고 성공적으로 사용된다16. 그러나, 사이클로스포린 A와 같은 면역 억제제의 투여는 만성 투여 후 신장 독성을 유발하고, 안정적인 전신 농도를 달성하기 위해 매일 복강 주사가 필요하기 때문에 노동 집약적이며, 동물 스트레스17을 유발하고, 병리학(18)과 상호 작용할 수있는 오프 타겟 효과를 갖는다. 또한, 면역 체계를 손상시키는 것은 행동 표현형 (19)을 변화시키는 것으로 나타 났으며, 상응하는 신경 해부학 적 영역(20)의 변화가 있었다. 생후 첫 주에 이식하면 이식 된 세포21,22에 적응할 수있는 것으로 나타 났으며, 다른 사람들은 출생 후 첫 달 23,24 이내에 이식편을 거부 한 후 초기 생존을보고했습니다.
이 프로토콜은 신생아 마우스에서 hdIN 생성에서 세포 이식에 이르는 절차를 설명하여 장기 이식 생존을 초래하고 생리적 및 병리학적 발달 동안 이식된 인간 인터뉴런의 뉴런 특이성, 시냅스 통합, 기능 및 치료 잠재력을 조사할 수 있도록 합니다.

<table><tbody><tr><td>30 G 바늘</td><td>B Braun</td><td>4656300</td><td></td></tr><tr>Hamilton 주사기 <td>Hamilton</td><td>7762-06</td><td></td>4-well 플레이트<td>용 33 G 바늘</td></tr><tr><td></td><td>Thermo Scientific</td><td>176740</td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>7920</td><td>세포 분리 솔루션 세포 분할에 사용 (hESC 및 hdIN 전구체)</td></tr> <tr><td>조절 가능한 부피 피펫 10, 20, 200, 1000 &micro; L</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor Plus 488/555/647</td><td>Thermo Fisher</td><td></td><td>1:1000</td></tr><tr><td>Anti-CD68 (Rat)</td><td>Bio-Rad</td><td>MCA1957</td><td>1:200</td></tr><tr><td>Anti-CD8 (Rabbit)</td><td>Abcam</td><td>203035</td><td>1:200</td></tr><tr><td>Anti-Galectin 3 (염소)</td><td>R& D 시스템</td><td>AF1197</td><td>1:500</td></tr><tr><td>Anti-GFAP (Guiena Pig)</td><td>시냅스</td><td>시스템 173004</td><td>1:500</td></tr><tr><td>Anti-IBA1 (토끼)</td><td>WAKO</td><td>19119741</td><td>1:500</td></tr><tr><td>Anti-IL1 (염소)</td><td>Santa Cruz Biotech</td><td>SC-106</td><td>1:400</td></tr><tr><td>Anti-Ki67</td><td>Abcam</td><td>ab16667</td><td>1:250</td></tr><tr><td>Anti-Ki67 (토끼)</td><td>Novocastra</td><td>NCL-Ki67p</td><td>1:250</td></tr><tr><td>Anti-MAP2 (닭)</td><td>Abcam</td><td>ab5392</td><td>1:2000</td></tr><tr><td>Anti-Mash1 (Ascl1)</td><td>Abcam</td><td>ab74065</td><td>1:1000</td></tr><tr><td>Anti-Parvalbumin (토끼)</td><td>Swant</td><td>PV 27</td><td>1:5000</td></tr><tr><td>Anti-Somatostatin (Rat)</td><td>Millipore</td><td>MAB354</td><td>1:150</td></tr><tr><td>Anti-STEM121 (Mouse)</td><td>Takara Bio</td><td>Y40410</td><td>1:400</td></tr><tr><td>Avidin/Biotin 차단 키트</td><td>VECTOR Laboratories</td><td>SP-2001</td><td></td></tr><tr><td>B6.129(Cg)-Cntnap2tm1Pele/J</td><td>Jackson Laboratory</td><td>17482</td><td>동물 모델</td></tr><tr><td>비오틴화 말 안티 마우스</td><td>VECTOR Laboratories</td><td>BA-2001</td><td>1:200</td></tr><tr><td>Burker Chamber</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10628431</td><td></td></tr><tr><td>C57BL/6J</td><td>Janvier Labs</td><td></td><td>동물 모델</td></tr><tr><td>15 mL 튜브용</td> <td>원심분리기</td><td></td><td></td></tr><tr><td>컨포칼 현미경</td><td>Nikon&nbsp;</td><td>Confocal A1RHD 현미경</td><td></td></tr><tr><td>Costar 6-well Clear TC-처리됨&nbsp;</td><td>코닝</td><td>3516</td><td></td></tr><tr><td>Cy3 Streptavidin</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>016-160-084</td><td>1:200</td></tr><tr><td>사이토신 &베타;-D-아라비노푸라노시드 (AraC)</td><td>시그마</td><td>C1768</td><td>4 &마이크로; M</td></tr><tr><td>DAB 기판 키트, 과산화효소(니켈 포함)</td><td>VECTOR Laboratories</td><td>SK-4100</td><td></td></tr><tr><td>Digital Stereotax</td><td>KOPF</td><td>Model 940</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11320082</td><td>N2 배지</td></tr><tr><td>DNase I 용액</td>에 사용 <td>STEMCELL Technologies</td><td>7900</td><td>1 &micro; g/mL</td></tr><tr><td>독시사이클린</td><td>시그마-알드리치</td><td>D9891</td><td>2 &마이크로; g/mL</td></tr><tr><td>DPBS -/-</td><td>Gibco</td><td>14190144</td><td></td></tr>형<tr><td>광 현미경</td><td>Olympus</td><td>BX51 현미경</td><td></td></tr><tr><td>에탄올</td><td>Solveco</td><td></td><td>70%, 95%, 99.8%</td></tr><tr><td>FUW-rTA</td><td>Addgene</td><td>20342</td><td>렌티바이러스 벡터</td></tr><tr><td>FUW-TetO-Ascl1-T2A-puromycin</td><td>Addgene</td><td>97329</td><td>렌티바이러스 벡터</td></tr><tr><td>FUW-TetO-Dlx2-IRES-hygromycin</td><td>Addgene</td><td>97330</td><td>렌티바이러스 벡터</td></tr><tr><td>H1 (WA01) ESC</td><td>WiCell</td><td>WA01</td><td>MTA 계약에 따른 인간 배아 줄기 세포주</td></tr><tr><td>H2O2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>18304</td><td></td></tr><tr><td>Hamilton Syringe</td><td>Hamilton</td><td>7634-01</td><td>5 &micro; L</td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Gibco</td><td>14175095</td><td>칼슘 없음, 마그네슘 없음 - 이식 매체</td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Invitrogen</td><td>H3570</td><td>1:1000</td></tr><tr><td>Hygromycin B</td><td>Gibco (Invitrogen)</td><td>10687010</td><td></td></tr><tr><td>인큐베이터</td><td></td><td></td><td>5% CO2, 37 &deg; C</td></tr><tr><td>Isoflurane Baxter</td><td>Apoteket AB</td><td></td><td></td></tr><tr><td>수동 세포 계수기</td><td>VWR</td><td>720-1984</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel hESC 인증 매트릭스, LDEV-free</td><td>코닝</td><td>354277</td><td>코팅용</td></tr><tr><td>메탄올</td><td>Merck Millipore 1060091000</td><td></td><td></td></tr><tr><td>현미경 커버슬립 24 x 60 mm</td><td>Thermo Scientific</td><td>BBAD02400500#A113MNZ#0#</td><td></td>#</tr><tr><td>현미경 슬라이드</td><td>VWR</td><td>631-1551</td><td></td></tr><tr><td>현미경 소프트웨어</td><td>Olympus</td><td>CellSens</td><td></td></tr><tr><td>마운팅 미디어</td><td>Merck</td><td>10981</td><td>PVA-Dabco&nbsp;</td></tr><tr><td>스테레오탁</td>스 <td>RWD</td><td>68030</td><td></td></tr><tr><td>mTeSR1</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>85850</td><td>키트 기초 배지 및 5X 보충제 - 줄기 세포 배양 배지</td></tr><tr><td>N2 보충제</td><td>Gibco</td><td>17502048</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8045</td><td>1M</td></tr><tr><td>페니실린-스트렙토마이신</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0781</td><td></td></tr><tr><td>Pertex</td>에 마우스 어댑터<td>HistoLab</td><td>811</td><td></td></tr><tr><td>피펫 필러</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Play-Doh</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Puromycin (Dihydrochloride)</td><td>Gibco</td><td>A1113803</td><td></td></tr><tr><td>라운드 커버 안경 두께 No. 1.5H (tol. &plusmn; 5 &mu; m) 13mm &오슬래시;</td><td>Marienfeld</td><td>MARI0117530</td><td>면역세포화학용</td></tr><tr><td>혈청</td><td>써모 피셔</td><td></td><td>염소, 당나귀, 말</td></tr><tr><td>멸균 피펫 팁</td><td></td><td></td><td>용량 0.1-1000 &마이크로용; L</td></tr><tr><td>멸균 혈청학 피펫</td><td></td><td></td><td>5, 10, 25 mL</td></tr><tr><td>멸균 물 브라운</td><td>B 브라운</td><td>3626873</td><td></td></tr><tr><td>자당</td><td></td><td>S8501</td><td>0.5 % 자당 용액</td></tr><tr><td>트리톤 X-100</td><td>시그마 -알드리치</td><td>X100</td><td></td></tr><tr><td>트리판 블루 솔루션</td><td>Gibco</td><td>15250061</td><td></td></tr><tr><td>튜브</td><td>Sarstedt</td><td></td><td>15 ml, Eppendorf 1.5 mL</td></tr><tr><td>핀셋</td><td>VWR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>초순수</td><td></td><td></td><td>MilliQ Water System</td></tr><tr><td>Xylene</td><td>VWR</td><td>28973.363</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632 (ROCK inhibitor)</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>72304</td><td>10 &micro; 미디엄</td></tr></tbody></table>

신경 발달 장애를 완화하기 위해 인간 줄기 세포 유래 gaba 성 뉴런을 출생 후 초기 마우스 해마에 이식

Transplantation of Human Stem Cell-Derived GABAergic Neurons into the Early Postnatal Mouse Hippocampus to Mitigate Neurodevelopmental Disorders

억제 성 인터 뉴런의 감소 된 수 또는 기능 장애는 신경 발달 장애의 일반적인 원인입니다. 따라서 변경된 신경 회로의 효과를 대체하거나 완화하기 위해 인터 뉴런을 사용하는 세포 요법은 매력적인 치료 방법입니다. 이를 위해서는 인간 줄기 세포 유래 GABA 성 인터 뉴런 유사 세포 (hdIN)가 숙주 회로에서 시간이 지남에 따라 어떻게 성숙, 통합 및 기능하는지에 대한 더 많은 지식이 필요합니다. 신경 발달 장애에서 특히 중요한 것은 이식 된 세포에서 이러한 과정이 진화하고 성숙하는 숙주 뇌의 영향을 받는지 여부를 더 잘 이해하는 것입니다. 본 프로토콜은 전사 인자 Ascl1 및 Dlx2의 형질전환 발현에 기초한 인간 배아 줄기 세포로부터의 hdIN의 빠르고 매우 효율적인 생성을 기술한다. 이 신경 전구체는 시험관 내에서 7 일 후에 신생아 2 일 된 마우스의 해마에 일방적으로 이식됩니다. 이식 된 뉴런은 피질 이형성증-국소 간질 증후군의 마우스 모델의 동측 및 반대쪽 해마에 분산되어 이식 후 최대 9 개월 동안 생존합니다. 이 접근법은 건강하고 병든 뇌를 개발하는 데 장기간에 걸쳐 이식 된 인터 뉴런의 세포 정체성, 통합, 기능 및 치료 잠재력을 조사 할 수있게합니다.

여기에 제시되고 도 1A에 예시된 프로토콜에 따라, hdIN 전구체는 (i) 세포 주기 마커 Ki67에 대한 음성 면역반응성 및 (ii) 미세소관 관련 단백질 2(MAP2)와 같은 뉴런 마커를 발현하는 것에 의해 정의된 바와 같이 7 DIV에서 아직 증식하지 않았다(도 1B-E). 이 특성화는 모든 절차 단계를 거친 후 24시간 동안 재도금된 남은 세포에 대해 수행되었습니다. 또한, 이전에 발표 된 유전자 발현 분석은 만능 상태에서 뉴런 표현형으로의 빠른 전이가 4 DIV와 7 DIV8 주변에서 발생한다는 것을 나타 냈습니다. 전반적으로, 이러한 결과는 유사분열 후 세포의 존재와 기형종 형성 위험의 부재를 확인했다.
다음으로, 야생형(WT) 마우스의 해마에 조기 출생 후 이식 후 hdIN 전구체의 생존을 인간 세포질 마커 STEM121에 대해 면역조직화학에 의해 시험하였다. hdIN 전구체를 P2에서 나이브 면역적격 마우스의 우측 등쪽 해마에 이식한 다음, P14 및 2개월 PT에서 희생시켰다. 이식된 세포는 전체 등쪽 해마에 걸쳐 발견되었을 뿐만 아니라 뇌량과 반대쪽 해마를 통해 두 시점에서 분산되었다. 또한, 두 시점 모두에서 이식된 hdIN은 유도 전사 인자 중 하나인 Ascl1을 발현했으며(보충 그림 1), Ki67 발현의 부재로 표시된 바와 같이 증식하지 않았습니다(보충 그림 2).
중요하게도, Iba1, CD68 및 갈렉틴-3 (Gal3)을 사용하여 확인된 반응성 미세아교세포의 부재에 의해 평가된 바와 같이, 이식된 세포에 대한 면역 반응 또는 국소 염증은 발견되지 않았으며, 신경교세포섬유산성 단백질(GFAP) 및 염증성 사이토카인, 예컨대 인터루카인-1(IL-1)에 의해 결정된 성상교증의 정도, 및 세포 독성 T 림프구 (CD8)의 부재 (그림 4).
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64272/64272fig03.jpg"> 그림 3 : 숙주 조직에서 면역 거부를 유발하지 않고 신생아 WT 마우스의 해마로 P14 및 2 개월 PT에서 hdIN. (A-D) 전기응고 뇌졸중 마우스 모델에서 허혈성 코어 영역의 근접성 (양성 대조군, Ctrl+), (E-H) 음성 대조군 동물 (Ctrl-) 2개월에 및 (M-P) P14, 및 (I-L) 2개월에 세포 이식을 받은 동물 및 (Q-T)에서 뇌 조직에서 Iba1, CD68 및 Gal3 마커에 대한 면역형광법 ) p14. 흰색 화살표는 자가 형광으로 인해 모든 채널에서 볼 수 있는 혈관의 몇 가지 예를 나타냅니다. 약어 : Ctx = 피질; 엉덩이 = 해마; DG = 치아 이랑; CA1 = 산수유 암모니스 1. 스케일 바: 50 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64272/64272fig03large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64272/64272fig04.jpg"> 그림 4: 숙주 조직에서 면역 거부를 유발하지 않고 신생아 WT 마우스의 해마로 2개월 PT에 hdINs. (A-D) 전기응고 뇌졸중 마우스 모델에서 허혈성 코어 영역의 근접성(양성 대조군, Ctrl+), (E-H) 음성 대조군 동물(Ctrl-) 2개월, 및 (I-L)2개월에 세포 이식을 받은 동물로부터의 뇌 조직에서 IL1, GFAP 및 CD8 마커에 대한 면역형광. 약어 : Ctx = 피질; 엉덩이 = 해마; DG = 치아 이랑. 스케일 바: 50 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64272/64272fig04large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
유사하게, hdIN 전구체는 또한 자폐 스펙트럼 장애 및 피질 이형성증-국소 간질 증후군의 모델인 Cntnap2 KO 마우스의 해마에 이식되었다. 실제로 Cntnap2 KO 마우스에서 hdIN은 최대 9 개월 PT까지 생존했으며 WT 마우스에서 관찰 된 바와 같이 동측 및 반대쪽 해마에 분산되었지만 주사 부위에 국한되었습니다 (그림 5). 또한, 이식 된 hdIN의 대부분은 시험관 내 8,26 및 생체 내 성인 설치류 25에서 이전 결과에서 예상 한 바와 같이 인터 뉴런 마커에 대해 면역 반응성이었다.
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64272/64272fig05.jpg"> 그림 5: 9개월 PT에 Cntnap2 KO 마우스의 해마에 이식된 hdIN. (A) 세포 이식 (왼쪽) 및 가짜 (오른쪽) 마우스에서 세포질 인간 마커 STEM121에 대한 면역 화학. (A1 및 A2) STEM121 양성 세포의 확대 이미지. (B) STEM121 (자홍색) 및 인터뉴런 마커 파브알부민(PV) 및 소마토스타틴(SST)에 대한 면역형광법. 흰색 화살표는 STEM121 및 각각의 인터뉴런 마커에 대한 이중 양성 세포를 나타냅니다. (C) STEM121 및 PV에 대한 이식된 hdIN 면역반응성의 직교도. 스케일 바: 200μm(A 및 B), 100μm(a1 및 a2), 20μm(a1 및 a2 및 C의 작은 정사각형 배율). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64272/64272fig05large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
보충 그림 1 : Ascl1을 발현하는 신생아 WT 마우스의 해마에 2 개월 PT에 hdIN을 이식했습니다. 세포-이식된 WT 마우스에서 (A) CA3 및 (B) DG에서 Ascl1 및 세포질 인간 마커 STEM121에 대한 면역형광. (a) STEM121 양성 세포의 확대 이미지. 흰색 화살표는 STEM121 및 Ascl1에 대한 이중 양성 셀을 나타냅니다. 스케일 바: 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64272/Supplementary%20Figure%201_vertical_.eps" target="_blank">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>
보충 그림 2 : 유사 분열 후 hdIN을 2 개월 PT에 신생아 WT 마우스의 해마에 이식했습니다. (A) 나이브 및 (B) 세포-이식된 WT 마우스에서 증식성 마커 Ki67 및 세포질 인간 마커 STEM121에 대한 면역형광. (b) STEM121 양성 세포의 확대 이미지. 노란색 화살표는 Ki67에 대해 양성이고 STEM121에 대해 음성인 세포를 나타냅니다. 흰색 화살표는 STEM121에 대해 양성이고 Ki67에 대해 음성인 세포를 나타냅니다. 흰색 별표는 측면 심실을 가리 킵니다. 스케일 바: 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64272/Supplementary%20Figure%202_vertical_.eps" target="_blank">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>

신경 프로그래밍에 의해 생성 된 인간 다 능성 줄기 세포 유래 GABA 성 뉴런의 이식은 신경 발달 장애에 대한 잠재적 인 치료 접근법이 될 수 있습니다. 이 프로토콜은 인간 줄기 세포 유래 GABA 성 뉴런 전구체의 생성 및 신생아 마우스의 뇌에 이식하여 이식 된 뉴런의 장기 조사 및 치료 잠재력 평가를 가능하게합니다.

신경 발달 장애를 완화하기 위해 인간 줄기 세포 유래 GABA 성 뉴런을 출생 후 초기 마우스 해마에 이식

A reduced number or dysfunction of inhibitory interneurons is a common contributor to neurodevelopmental disorders. Therefore, cell therapy using ...

이 접근법은 건강하고 병든 뇌를 발달시키는 데 장기간에 걸쳐 이식 된 인터 뉴런의 세포 정체성, 통합 및 기능을 조사 할 수있게합니다. 이 프로토콜은 순진하고 형질 전환 마우스의 해마로 생존하고 성숙하는 전구체와 같은 인간 줄기 세포 유래 GABA 성 인터 뉴런의 빠르고 효율적인 생성을 설명합니다. 이 접근법은 인터뉴런이 손상된 발달 장애에서 세포 요법을 사용하는 치료 잠재력을 평가하는 데 도움이 됩니다.시작하려면 인간 유래 인터뉴런 전구체에서 세포 배양 배지를 제거하고 칼슘과 마그네슘이 없는 DPBS로 조심스럽게 헹굽니다. 400 마이크로 리터의 세포 분리 용액을 6 웰 플레이트의 각 웰에 첨가한다. 세포의 경계가 반짝이기 시작할 때까지 인큐베이터에서 섭씨 37도에서 2-3 분 동안 배양하십시오.그런 다음 6웰 플레이트의 각 웰에 600마이크로리터의 신선한 N2 배지를 추가하여 세포 분리 용액을 중지하고 피펫을 사용하여 세포를 기계적으로 분리하여 단일 세포 현탁액을 얻습니다. 세포 현탁액을 플라스틱 튜브로 옮기고 실온에서 4분 동안 180G에서 원심분리합니다. 진공 시스템을 사용하여 상청액을 버리고 펠렛을 이식 배지에 재현탁시킨다.계수 챔버 및 탈리 카운터를 사용하여 현탁액 중의 총 세포를 계수하고, 마이크로리터당 100, 000 세포의 최종 농도로 부피를 조절한다. 최대 4 시간 동안 이식 될 때까지 얼음 위의 밀폐 된 튜브에 세포 현탁액을 보관하십시오. 마취 직후, 강아지를 젖은 얼음 표면의 젖은 티슈에 3 분 동안 올려 놓고 상지가 희끄무레해질 때까지 놓습니다.피펫으로 세포를 조심스럽게 재현탁하고 주사기에 세포 현탁액을 로드합니다. 강아지를 정위 프레임에 놓고 이어 바를 반대 방향으로 사용하여 강아지를 배치하십시오. 다음으로, 에탄올에 담근 연조직을 사용하여 피부 표면을 청소하십시오.lambda를 식별하고 입체 계측기의 디지털 디스플레이 콘솔에서 좌표를 0으로 설정합니다. 해밀턴 주사기를 원하는 좌표로 재배치 한 후 90도 구부러진 인슐린 바늘을 사용하여 두개골을 관통하여 작은 구멍을 만듭니다. 그런 다음 바늘이 두개골을 가로 지르고 배복부 좌표가 0이 될 때까지 해밀턴 주사기를 내립니다.원하는 배복부 좌표가 달성 될 때까지 바늘을 내립니다. 줄기 세포가 주입되면 바늘을 천천히 수축시킵니다. 강아지가 움직이기 시작할 때까지 손으로 강아지를 데우고 어미에게 돌려주는 절차를 종료하십시오.Iba1, CD68 및 galectin-3을 사용하여 확인 된 반응성 미세 아교 세포의 부재로 평가 된 바와 같이 이식 된 세포에 대한 면역 반응 또는 국소 염증은 출생 후 14 일 또는 이식 후 2 개월에 발견되지 않았습니다. 성상 교세포의 정도는 신경교 섬유 산성 단백질 및 염증성 사이토 카인, 예를 들어 인터루킨 -1 및 세포 독성 림프구의 부재에 의해 결정됩니다. Cntnap2 녹아웃 마우스에서, 인간 줄기 세포 유래 인터 뉴런 유사 세포는 이식 후 최대 9 개월까지 생존했으며 주사 부위에 국한되었다.그러나 그들은 또한 야생형 마우스에서 관찰 된 것처럼 동측 및 반대측 해마에 분산되었습니다. 이 프로토콜은 뇌의 혼란과 압축을 최소화하고 절차 속도와 좌표의 정밀도 사이의 균형을 잘 유지하기위한 연습이 필요합니다. 이 프로토콜은 연구, 관심 질문에 따라 연결 연구 또는 전기 생리학 또는 행동 연구와 같은 기능 판독과 같은 다양한 기술과 호환됩니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

뇌종양 환자는 정기적으로 두개골 방사선 치료를 받아야하고, 쇠약인지 장애에 도움이 치료는 종종 결과를하면서. 이 심각한 해결되지 않은 문제는, 현재도 임상을 일으키하지 않으며 방사선 유발인지 감소의 복구를 위해 줄기 세포 기반 요법을 고안하기 위해 노력을 주도하고 있습니다.

두개골 방사선 치료에 의한인지 기능 장애의 회복을위한 세포 이식 전략을 줄기

출처: Furmanski, O., et al. 인간 유도 만능 줄기 세포 유래 신경 세포의 치료적 이식을 통한 마우스 뇌 손상의 제어된 피질 충격 모델. J. Vis. 경험. (2019년)이 비디오에서는 외상성 뇌 손상의 마우스 모델에서 인간 유도 만능 줄기 세포 유래 신경 세포를 심부 피질의 회백질-백질 경계에 입위적으로 주입합니다. 이식된 세포는 조직에 통합되어 손상된 뇌의 기능 회복과 회로 복구를 촉진합니다.

외상성 뇌손상이 있는 마우스에 신경 세포 현탁액의 정위 이식

출처: Quattrocolo, G., et al. 출생 후 초기 마우스 뇌에 Interneuron 전구체의 동시성 이식. J. Vis. 경험. (2018년)이 비디오는 동소성 또는 이소성 접근법을 사용하여 중간 뉴런 전구체 세포를 신생아 마우스 뇌에 이식하는 방법을 보여줍니다. 이 절차에는 마취된 수혜자 강아지를 고정하고, 표적 뇌 영역을 식별하고, 동일한 발달 단계에서 기증자 강아지에서 유래한 전구체 세포 현탁액을 주입하는 과정이 포함됩니다. 주사 후 새끼는 회복을 위해 온열 패드로 옮겨져 기증자 세포 생존 및 성숙에 대한 후속 평가가 가능합니다.

쥐 새끼의 뇌에 Interneuron 전구 세포의 이식

출처: Gonzalez-Ramos, A., et. al., 신경 발달 장애를 완화하기 위해 인간 줄기 세포 유래 GABA성 뉴런을 출생 후 초기 마우스 해마로 이식. J. Vis. 경험. (2022년)이 비디오는 흥분-억제 균형을 회복하는 것을 목표로 억제성 중간 뉴런이 감소된 유전자 변형 쥐 새끼의 해마에 인간 유래 중간 뉴런 전구체 세포를 정위 주입하는 방법을 보여줍니다.

인간 유래 중간 뉴런 전구 세포를 마우스 새끼 해마에 이식

이 프로토콜 수정된 embryoid 몸 단층 메서드를 사용 하 여 마우스 배아 줄기 세포에서 대뇌 피 질의 interneuron 창시자와 포스트 mitotic interneuron 선구자를 생성 하는 방법을 설명 합니다. 이러한 창시자/선구자 사용 생체 외에서 또는 붙일 정렬 및 운명 결정, 공부에 대 한 신생아 피 질에 이식 하거나 수 치료 응용 프로그램에 사용.

대뇌 피 질의 Interneuron 선구자로 마우스 배아 줄기 세포의 분화

새로운 두뇌 지구에서 젊은 신경 도전 어떻게 환경 sculpts 신경 운명과 성숙에 중요 한 통찰력을 밝힐 수 있다. 이 프로토콜 interneuron 선구자 특정 두뇌 지역에서 수확 하 고 그들에 게 어느 homotopically를 이식 하는 절차에 설명 합니다 또는 출생 후 새끼의 뇌에 heterotopically.

이른 출생 후 마우스 두뇌로 Interneuron 선구자의 Homochronic 이식

이 프로토콜은 두개골 외상성 뇌 손상의 마우스 모델과 배양된 인간 유도 만능 줄기 세포 유래 세포의 이식에 대한 방법론을 상해 부위내로 시연한다. 이 절차에서 결과의 행동 그리고 조직학 시험은 또한 간략하게 기술됩니다.

인간 유도 만능 줄기 세포 유래 신경 세포의 치료 이식으로 마우스 뇌 손상의 제어 피질 영향 모델

여기에서 우리는 초기 출생 후 마우스의 피질로 이식된 피질 interneuron 선조의 활동을 조작하기 위하여 화학유전학 공구를 이용하기 위하여 디자인된 프로토콜을 제시합니다.

화학유전학적으로 조작된 피질 인터뉴런 선조를 출생 후 마우스 뇌로 이식

여기에 제시된 프로토콜은 면역적격 마우스에서 경비강 경로를 통해 유도된 만능 줄기 세포 유래 인간 미세아교세포(iPSMG)를 뇌로 이식하는 것을 허용한다. iPSMG의 유지를 위한 세포의 제조 및 경비강 이식 및 사이토카인 혼합물의 투여를 위한 방법이 제시된다.

비침습적 경비강 경로를 통한 면역적격 마우스 뇌에서 인간 유도 만능 줄기세포 유래 미세아교세포의 이식

설립 demyelination과 생쥐의 척수 코드에 마우스를 신경 줄기 세포 (NSCs)의 이식이 자세히 있습니다. NSCs의 준비는 흉부 척추 9 조 (T9) 및 NSCs의 이식의 laminectomy은 생쥐의 사전 및 사후 수술 치료와 함께 설명되어 있습니다.

Neurotropic 마우스 간염 바이러스에 감염된 마우스의 척수 코드에 마우스 신경 줄기 세포의 이식 외과

학습하세요 인간 줄기세포 유래 GABA 성 뉴런을 신생아 마우스 해마에 이식하여 신경 발달 장애의 세포 치료 가능성을 평가하는 방법입니다. 이 기술은 장기간 생존 및 뇌 통합 메커니즘 연구에 활용됩니다.

신경 발달 장애를 완화하기 위해 인간 줄기 세포 유래 GABA 성 뉴런을 출생 후 초기 마우스 해마에 이식

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