Name: 대 식 세포에의 한 사 멸 티 모 세포 침 몰의 실험 분석 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-05-24T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 47 s
Description: 학습하세요 대식세포에 의한 사멸 티모세포 침몰 실험 분석 방법을. C57BL/6 마우스에서 티모세포를 분리하고 CFSE 표지 후 스타우로스포린으로 사멸을 유도합니다. 티오글리콜레이트로 자극한 복강 대식세포를 분리하여 공배양하고, 효율적인 세포제거 작용과 억제제 효과를 평가합니다.

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Shao 연구소에서 연구는 의학의 대학에서 연구 혁신 상을 지원 하 고 내과, 신시내티 대학과 NIDDK/NIH에서 DK K01_095067에서 주니어 학부 조종사 상을 수상.

실험 마우스는 우리의 마우스 콜로 니에서 사육 되 고 유지 되었다. 모든 동물 작업은 신시내티 대학의 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC)의 지침에 따라 수행 되었다.
1. CFSE 표지 된 사 멸 계 세포의 준비
<ol><li>두 명의 순진한 C57/B6 마우스를 CO2 흡입 하 여 흉 강을 열고 해 부에 2 개의 생쥐를 안락사 시키고, 10 ML의 RPMI1640 배지를 함유 하는 조직 배양 페 트리 디쉬에 곡선형 파인 팁 집게를 사용 하 여 흉 선을 제거 한다.</li>
	<li>현미경 슬라이드의 두 프 로스트 엔드에 대해 전체 흉 선을 연 삭 하 여 단일 세포 현 탁 액을 얻은 다음 100 μ m 세포 스 트레이너를 통해 현 탁 액을 필터링 합니다.</li>
	<li>10 mL의 흉 선 현 탁 액을 50 mL 튜브에 넣고, 300 x g 에서 5 분간 원심 분리 합니다.</li>
	<li>상층 액을 제거 하 고, 1pb1의 40 mL의 소생을 하 고, 혈 세포 측정기로 세포 수를 셉니다.</li>
	<li>300 x g 에서 5 분간 원심 분리 하 고 상층 액을 제거 한다.</li>
	<li>50 mL 튜브의 단일 세포 현 탁 액으로 서 20ml(12 x 8 세포 이상)의 1 세포 서 스 펜 션으로 20 ML의 pbs에서 소생 하 여 다른 50 ml 튜브에서 1xpbs의 다른 20ml의 다른 세포를 소생 시켰다.</li>
	<li>5 μ m의 cfse를 별도의 50 ml 튜브에 1pbs의 동일한 부피 (20ml)로 만들고 cfse 스톡 솔루션 (2.5 mM)의 40 μ l을 1x pbs로 파이 펫 팅 하 고 2-3 튜브를 반전 하 여 잘 섞어 줍니다.</li>
	<li>1.7 단계에서 CFSE 20 mL를 1.6 단계에서 20 mL의 세포 현 탁 액으로 추가 합니다 (CFSE의 최종 농도는 지금 2.5 μ m). 참고: 20Ml 셀 서 스 펜 션 마다 20 mL의 CFSE 튜브가 필요 합니다.</li>
	<li>세포 및 CFSE 혼합물 튜브를 2-3 번 반전 하 고 실 온에서 최대 2 분 동안 암실에서 혼합물을 배양 한 후, 열 불 활성화 말 세럼 10ml를 첨가 하 여 반응을 중지 한다.</li>
	<li>50 mL 튜브 혼합물을 실 온에서 5 분 동안 300 x g 에서 원심 분리기. 참고: CFSE 라벨링이 성공적 이면 셀 펠 릿은 컬러로 연한 노란색이 됩니다.</li>
	<li>상층 액을 제거 하 고 세포 펠 릿을 1x PBS의 40 mL로 소생 하 고 혈 세포 측정기로 세포 수를 셉니다.</li>
	<li>세포 현 탁 액을 300 x g 에서 5 분간 원심 분리 하 고 상층 액을 버립니다.</li>
	<li>RPMI1640 배지 40 mL로 세포 펠 렛을 다시 씻으십시오.</li>
	<li>RPMI1640 조직 배양 배지에서 상 등 액 및 소생 세포를 제거 하 고, 100 mm 조직 배양 접시에 7x106 세포/m l의 농도로 10% FBS (열 불 활성화), 20mm 글루타민 및 1x 펜/ strep를 사용 한다. 참고: 더 많은 세포를 얻을 경우, 별도의 100 mm 조직 배양 접시가 필요 합니다.</li>
	<li>5% CO2와 함께 공급 되는 조직 배양 인큐베이터에서 37 ° c에서 4 시간 동안 최종 농도 1 μ m의 세포 현 탁 액 배양 물에 슈 타우 로스포 린을 첨가 한다.</li>
</ol>2. 복 막 대 식 세포의 제조
<ol><li>두 개의 C57B6 마우스 (또는 실험실에서 유전자 조작 된 마우스)를 주사 하 여 0 일째에 3% 숙성 된 티 오 글 리 한을 1 mL로 복 강 내.</li>
	<li>단계 1.1에서와 같이 5 일째에 마우스를 안락사 시키고, 복 부 피부를 절단 하 고 껍질을 벗 겨 내 고 그대로 복 막 상태로 남겨 둡니다. 18G 바늘이 부착 된 10ml 주사기를 사용 하 여 10 mL의 세척 완충 액 (RPMI1640, 2% FBS, 0.04% EDTA)을 복 강 내로 빠르게 밀어 복 강 세척.</li>
	<li>동일한 바늘/주사기로 세척 버퍼를 천천히 검색 하 고 세척 완충 액을 50 mL 튜브에 모읍니다 (자세한 내용은 Janssen 연구소 제15조참조).</li>
	<li>복 막가 위를 1x PBS로 2 회 세척 하 고 24 웰 플레이트의 각 웰에 RPMI1640 세포/m l 및 분 취 액 500 μ l의 밀도로 하 여 조직 배양 배지에서 복 막 대 식 세포를 소생 시켰다. 2 시간 동안 티슈 배양 인큐베이터에 플레이트를 남겨 두십시오.</li>
	<li>신선한 배양 배지를 2 ~ 500 μ l로 흡입 및 교체 하 여 부유 세포를 제거 하십시오.</li>
	<li>선택적으로, 탐 수용 체 티로신 억제제, RXDX-106을 추가 하 고,도 전설에 나타난 농도에서 대 식 세포 배양의 각각의 웰에 넣고 또 다른 2 h를 배양 한다.</li>
</ol>3. 사 멸 티 세포가 있는 복 막 대 식 세포의 공동 배양
<ol><li>1 단계에서 사 멸 티 모 세포를 수집 하 고 RPMI1640 배지로 세 번 씻으십시오. 사 멸 유도의 효율은 아 넥 타 V/7-AAD 키트와 함께이 단계에서 측정할 수 있습니다.</li>
	<li>실험 배열 (예: 도 1참조)에 따라 #2 프로토콜 로부터 대 식 세포 배양 액의 각각의 웰에 0-12 x6 세포 (500 μ l 배지)를 분배 한다. 이는 24 웰 플레이트의 각 웰에 1 mL의 전체 배양 체적을 만든다. 사 멸 티 모 세포를 첨가 하기 직전에 상기 배양 액에 블로킹 항 체를 첨가 한다.</li>
	<li>세포 혼합물을 4 시간 동안 37 ° c에서 5% CO2와 함께 공급 된 조직 배양 인큐베이터에서 배양 한다.</li>
	<li>배양 액의 각 웰을 1x PBS (500 μ m EDTA를 함유)로 2 회 세척 하 여 자유 부유 사 멸 세포를 제거 한다.</li>
	<li>이 단계에서 CD11b으로 플레이트 바인딩된 대 식 세포를 얼룩.<ol>
<li>염색 완충 액으로 플레이트에 바인딩된 대 식 세포를 한 번 세척 하십시오 (PBS 1% BSA).</li>
		<li>각 웰에 CD11b 2 μ l를 함유 하는 염색 완충 액의 200 μ l를 첨가 한다.</li>
		<li>플레이트를 4°c에서 20 분 동안 배양 하였다.</li>
		<li>염색 완충 제를 사용 하 여 각 접시를 세 번 세척 합니다.</li>
		<li>염색 완충 액의 200 μ l를 첨가 하 고, 형광 현미경 하에서 이미지 분석용 판을 진행 한다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>대안적으로, PBS에 1% lidocaine를 첨가 하 고 37 ° c에서 10 분 동안 배양 하 여 플레이트 결합 대 식 세포를 분리 한다.</li>
	<li>반복 파이 펫 팅으로 플레이트 바운드 대 식 세포를 분리 합니다.</li>
	<li>대 식 세포 현 탁 액을 24 웰 플레이트의 각 웰에서 개별 5ml 둥근 바닥 FACS 튜브에 넣어 이동 합니다.</li>
	<li>5 분 동안 300 x g 에서 원심 분리기.</li>
	<li>상층 액을 제거 하 고 CD11b (1:200 염색 완충 액에서의 희석)의 2 μ l를 함유 하는 염색 완충 액의 200 μ l를 첨가 한다.</li>
	<li>세포 현 탁 액을 4°c에서 20 분 동안 염색 버퍼로 배양 한다.</li>
	<li>염색 버퍼로 세포 현 탁 액을 두 번 씻으십시오.</li>
	<li>염색 버퍼의 200 μ l를 추가 하 고 유 세포 측정기로 FACS 분석을 진행 하 고 CFSE 양성 대 식 세포의 백분율을 분석 합니다.</li>
</ol>

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</ol>

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세포 사 멸은 많은 신호 캐스케이드를 수반 하 고 단백질 발현, 분 비 및 수송을 유도 하는 고도로 보존 된 세포 사 멸 과정 이다. 아 폽 토시 스는 종종 세포 형태학 변화 (17)와 연관 된다. 사 멸 세포는 사이트에 이주 하 고 엄격한 통제18에서 매우 복잡 한 통로의 과정을 시작 하는 포식을 유치 하는 사이토카인 및 케 모카 인를 활발히 풀어 놓습니다. 한편, 괴 사 세포 사 멸은 염증 반응1을 유발 하는 위험 신호를 방출 한다. 사 멸 세포의 결함 또는 머리말을 붙인 클리어런스는이 세포의 이차 괴 사로 이끌어 냅니다19. 따라서, 세포 사 멸 유도의 타이밍은 실험에서 매우 중요 하다. 세포 아 폽 토시 스 (20)를 유도 하는 수많은 방법이 있다. 그러나 유도의 지속 기간과 강도는 셀 타입에 따라 다릅니다. ...

우리 몸은 매일 1-10 억 사 멸 세포를 생성 합니다. 이러한 많은 수의 사 멸 세포는 면역 반응이 정지 상태를 유지 하는 방식으로 지워야 합니다. 적시에 사 멸 세포의 틈새를 지키기 위하여는, 조직 주민 세포의 수많은 모형 및 회람 세포는 사 멸 세포를 삼 켜 하는 기계 장치를 개발 합니다1. 아 폽 토시 스의 기능 장애 조절은 다양 한 염증 성 질환 및 자기 면역의 발병 및 진행에 연루 되어 있다2. 아 폽 토시 스는 또한 종래의 치료법3,4에 대 한 그의 후속 내성 및 암 발병의 발병 기 전에 서 중요 한 역할을 한다. 사 멸 세포의 제거는 일반적으로 면역 내성5에 연결 될 수 있는 항 염증 반응을 촉진 합니다. 사 멸 세포 클리어런스의 교란은 자기 면역을 촉진 하 고 인간 및 생쥐6의 전신 자가 면역 질환의 발병에 기여 합니다.
세포가 아 폽 토시 스를 겪을 때, 그들은 포스 파티 딜 세 린 (PtdSer)을 내부 리플 렛에서 멤브레인의 외부 리플 렛에 노출 시킵니다. PtdSer는 표면 수용 체를 통해 식 세포에 의해 인식 될 것입니다. 12 개 이상의 수용 체는 사 멸 세포의 침 몰을 인식 및/또는 촉진 하는 것으로 확인 되었습니다. 일반적으로, 사 멸 세포 클리어런스에 관여 하는 표면 수용 체의 적어도 3 가지의 종류가 있습니다: 테 더 링 수용 체, 사 멸 세포를 인식; 수용 체 간 질, 침 몰 시작; 수용 체, 전체 과정을 용이 하 게7. 탐 수용 체 티로신 키나 제 (TAM RTKs)는 Tyro-3, xl 및 Mer로 구성 되 고 주로 면역 시스템 (8)의 골수성 세포에 의해 표현 된다. TAM RTKs의 주된 기능은 테 더 링 수용 체 역할을 하 여 사 멸 세포와 파편의 포식 제거를 촉진 하는 것입니다. 우리 그룹은 수 년 동안 자동 면역의 설정에서 TAM 매개 사 멸 세포 클리어런스를 연구 했습니다. 비타민 K-의존성 단백질 성장 체포 특이 단백질 6 (Gas6) 및 단백질 S (프로)는 탐 수용 체를 결합 및활성화 시킨다. Gas6는 심장, 신장 및 폐에서 생산 됩니다. 프로는 주로 간에 서 생산11. TAM은 Gas6/프로의 N-말단이 사 멸 세포에 PtdSer에 결합 하 고 Gas6/프로의 C-말단을 식 세포의 표면에 부착 된 탐 수용 체에 결합 하는 방식으로 사 멸 셀을 인식 한다. 다른 수용 체와 함께, 사 멸 세포의 침 몰은 발생12. Mer는 리간드 프로와 Gas6 모두에 결합할 수 있지만, 우리는 항-메 르 항 체 (13)에 의해 차단 될 수 있는 사 멸 세포에 대 한 mer 매개 식 세포의 포식에 대 한 유일한 리간드 인 것으로 Gas6 것으로 나타났습니다. 대 식 세포는 전문 포식 세포입니다. 식 세포에의 한 사 멸 세포의 급속 한 클리어런스는 세포내 항 원에 대 한 염증 및 자가 면역 반응의 억제에 중요 합니다. Mer 수용 체 티로신 키나 아 제는 대 식 세포 침 적 및 효율적인 사 멸 셀 (14)의 클리어런스에 중요 하다. 마우스 비장에서 Mer는 주로 한계 구역과 유형 신체 대 식 세포13에 대해 표현 합니다.
여기에 제시 된 프로토콜은 세포 사 멸을 유도 하 고 efferocytosis의 과정과 효율성을 측정 하는 방법을 입증 하는 기본적인 방법을 설명 합니다. 이 프로토콜은 다른 기원의 사 멸 세포의 침 몰에서 다른 세포 유형에 의해 efferocytosis를 연구 하기 위하여 쉽게 적응 될 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>Ack 용해 완충액</td><td>GIBCO</td><td>A10492</td><td></td></tr><tr><td>Annexin V/7-AAD</td><td>BD Pharmingen</td><td>559763</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Mer 항체</td><td>R& D Systems</td><td>BAF591</td><td></td></tr><tr><td>CD11b-PE (클론 M1/70)</td><td>BD Pharmingen</td><td>553311</td><td></td></tr><tr><td>CFSE</td><td>Invitrogen</td><td>C1157</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D-2650</td><td></td></tr><tr><td>EDTA (0.5 mM)</td><td>GIBCO</td><td>15575-020</td><td></td></tr><tr><td>FACS 튜브</td><td>BD Biosciences</td><td>352017</td><td></td></tr><tr><td>Frosted slides</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-552-343</td><td></td></tr><tr><td>호스 세럼 (열 비활성화)</td> <td>Invitrogen</td><td>26050088</td><td></td></tr><tr><td>Lidocaine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L-5647</td><td>1x PBS</td></tr><tr><td>PBS, 1x</td><td>Corning</td><td>21040CV</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640</td><td>Corning</td><td>10040CV</td><td></td></tr><tr><td>RXDX-106</td><td>Selleck Chemicals</td><td>CEP-40783</td><td></td></tr><tr><td>에 1% 완충액 준비Staurosprine (100mg)</td> <td>Fisher Scientific</td><td>BP2541-100</td><td>1mM 스타킹 용액을 만들기 위해 100mg에 214.3 ml의 DMSO를 첨가</td></tr>하십시오 <tr><td>Thioglycolate Medium Brewer Modified</td><td>BD Biosciences</td><td>243010</td><td>1&acute에서 3 % thioglycolate buffer를 준비하십시오. PBS, 오토클레이브 및 3개월 동안 어둠 속에서 보관하십시오.</td></tr></tbody></table>

대 식 세포에의 한 사 멸 티 모 세포 침 몰의 실험 분석

Experimental Analysis of Apoptotic Thymocyte Engulfment by Macrophages

세포 자 멸은 자연 스러운 과정으로 서 배아 발달, 항상성 조절, 면역 내성 유도 및 염증의 해결에 중요 한 역할을 한다. 바디에 있는 사 멸 파편의 축적은 시간이 지남에 따라 전신 자기 면역 질병으로 이끌어 내는 만성 선 동적인 반응을 시작할 수 있습니다. 손상 된 사 멸 세포 클리어런스는 다양 한 자가 면역 질환에 연루 되었습니다. 사 멸 클리어런스는 생리학적 조건에서 거의 검출 되지 않는 복잡 한 과정입니다. 그것은 풍부한 표면 수용 체 및 신호 분자를 포함 한다. 사 멸 세포 클리어런스 과정을 연구 하는 것은 통찰력 있는 분자 메커니즘과 후속 생물학적 반응을 제공 하 여 새로운 치료제의 발달로 이어질 수 있습니다. 여기에서 우리는 사 멸 티 모 세포의 유도를 위한 프로토콜, 복 막 대 식 세포의 준비, 유 세포 분석기 및 현미경 검사 법에의 한 사 멸 세포 클리어런스 분석을 설명 합니다. 모든 세포는 특정 단계에서 아 폽 토시 스를 겪을 것 이며, 많은 주거 및 순환 세포는 사 멸 파편을 흡수 할 수 있다. 따라서 여기에 설명 된 프로토콜은 많은 다른 세포 유형에 의해 사 멸 세포 결합 및 섭취를 특성화 하기 위해 여러 응용 프로그램에서 사용 될 수 있습니다.

복 막 대 식 세포의 분석-사 멸 티 세포의 매개 침 몰. 복 막 대 식 세포 및 사 멸는 상기 프로토콜에 기재 된 바와 같이 제조 하 고 공동 배양 하였다. 대 식 세포는 분리 되 고 얼음에 20 분 동안 PE 공액 항 CD11b 항 체로 염색 되었다. 대 식 세포는 이어서 유 세포 계에서 세척 및 처리 되었다. 본 바와 같이, 사 멸 세포가 배양 물에 첨가 되지 않았을 때 우측 하단 사분면에는 CFSE 양성 대 식 세포가 없다 (도 1A 와 도 2, 1 패널). 티 오 글 리코-자극 복 막 대 식 세포는 사 멸 세포를 삼 켜 가변 용량을 갖는다. 대 식 세포의 30%까지 CFSE 채널에서 긍정적인 것을 보여주었습니다,이 실험에서 CFSE-레이블이 붙은 사 멸 세포를 섭취 했음을 나타냅니다 (그림 1). CF...

여기서, 우리는 사 멸 티 모 세포와 복 막 대 식 세포를 준비 하 고 efferocytosis 및 특정 억제제의 효율성을 분석 하 사 멸 티 모 세포의 침 지에 관한 프로토콜을 제시 한다. 이 프로토콜은 인공 구슬과 박테리아를 포함 한 다른 입자의 세포 매개 클리어런스에 광범위 한 응용 프로그램을가지고 있습니다.

Cell apoptosis is a natural process and plays a critical role in embryonic development, homeostatic regulation, immune tolerance induction, and resolution ...

우리 몸은 매일 1~100억 개의 세포세포를 생성합니다. 이러한 세포의 효율적인 클리어런스는 세포 이물질을 제거하고 재고를 유지하는 데 도움이 됩니다. 이 방법은 많은 다른 식세포 유형에 의한 세포 결합 및 섭취를 특성화하기 위해 많은 응용 분야에서 사용될 수 있다.이 절차를 시연하는 것은 내 실험실의 수석 기술자 인 Yuxuan Zhen이 될 것입니다. 티모사이클을 수확하려면, 순진한 C57 블랙 6 마우스의 가슴 구멍을 연 후, 구겨진 미세 팁 집게를 사용하여 흉선을 뽑아냅니다. 기관기를 RPMI 1640 배지의 10 밀리리터를 포함하는 조직 배양 접시에 넣습니다.두 현미경 슬라이드의 서리가 내린 끝에 대한 전체 흉구를 갈기와 50 밀리리터 튜브로 70 마이크로 미터 세포 여과기를 통해 결과 조직 현탁액을 필터링합니다. 원심분리로 티모사이클을 수집하고 40 밀리리터로 펠릿을 재보종하십시오. 계산 후, 원심 분리하고 50 밀리리터 튜브 당 신선한 PBS의 20 밀리리터에서 8 세포에 최대 2 회 10 을 다시 일시 중단합니다.튜브 당 PBS의 20 밀리리터에 5 개의 마이크로 몰러 CFSE로 세포를 라벨. 튜브를 2~3번 반전한 후 빛으로부터 보호되는 실온에서 2분 이상 티모사이클을 배양합니다. 인큐베이션의 끝에서, 열 불활성화 말 혈청의 10 밀리리터와 반응을 중지하고 원심 분리에 의해 세포를 수집합니다.계산 및 원심 분리를 위해 40 밀리리터의 신선한 PBS에서 표지된 세포를 다시 중단하고 40 밀리리터의 중간 체정제를 추가로 세척합니다. 중간 세척 후, 티모세포를 조직 배양 배지 농도의 밀리리터당 6개 세포로 7배 10회 로 재보중단하고 세포를 100mm 조직 배양 접시에 종자한다. 그런 다음 1개의 마이크로몰라 최종 농도에서 세포 배양에 staurosporine를 추가하고 4시간 동안 조직 배양 배양인에 판을 놓습니다.복막 대식절 절연의 경우, 5일째복리토네움을 방해하지 않고 복부 피부를 열기 전에 0일 0시에 3%의 밀리리터 1밀리리터로 C57 블랙 6 마우스 를 주체적으로 주입한다. 복막 구멍을 플러시하려면 18 게이지 바늘이 장착된 10 밀리리터 주사기를 사용하여 10 밀리리터의 세척 버퍼를 캐비티에 빠르게 밀어 넣은 후 수집을 위한 세척 버퍼를 50 밀리리터 튜브로 천천히 흡입합니다. PBS로 두 번 간 간수 암싸이를 씻으시면 됩니다.회막 대식세포는 조직 배양 배지 농도의 밀리리터당 6개의 세포로 2회 10회에서 재연한다. 다음 씨앗 500 대식세포의 마이크로 리터 는 24 우물 플레이트의 각 우물에 2 시간 동안 조직 배양 인큐베이터에 접시를 배치합니다. 인큐베이션의 끝에서, 부동 세포를 제거하고 각 우물에 조직 배양 배지의 500 마이크로 리터를 추가하는 슈퍼 나티컬을 흡인.즉시 배양의 각 웰에 배지의 500 마이크로 리터에 6 개의 티모사이클에 0 ~ 12 회 10 을 추가하고 4 시간 동안 조직 배양 배양에 접시를 배치합니다. 인큐베이션이 끝나면 신선한 PBS로 각각 두 번 잘 씻고 무료 부유식 세포를 제거하고 염색 버퍼로 단일 세척을 합니다. 다음으로 플레이트 바운드 대식세포에 200 마이크로리터의 염색 버퍼를 잘 하여 적절한 안티 CD11b 항체로 보충하고 플레이트를 섭씨 4도에서 20분 동안 배치합니다.이 대표적인 실험에서, 최대 30%의 티오글리콜레이트가 자극된 복막 대식세포는 CFSE 채널에서 이러한 phagocytes가 CFSE 표지된 세포세포를 섭취했음을 나타내는 긍정적인 신호를 입증하였다. 세포 세포의 대식세포 침몰의 현미경 관찰은 CFSE 양성 대식세포가 개별 대식세포 내의 세포 수가 다르다는 것을 나타내는 다른 강도로 인해 오른쪽 하단사분면에 퍼지기 때문에 세포 세포가 세포 세포를 섭취하는 대식세포의 용량을 조사하는 데 필수적이다. 대식세포에 대한 세포 세포의 비율이 높을뿐만 아니라 세포 세포 섭취를 하는 대식세포의 수가 증가할 뿐만 아니라 대식세포가 더 많은 세포 세포를 섭취하는 능력을 향상시킵니다.실험의 또 다른 세트에서, 대식세포의 대략 15%는 CFSE가 세포세포가 phagocytic 대식세포이었다는 것을 나타내는 4 시간 동안 대식세포 배양에 추가될 때 CFSE 양성이 되었다. 메르 항체블록대식 세포세포는 투여의존적 방식으로, 전체적인 막힘은 현재 설정에서 약 30%의 효능 효율을 차지할 수 있다. 또한, 새로 승인된 TAM 수용체 억제제는 약 100 나노몰러 농도까지 투여 의존성 방식으로 대식세포증을 감쇠시한다.이 숫자는 직접 efferocytosis의 효율성에 영향을 미치기 때문에 항상 세포 세포의 백분율을 확인하는 것을 기억하십시오. phagocytic 대식세포는 침몰 과정에 의해 통제되는 신호 분자를 조사하고 삼키는 의 역학을 연구하기 위하여 현미경 검사법에 의해 서양 얼룩에 의해 추가 분석될 수 있습니다.

experimental-analysis-of-apoptotic-thymocyte-engulfment-by-macrophages

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

이 비디오에서는 컨포칼 현미경을 사용하여 세포사멸 세포의 청소를 연구하기 위한 efferocytosis assay를 시연합니다. efferocytosis는 apoptotic cell이 phagocyte에 의해 삼켜지고 efferosomes라고 하는 소포 내에서 분해되는 다단계 과정입니다. 이 프로토콜은 개별 세포사멸 세포의 내부화된 부분과 내부화되지 않은 부분을 시각화하고 efferocytosis를 정량화하는 방법을 제공합니다.

Fixed Cell Efferocytosis Assay: 형광 현미경을 사용하여 대식세포에 의한 세포사멸 세포의 발포성 흡수를 연구하는 방법

이 동영상은 형광 현미경으로 세포사멸 마우스 흉선세포의 복막 대식세포 매개 발포구를 분석하는 절차를 보여줍니다.

복막 대식세포(Peritoneal Macrophage)에 의한 Apoptotic Thymocytes의 Efferocytosis 분석

이 비디오는 사전 활성화된 이펙터 T 세포에 의해 유도된 암세포의 세포사멸 분석을 보여줍니다. 이러한 세포를 형광 핵으로 표시된 암세포와 함께 배양함으로써 카스파제로 절단할 수 있는 형광 기질을 추가합니다. 세포사멸 암세포는 핵에서 다른 색을 표시하여 이중 형광을 유발합니다. 이 이중 형광은 암세포가 세포사멸을 겪고 있음을 나타냅니다.

암세포에 대한 사전 활성화된 CD8+ T 세포의 세포 독성을 연구하기 위한 체외 분석

여기에서는 인접한 사멸 또는 죽어가는 세포와의 물리적 상호 작용에 의해 생존 가능한 세포에서 유도되는 세포 내 신호 전달 이벤트를 결정하기 위한 프로토콜을 제시합니다. 이 프로토콜은 죽은 세포의 식세포 흡수 또는 용해성 매개체의 방출과 대조적으로 죽은 세포의 수용체 매개 인식에 의해 유도되는 신호 전달 이벤트에 중점을 둡니다.

세포 내 이웃 셀을받은 사멸 세포 죽음과의 상호 작용에 의해 실행 가능한 세포에서 유도 된 이벤트를 시그널링의 식별

우리는 여기에 Drosophila 의 분산 배아 세포를 사용하여 식균 작용 분석을 설명합니다. 그것은 우리가 생체 내 식균 작용 수준을 쉽고 정확하게 정량화 할 수있게하며, 세포 사멸 세포의 식균 작용에 필요한 새로운 분자를 확인합니다.

에있는 Apoptotic 세포를위한 Phagocytosis 검정 Drosophila 태아

여기는 마우스 주민 복 막 대 식 세포에 의해 회전 디스크 confocal 현미경 이미지 단일 phagocytic 이벤트를 사용 하 여 방법에 설명 합니다. 프로토콜은 다른 phagocytic 세포를 확장할 수 있습니다.

마우스 대 식 세포에 의해 식 균 작용의 시간 경과 3D 영상

Efferocytosis, phagocytic 제거 apoptotic 세포의 항상성 유지 하는 데 필요한 하 고 수용 체와, engulfment, 인식과 apoptotic 세포의 국제화에 대 한 허용 하는 신호 통로 의해 촉진 된다. 여기, 우리는 efferocytosis의 정량화와 efferocytic 신호 통로의 활동에 대 한 형광 현미경 검사 법 프로토콜을 제시.

단일 세포 형광 현미경 검사 법에 의해 Efferocytosis의 정량화

여기의 미리 활성화 CD8 세포 독성을 조사 하는 프로토콜 설명 apoptotic 암 세포를 통해 실시간으로 현미경을 감지 하 여 암 세포에 대 한+ T 세포. 이 프로토콜 골수성 세포 유도 된 T 세포 억제 뒤에 메커니즘을 조사 하 고 면역 진압 골수성 세포의 봉쇄를 통해 T 세포를 보충 하기 위한 화합물을 평가할 수 있습니다.

실시간 탐지의 체 외 종양 세포 Apoptosis에 CD8에 의해 유도 된+ T 세포 종양 침투 골수성 세포의 면역 진압 기능 연구

신경 퇴행성 질환은 dysregulated 마이크로글리아 기능과 관련이 있습니다. 이 문서는 iPSC-대식세포에 의한 신경 모세포종 세포의 phagocytosis의 체외 분석방법을 설명합니다. 정량현미경 판독은 살아있는 세포 시간 경과 화상 진찰 과 고정 세포 고함량 화상 진찰을 위해 기술됩니다.

iPSC-대식세포에 의한 죽은 신경 모세포종 세포의 식증에 대한 체외 정량적 이미징 분석

이 프로토콜은 PMA 분화 THP-1 대식세포의 LPS 및 ATP 유도 사멸을 기반으로 합니다. 당사는 유세포 분석을 사용하여 Annexin V 및 7-AAD 이중 염색을 분석하여 세포 사멸을 검출하며, 전체 세포를 사용하고 주사 전자 현미경을 사용하여 세포막 형태를 관찰합니다.

PMA 분화 THP-1 대식세포의 LPS 및 ATP 유도 사멸 및 그 검증

학습하세요 대식세포에 의한 사멸 티모세포 침몰 실험 분석 방법을. C57BL/6 마우스에서 티모세포를 분리하고 CFSE 표지 후 스타우로스포린으로 사멸을 유도합니다. 티오글리콜레이트로 자극한 복강 대식세포를 분리하여 공배양하고, 효율적인 세포제거 작용과 억제제 효과를 평가합니다.

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