Name: 배양 된 성상 세포에서 미토콘드리아 시스템의 라이브 이미징 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-11-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 20 s
Description: 배우세요 성상 세포에서 MitoTimer 바이오센서를 활용한 미토콘드리아 라이브 이미징 방법입니다. 산화 스트레스 전후의 미토콘드리아 역학, 형태 및 적산화 상태 변화를 정량 분석하여 신경퇴행성 질환 메커니즘 연구에 활용할 수 있습니다.

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이 연구는 K.R. 및 로잔 대학 병원 (CHUV)에 수여 시냅시스 재단 펠로우십에 의해 지원되었다. 저자들은 니콘의 도움, 특히 J. Gannevat에게 감사를 표합니다.

본 의정서는 윤리위원회(계약 VD3602, 스위스 로잔)의 승인을 받아 수행되었으며 동물 사용에 대한 유럽의 지침을 따릅니다.
1. 쥐 해마 성상세포 1 차 문화
<ol><li>산후 1-2일에 참수하여 쥐 새끼 5마리(위스타 IGS 쥐)를 희생하십시오.</li>
	<li>뇌를 제거하고 신선한 성상 세포 매체의 5 mL를 포함하는 페트리 접시에 보관 (글루타맥스와 DMEM 1 % 페니실린 / 스트렙토 마이신과 10 % 신선한 말 세럼으로 보충).</li>
	<li>해마를 분리합니다. 21G 바늘을 통해 3개의 통로에 의해 성상세포 배지의 5mL에서 해리되고 25 G 바늘을 통해 3개의 통로를 통해 서식한다.</li>
	<li>해리된 세포를 15mL 원심분리기 튜브로 이송하고 혈전계에서 계산합니다.</li>
	<li>멀티웰 요리(9.4mm x 10.7mm x 9.3mm)에서 20,000-25,000 세포/cm2를 플레이트하고 나머지 실험에 대해 5%CO2를 함유하는 대기 하에서 37°C에 보관한다.</li>
	<li>시험관 내 3일(DIV3)에서 배지를 완전히 교체합니다.</li>
	<li>DIV8에서는 미토콘드리아 바이오 센서 미토타이머(LV-G1-MitoTimer22)를코딩하는 렌티바이러스 벡터 코딩의 세포당 p24 항원 0.6pg를 인산염 완충식식염(PBS + 0.01% BSA)으로 첨가한다.</li>
	<li>DIV9에서는 미리 따뜻해진 1x 멸균 PBS(37°C)로 세척하고 신선한 성상세포 배지를 추가합니다.</li>
	<li>DIV11에서는 미리 따뜻해지는 1x 멸균 PBS(37°C)로 2개의 세시를 수행하고 페놀 레드 없이 신선한 성상세포 배지를 추가합니다. 참고 : 코팅의 선택은 의도 된 분석에 따라 달라집니다. 성상세포 원발문화에 대한 표준 코팅으로서, 지하 멤브레인 매트릭스(예: Matrigel)의 0.2 mg/mL 폴리-D-리신 또는 8.7 μg/cm2를 사용하는 것이 좋습니다. 성상 세포의 미토콘드리아 시스템을 시각화하려면 평평하고 뻗은 세포에서 작업하는 것이 필수적입니다. 이러한 맥락에서, IBIDI u 슬라이드의 지하 막 매트릭스의 조합이 가장 적합하다. 또한 빛에 반복적으로 노출되는 세포에 독성이 있는 페놀 레드로 작업하지 않는 것이 중요합니다.</li>
</ol>2. 미토콘드리아 시스템의 장기 모니터링.
<ol><li>LV-G1-미토타이머를 가진 렌즈바이러스 감염 후 최소 3-5일 간 성상체 미토콘드리아 시스템을 평가한다(미토콘드리아에서 충분한 수준의 형광을 허용).</li>
	<li>획득 및 분석 소프트웨어및 획득의 완전한 자동화를 위한 모듈에 의해 제어되는 반전된 현미경으로 세포를 이미지화합니다. 참고: 이 스터디에 사용된 소프트웨어 및 모듈의 세부 사항에 대한 재료 표를 참조하십시오.</li>
	<li>현미경이 실험 전반에 걸쳐 5% CO2 및 37°C에서 성상세포 배양을 유지하기 위해 케이지 인큐베이터(재료 표참조)가 장착되어 있는지 확인합니다.</li>
	<li>490nm(녹색 채널용)와 550nm(빨간색 채널용)에서 순차적인 발산을 사용하여 형광 이미지를 캡처하여 그린(녹색 채널용 500-540 nm)과 빨간색(빨간색 채널의 경우 550-600 nm) 형광 신호를 감지합니다.</li>
	<li>40배배율을 사용하여 충분한 수준의 LV-G1-MitoTimer를 표현하는 미토콘드리아 네트워크로 잘 성상세포 5개씩 선택하십시오. 가능한 한 평평하고 크고 세포 클러스터에 위치하지 않는 성상 세포를 선택하십시오 (개별 세포에서 작업).</li>
	<li>XLM 파일(map.xlm)에 선택한 5개의 셀의 좌표를 저장합니다. 이 map.xlm을 사용하면 시간이 지남에 따라 동일한 셀로 돌아갈 수 있습니다.</li>
	<li>각 좌표에 대해 150배(100배 오일 침지 목표, 1.5배 중간 배율)를 사용하여 이미지 시퀀스(60s용 1화상/s)를 획득한다.</li>
	<li>동일한 성상 세포에 대해 이미지 수집(60s의 이미지/1)을 반복하여 치료 후 6h, 12h 및 24h를 반복합니다. 참고: 빠르고 효율적인 자동 초점 시스템이 장착된 현미경을 사용합니다. 이러한 맥락에서 PFS(완벽한 포커스 시스템)라는 하드웨어 솔루션이 사용되었습니다. PFS는 근적외선 870-nm LED 및 CCD 라인 센서를 사용하여 장기 이미징 조사 중 실시간으로 축 초점 변동에 대처합니다.</li>
</ol>3. 개별 미토콘드리아 형태 및 LV-G1-미토타임기 비율 의 분석
참고: 니콘의 NIS 일반 분석 3(GA3)은 이 연구에서 형태 분석 자동화에 사용되었습니다.
<ol><li>각 이미지 시퀀스(기준선, 6h, 12h, 24h)에 대해 ND 프로세싱 > 선택 프레임을클릭하여 빨간색 및 녹색 채널의 첫 번째 프레임을 선택합니다.</li>
	<li>병합 채널을 > 변환을 선택하여 빨간색 및 녹색 채널을 병합합니다.</li>
	<li>이미지 그늘을 수정하려면 자동 염색 보정 > 전처리를 선택합니다.</li>
	<li>롤링 볼> 전처리를 선택하여 롤링 볼 알고리즘을 적용합니다.</li>
	<li>각 미토콘드리온에 대해 이진 마스크를 생성하려면 세분화 > 임계값을 선택합니다.</li>
	<li>터치 테두리에 > 바이너리 처리를 선택하여 테두리에 의해 잘린 객체를 제거합니다.</li>
	<li>표면적을 측정하려면 오브젝트 영역> 측정을 선택합니다.</li>
	<li>직경을 측정하려면 측정 > Eq 직경을 선택합니다.</li>
	<li>길이를 측정하려면 측정 > 길이를선택합니다.</li>
	<li>너비를 측정하려면 너비 > 측정을선택합니다.</li>
	<li>거칠기를 측정하려면 측정 > 거칠기를 선택합니다.</li>
	<li>순환성을 측정하려면 순환을 > 측정을 선택합니다.</li>
	<li>신장을 측정하려면 연고 > 측정을 선택합니다.</li>
	<li>위의 측정으로 그룹(마우스 오른쪽 단추)을 구성하고 MorphoData로 이름을 바꿉니다.</li>
	<li>측정은 평균 강도를 > 측정을선택하여 녹색 강도를 의미합니다.</li>
	<li>측정은 평균 강도 > 측정을선택하여 적색 강도를 의미합니다.</li>
	<li>적색/녹색 비율을 측정하려면 측정 > 비율을 선택합니다.</li>
	<li>위의 측정으로 그룹(마우스 오른쪽 단추)을 구성하고 비율로 이름을 바꿉니다.</li>
	<li>참조 > 테이블을 CSV로 선택하여 테이블을 CSV 파일로 내보냅니다.</li>
	<li>저장을 선택하여 GA3 분석 스크립트 저장 참고: 이 절차에 사용된 조건의 완전하지 않은 목록은 그림 1, 표 1및 표 2로요약됩니다. 분석 GA3 스크립트 파일은보충(추가 코딩 파일 1 및 그림 2)에서사용할 수 있습니다. 사용된 임계값은 가능한 한 많은 미토콘드리아를 개별화하도록 조정되었습니다 (가능한 경우 큰 미토콘드리아 네트워크를 제외). 가능한 경우 미토콘드리아 네트워크는 수동으로 개별화되거나 분석에서 제외됩니다. 세포 간 가변성으로 인해 조건당 최소 20-25 세포 (세포별 최소 50 개의 미토콘드리아)에 이러한 분석을 수행하십시오.</li>
</ol>4. 미토콘드리아 운동성 분석
참고: 미토콘드리아 운동의 복잡성이 높기 때문에 수동 운동성 분석이 바람직합니다. 여기서 니콘의 NIS 엘리먼트 시스템은 미토콘드리아를 수동으로 추적하는 데 사용되었습니다.
<ol><li>NIS에서 추적 모듈을 열고 > 분석 > 추적보기를선택합니다.</li>
	<li>새 ROI 정의를클릭합니다.</li>
	<li>자동 검출 도구를사용하여 이미지 시퀀스의 첫 번째 이미지에서 25-50 미토콘드리아를 선택합니다.</li>
	<li>자동 감지 된 ROIs 분석 추적을클릭합니다.</li>
	<li>필요한 경우 잘못된 ROI 트랙을 삭제합니다.</li>
	<li>테이블을 CSV 파일로 내보냅니다. 참고: 이 절차에 사용된 조건의 완전하지 않은 목록은 그림 1과 표 3로요약됩니다. 추적 해석은 일반적으로 추적된 모든 개체의 중심의 움직임을 묘사하는 경로를 제공합니다. 추적 옵션에 따라 다른 추적 옵션을 설정해야 합니다. 추적을 용이하게하기 위해 서로 충분히 멀리 떨어져있는 고립 된 미토콘드리아의 선택을 선호합니다. 전체 시퀀스에 대해 일관되게 추적할 수 있는 개체만 유지합니다. 품질 추적 불량으로 인해 이상값을 제거하는 동일한 방법을 진행합니다. 따라서 이 섹션에서 분석된 개체 집합은 정적 형태 분석에 대해 분석된 개체 집합과 다르며 일반적으로 더 작습니다.</li>
</ol>5. 데이터 변환, 정규화 및 통계 분석
참고: 주로 미토콘드리아의 이질성이 높기 때문에 생성된 데이터는 종종 비정상 분포를 가지게 됩니다.
<ol><li>수동으로 로그 변환 처리 하기 전에 측정.</li>
	<li>각 분석 및 시간 프레임에 대해 참조 획득에서 얻은 데이터를 평균으로 수동으로 정규화합니다.</li>
	<li>또한, 대조군 조건에 대한 제2/이중 정규화를 고려하여, 예를 들어, 치료의 효과를 평가한다.</li>
	<li>그런 다음 양방향 일치 ANOVA를 사용하여 통계 분석을 수행합니다. 여기에 그래프 패드 프리즘 V8이 사용되었다.</li>
</ol>

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</ol>

저자는 경쟁 이익을 선언하지 않습니다.

여기서, 배양된 성상세포에서 미토콘드리아 시스템의 역학 및 회전율을 세로적으로 따르는 새로운 방법이 제안된다. 한 번에 정해진 세포 또는 하나의 개별 세포(문헌에서 가장 자주 사용되는)24,25에대한 시간 경과접근법과는달리, 연구자들은 동일한 개별 세포에서 며칠 동안 미토콘드리아 시스템의 진화를 따를 수 있다. 높은 수준의 광 노출이 요구되고 많은 개별 세포의 선택이 덜 실현 가능한 단일 웰 라이브 이미징과는 달리, 제안된 방법은 이 현미경의 능력을 활용하여 우물의 다른 영역에서 여러 가지 세포를 이미지화하고 다양한 시간에 동일한 세포로 돌아와 다시 이미지화합니다. 관심있는 각 세포에 대해 측정 된 각 기준에 대해 수행 된 기준선으로 의 정상화 덕분에 미토콘드리아 시스템의 복잡성을 고려하고 자체 기준선 이미지에 비해 각 세포에 대한 치료 효과를 조사합니다. 한 번에 최대 16개의 우물에서 이러한 유형의 이미징을 자율적으로 수행하는 현미경의 능력은 미토콘드리아 시스템의 이질성을 다른 날에 이미징과 함께 제공되는 실험 적 가변성 없이 분석 중에 적절히 고려할 수 있게 합니다.
배양의 질, LV-G1-MitoTimer 바이오 센서를 표현하는 바이러스 감염의 수준, 현미경 및 목표의 종류 및 적합한 세포의 선택은 이 프로토콜에서 가능한 한 일관되게 유지되어야 하는 중요한 변수입니다. 세포 밀도, 벡터 의 유형 및 바이러스 성 타이터는 질문에 따라 적응 될 수 있습니다. 이전 연구는 LV-G1-미토타임발이 미토콘드리아기능 및역학(21,22,26,27)에해로운 결과를 초래하지 않는다는 것을 나타내지만, 농도가 세포에 대해 독성이 없음을 확인하는 것이 필수적이다(예를 들어, 제어되는 세포의 총 수를 잘 확인). 단일 초점 평면이 사용되는 바와 같이, 성상 세포는 가능한 한 평평하게, (2) 다른 라벨이 붙은 세포로부터 분리되어야 한다(접시에 있는 변위시 분석을 단순화하기 위해), (3) 높은 형광 수준을 갖는다. 배양에 있는 세포가 형태학에서 높게 가변할 수 있기 때문에, 미토콘드리아 시스템은 높게 이질적일 수 있습니다. 이러한 맥락에서, ROI를 분석(전체 셀이 아님)은 페리핵 지역과 같은 일부 문제가 되는 지역을 보상하고 변동성을 감소시다. 비교적 유사한 세포에 기준선을 하고 가능한 한 많은 세포를 샘플링하는 것이 필수적입니다. 따라서 높은 콘텐츠 획득 및 분석 현미경이 이상적입니다. 이 세로 모니터링 하는 동안, 바이오 센서 표백을 피하기 위해 빛에 세포를 과열 하지 않는 것이 중요 하다.
이 이미징 방법은 복잡성이 없는 것이 아니며 프로토콜 전반에 걸쳐 현미경으로 이전 테스트 중에 수행된 문제 해결을 고려하는 여러 메모가 포함되어 있습니다. 예를 들어, 사용되는 플레이트 코팅의 선택은 의도된 분석서에 따라 다르지만, 성상세포 1차 배양에 가장 적합한 선택에 대한 권장 사항이 포함되어 있다. 또한, 세포간 가변성으로 인해 조건당 최소 5개의 세포에서 이미지 수집을 수행해야 합니다. 보다 구체적으로, 베이스라인 이미징에서 선택된 일부 세포는 죽고, 일부는 할당된 이미지 획득 영역의 프레임밖으로 이동하고, 일부는 그들의 형태를 변화시켜 미토콘드리아가 분석에서 개별화하기가 매우 어려워집니다. 처음부터 많은 세포를 이미징하여 실험이 끝날 때 분석하기에 충분한 양의 세포 크기가 증가할 가능성을 높입니다. 이 화상 진찰 기술의 더 복잡한 양상 이외에, 화상 진찰 및 분석의 이 모형에서 유익할 수 있는 한 몇몇 명백한 한계가 있습니다. 이미지 수집의 자동화를 최대한 활용하기 위해 사용되는 현미경은 이미지(즉, 이 프로토콜의 3초마다)사이의 시간 간격 속도를 처리할 수 있는 자동 초점 시스템을 가져야 하며 각 이미지를 촬영하기 전에 문제의 셀에 일관되게 집중할 수 있습니다. 또한 전체 이미지 수집 프로세스를 자동화하는 JOBS 소프트웨어가 없으면 이 방법은 적절한 시점에서 각 셀을 수동으로 찾고 이미징해야 하므로 이미지되는 셀 수에 따라 힘들고 잠재적으로 불가능해집니다. 마지막으로, 이 이미징 방법은 광표백 문제에 면역이 되지 않습니다. 이러한 이유로, 어떤 장기 취득 방법과 마찬가지로, 광표백에 덜 취약한 형광 마커를 선택하고 가능한 한이 문제를 피하기 위해 이미지 수집을 조정하는 것이 중요합니다.
이 기술은 현재 중요한 방법으로 사용되는 다른 사람과 다릅니다. 다른 시간 경과 연구와는 달리,이 기술은 전체 시간에 동일한 위치에 이미징을 필요로하지 않으며, 다른 영역을 이미지플레이트의 수동 이동을 필요로하지 않습니다. 이것은 연구원이 1개의 24 시간 기간에 있는 많은 조건에서 많은 세포를 심상하는 기능을 허용합니다. 따라서, 각 우물의 많은 세포에 대한 이 이미징 및 분석을 수행하는 능력은 이미지된 각 세포로부터 특정 측정을 추가로 제공하면서 큰 세포 그룹을 광범위하게 연구하여 얻을 수 있는 동일한 인구 정보를 제공합니다. 이 방법에 대한 몇 가지 구체적인 내용은 다른 이미지 수집 방법(위에 설명된 참조)에 적용되지 않을 수 있지만, 이점은 획득 후 가능한 분석 유형의 합병증보다 큽니다. 이 기술은 연구원이 미토콘드리아 시스템에 각종 처리의 정확한 파급효과를 볼 수 있고, 결과적으로, 배양한 성상세포에 있습니다.
추가적으로, 이 방법은 특정 맥락에서 미토콘드리아 행동 및 역할에 관하여 많은 다른 과학적 질문에 높게 사용자 정의할 수 있습니다. 여기에 설명 된 프로토콜은 배양 성상 세포와 구체적으로 다룹니다. 그러나, 많은 그밖 세포 모형을 이용될 수 있고, 시험될 수 있는 처리는 조사되는 질문에 의해서만 제한됩니다. 화상 진찰의 이 모형은 미토콘드리아 행동의 집단적인 지식과 이해를 발전시킬 가능성이 있습니다, 미토콘드리아 기능 장애로 이끌어 내는 근본적인 기계장치, 및 세포의 다른 모형에 존재하는 타고난 역학에 많은 병학의 효력.

성상 세포는 뇌 항상성의 유지 보수에 중요한 선수입니다. 그들은 아마도 가장 잘 뇌에 중요 한 구조적 역할을 가지고 알려져 있다, 혈액-뇌 장벽의 일환으로1 그리고 뇌 에 걸쳐 뉴런과 시 냅 스를 지원 하 여2. 뉴런의 성상세포 지원은 구조적3및 대사4,5,성상세포가 신경 발생및 시냅토 발생을 촉진하는 동시에 활성 뉴런4,6,7에젖산염과 같은 주요 대사산물을 제공한다. 구조적 지원의 역할을 넘어, 성상세포는 Ca2+ 신호 및 버퍼링(자발적인 미토콘드리아 Ca2+ 유입 포함)8,9,K+ 버퍼링10에참여하는 활성 세포이며, 부상11, 12의시간에 뇌의 요구에 적응하고 반응할 수있습니다. . 이러한 동적 세포이기 때문에 성상 세포는 효율적인 미토콘드리아 네트워크가 필요한 강력한 에너지 요구 사항을 가지고 있습니다. 이러한 미토콘드리아는 또한 과도한 반응성 산소 종(ROS)13을완충하는 데 중요한 역할을 한다. 미토콘드리아는 에너지 생성 및 ROS 버퍼링의 개인 또는 로컬 역할 외에도네트워크(14)로기능한다. 이러한 의미에서, 그들은 각각15의새로운/감소된 미토콘드리아 및 더 오래/산화된 미토콘드리아를 나타내는 핵분열과 융합 미토콘드리아 사이의 평형을 유지한다. 세포의 전반적인 레독스 상태는 미토콘드리아 네트워크의 레독스 상태에 의해 측정될 수 있다. 병리학에서, 이것은 어떤 세포가 최적으로 작동하지 않을 수 있는지에 빛을 비출 수 있는 중요한 정보 입니다.
최근 몇 년 동안, 많은 센서는 세포에서 미토콘드리아의 역학과 기능을 연구하기 위해 개발되었습니다. 예를 들어, 에너지 교환(ATP), 레독스 상태(NADH/NAD+,ROS) 및 효소 기능(cAMP, Ca2+,Zn2+)을측정하는 센서는 현재 미토콘드리아기능(16)의연구에 사용되고 있다. 그 중에서도 미토타임러는 미토콘드리아 형태(크기, 모양, 표면적), 이동성(속도, 변위), 역학(융합 및 분열 이벤트) 및 전체 미토콘드리아 이직률 및 레독스 상태의 변화를 따를 수 있도록 허용합니다. 미토타이머는 돌연변이 적색 형광 단백질, drFP58317,인간 시토크롬 c 산화제18의아단위 VIII로부터 미토콘드리아 신호를 가지고있으며,19는 새로 합성된 미토콘드리아를 녹색(488 nm)과 산화미토콘드리아(555nm)로 시각화한다. 그린(488nm)과 적색(555nm) 형광비를 사용하면 개별 미토콘드리아, 형태 분석, 융합/핵분열 이벤트 및 레독스 상태 기록20,21의동시 평가를 허용한다. 이 독특한 속성미토콘드리아의 생리적 및 병리학 적 역할에 관한 많은 과학적 질문을 조사하는 데 사용할 수 있으며, 따라서 많은 다른 세포 유형 내에서 미토콘드리아 역학의 기본 메커니즘을 공개하기위한 매우 유망하다.
최근에는 시험관 내 성상세포와 생체내22에서미토콘드리아의 다이나믹하고 기능을 연구하기 위해 새로운 렌즈티바이러스 벡터(LV-G1-MitoTimer-MiR124T)를 개발했다. LV-G1-MitoTimer는 이전에 설명된 miR124T 뉴런 탈타겟팅시스템(23)과결합된 B3 증강제(gfaABC1D(gfaABC1D(GfaABC1D(B3)를 통해 신경교 피성 산성 단백질(GFAP) 프로모터 gfaABC1D의 잘린 버전을 사용한다. 시험관 내 및 생체 내 성상세포에서 미토콘드리아 바이오 센서를 단독으로 발현할 수 있다. 여기에 쥐 해마 성상세포의 문화를 수행하고 LV-G1-MitoTimer 바이오 센서를 장착하는 다른 단계뿐만 아니라 몇 시간 / 일 동안 성상 세포 미토콘드리아의 행동을 따르는 다른 현미경 단계입니다.

<table><tbody><tr><td>&micro; 슬라이드 8 웰</td><td>IBIDI</td><td>80807</td><td></td></tr><tr><td>19G 바늘</td><td>플렉서 SANTE</td><td>PL001213</td><td></td></tr><tr><td>21G 바늘</td><td>플렉서스 SANTE</td><td>PL000142</td><td></td></tr><tr><td>25G 바늘</td><td>플렉서스 SANTE</td><td>PL000133</td><td></td></tr><tr><td>보빈 세럼 알부민</td><td>LIFE TECH</td><td>15260037</td><td></td></tr><tr><td>카메라</td><td>HAMAMATSU</td><td>ORCA-flash4.0 V3 - C13440-20CU</td><td></td></tr><tr><td>DMEM, 고포도당, GlutaMAX(TM)</td><td>THERMOFISHER</td><td>61965059</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax 보충제</td><td>THERMOFISHER</td><td>35050061</td><td></td></tr><tr><td>호스 세럼</td><td>SIGMA</td><td>16050122</td><td></td></tr><tr><td>렌즈</td><td>니콘 인스트루먼트</td><td>CFI 플랜 플루어 100x 오일</td><td></td></tr><tr><td>라이트 엔진</td><td>LUMENCOR</td><td>SPECTRA X</td><td></td></tr><tr><td>선형 인코딩 된 전동 플라틴</td><td>Nikon Instruments</td><td>N / A</td><td></td></tr><tr><td>현미경</td><td>Nikon Instruments</td><td>ECLIPSE Ti2-E 현미경 3</td> 채널 수동 가스 혼합기 및 가스 버블 / 습도 모듈이있는 역 <td></td></tr><tr><td>현미경 스테이지 인큐베이터</td><td>OKOLAB</td><td>H201-NIKON-TI-S-ER</td><td></td></tr><tr><td>PBS 1x</td><td>액체 THERMOFISHER</td><td>20012068</td><td></td></tr><tr><td>페니실린-스트렙토 마이신</td><td>SIGMA</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>페트리 접시 100mm</td><td>SIGMA</td><td>P5731</td><td></td></tr><tr><td>페트리 접시 35mm</td><td>SIGMA</td><td>CLS430165</td><td></td></tr><tr><td>임산부 쥐</td><td>CHARLES RIVERS</td><td>3</td><td></td></tr><tr><td>소프트웨어 Nikon NIS-HC</td><td>Nikon Instruments</td><td>NIS-Elements HC</td><td></td></tr><tr><td>Sofware Prism</td><td>GraphPad</td><td>V8.02</td><td></td></tr><tr><td>Stericup 500mL</td><td>MERCK 밀리포어</td><td>10412701</td><td></td></tr></tbody></table>

배양 된 성상 세포에서 미토콘드리아 시스템의 라이브 이미징

Live-imaging of Mitochondrial System in Cultured Astrocytes

신경 수준에서 미토콘드리아 변경에 많은 주의를 기울였지만, 최근의 증거는 성상세포에서 미토콘드리아 역학및 기능이 인식에 연루되어 있음을 보여줍니다. 이 문서는 미토콘드리아 바이오 센서가 장착된 성상세포 배양의 시간 경과 이미징 방법인 미토타임에 대해 설명합니다. MitoTimer는 미토콘드리아 역학, 이동성, 형태학, 생물 발생 및 redox 상태를 평가하는 강력하고 독특한 도구입니다. 여기서, 문화, 이미지 수집 및 후속 미토콘드리아 분석을 위한 상이한 절차가 제시된다.

LV-G1-미토타이머에 감염된 성상세포의 1차 배양은 전형적인 미토콘드리아 네트워크를 나타냈다. 치료 전에, LV-G1-미토타이머를 발현하는 성상세포는 이질적인 미토콘드리아 크기와 다양한 녹색/적색 형광 강도를보였다(도 3, 도 4,및 비디오 1). LV-G1-미토타이머를 발현하는 성상세포 배양의 미토콘드리아 시스템은H2 02(10μM)로 인큐베이션 전후를 모니터링하였다. 상술한 상이한 미토콘드리아 특징은 12h(매 3시간마다) 이상 계산되고 정규화(cell by cell)를 초기 상태로 계산하였다. 형태학적수준(도 3B)에서H2 O2의효과는 약 6h에서 보이기 시작한다. 실제로, 미토콘드리아는 단편화되었다 (길이의 감소, 표면적, 신장 인자). 이 단편화는 치료 후 12 h더욱 분명합니다. 직경, 너비 및 구형은 감소되지 않았습니다. 레독스 상태 및 회전율(도3C),H2 O2치료 후 3시간 후, 성상세포에서 녹색 미토콘드리아의 비율이 증가하였다(미토콘드리아 생물발생의 급격한 증가의 결과). 6h에서 녹색/빨간색 비율은 기준선 수준으로 돌아왔지만 순수하게 적색 미토콘드리아의 수는 기저 수준에서 크게 증가했습니다. 12h 후,H2 O2의산화 치료의 결과가 보였고 적색 말크타의 비율과 수의 상당한 증가를 초래하였다. 역학 및이동성(도 3D)에관하여, 3 시간 치료 후, 모든 기준은 일시적으로 증가되었다. 장기 (12 h)에서 미토콘드리아는 더 느리게 더 짧은 거리를 이동했습니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62957/62957fig01.jpg"> 그림 1: LV-G1-미토타이머 바이오센서를 발현하는 성상세포 배양. (A)LV-G1-미토타이머를 발현하는 성상세포의 공초점 사진. (B)상이한 수준의 단편화를 가진 감소(녹색) 균형(주황색) 및 산화(red) 미토콘드리아의 공초점 사진 선택. (C)LV-G1-미토타이머를 발현하는 성상세포에서 분석에 사용할 수 있는 상이한 기준의 요약 다이어그램. 스케일 바:(A)상부 패널: 50 μm, 하부 패널: 10 μm,(B)1 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62957/62957fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62957/62957fig02.jpg"> 그림 2: 미토콘드리아 형태 및 비율 분석. (A)개별 미토콘드리아 형태 및 비율의 분석을 위한 GA3 스크립트 개요. (B)GA3 스크립트로 분석된 LV-G1-미토타이머를 표현하는 성상세포의 초기 사진. (C)성상세포의 미토콘드리아 시스템을 위해 생성된 이진 마스크의 예. 스케일 바: 10 μm(B-C). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62957/62957fig02large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62957/62957fig03.jpg"> 그림 3: H2O2의 효과는 성상 세포의 미토콘드리아 시스템에 미치는 영향. (A)LV-G1-미토타이머 1시간 전과 6시간, 24h를 PBS(CTRL)로 발현하고H2 O2의10 μM을 발현하는 성상세포의 사진. (B)미토콘드리아 형태,(C)레독스 상태 및 회전율의 레이더 차트,(D)H2O2 치료 후 기준선 및 3h, 6h, 및 12 h 동안 성상세포에 평가된 이동성 기준. SA: 표면적; D: 직경; L: 길이; W: 너비; R: 원등도; S: 구형성; EF: 신장 계수(=L/W); G/R: 개별 적색/녹색 비율; Gpuncta: 녹색 말크 타 미토콘드리아의 백분율; 어근: 붉은 말장난 미토콘드리아의 백분율; 변위: 변위; Tr: 트랙 길이; Sp 및 SpV: 속도와 속도 분산; Str: 직선성. 스케일 바: 20 μm(A) 및 2.5 μm(인셋). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62957/62957fig03large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62957/62957fig04.jpg"> 그림 4: LV-G1-미토타이머를 발현하고 기준선 동안 균질적이고 균형 잡힌 미토콘드리아 네트워크를 나타내는 성상세포의 사진. 스케일 바: 20 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62957/62957fig04large.jpg" target="_blank">μm이 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
비디오 1: H2O2 치료가 배양된 성상세포의 미토콘드리아 시스템에 미치는 영향. H2 O2치료(baseline) 전 성상체 미토콘드리아뿐만 아니라 H2O2 치료 후 6시간 및 24시간 동안 비처리 대조군 세포에 비해 처리되지 않습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62957/movie.mp4" target="_blank">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>형태학 기준</td>
			<td>레인지</td>
			<td colspan="3">발언</td>
		</tr>
<tr>
<td>표면적(SA)</td>
			<td>0.5-4 μm2
</td>
			<td colspan="3" rowspan="7">이러한 기준은 미토콘드리아의 단편화된 길쭉한 특징을 알립니다. 그들은 일반적으로 같은 방향으로 진화. 단편화된 미토콘드리아는 표면적, 직경, 길이 및 신장 계수가 감소하는 반면, 둥글림, 구형 및 폭은 변하지 않거나 증가할 수 있다.</td>
		</tr>
<tr>
<td>직경(D)</td>
			<td>0.5-1.5 μm</td>
		</tr>
<tr>
<td>길이(L)</td>
			<td>0.5-5 μm</td>
		</tr>
<tr>
<td>너비(W)</td>
			<td>0.5-2 μm</td>
		</tr>
<tr>
<td>원등도 (R)</td>
			<td>0–1</td>
		</tr>
<tr>
<td>구형 (S)</td>
			<td>0–1</td>
		</tr>
<tr>
<td>신장 계수(EF = L/W)</td>
			<td>1–10</td>
		</tr>
</tbody></table>표 1: 미토콘드리아 형태에 대한 선택된 매개변수의 요약입니다.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>레독스 주 기준</td>
			<td>레인지</td>
			<td colspan="3">발언</td>
		</tr>
<tr>
<td>개별 비율(G/R)</td>
			<td>0–10</td>
			<td colspan="3" rowspan="3">비율은 레독스 상태의 결과를 나타냅니다. 그것은 세포에 있는 미토콘드리아의 일반적인 상태 그리고 나이에 관하여 알려줍니다. 이 비율은 미토콘드리아의 생물 발생 및 분해의 균형과 감소 된 미토콘드리아와 산화 미토콘드리아의 핵/ 융합이라는 것을 고려하는 것이 필수적입니다. 따라서 녹색 및 빨간색 말장난의 수의 평가는 강력하게 결과를 해석하는 데 도움이 될 수 있습니다.  녹색 말장난 미토콘드리아는 녹색의 강도가 빨간색의 10 배 때 결정됩니다. 붉은 말장난 미토콘드리아는 빨간색의 강도가 녹색의 강도보다 10 배 더 클 때 결정됩니다. 성상 세포의 레독스 상태는 그 세포의 모든 미토콘드리아 비율의 평균입니다.</td>
		</tr>
<tr>
<td>녹색 말장난 미토콘드리아의 비율 (Gpuncta)</td>
			<td>0%–100%</td>
		</tr>
<tr>
<td>붉은 말장난 미토콘드리아의 백분율 (Rpuncta)</td>
			<td>0%–100%</td>
		</tr>
</tbody></table>표 2: 미토콘드리아 레독스 상태에 대한 선택된 매개변수의 요약.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>이동성 기준</td>
			<td>레인지</td>
			<td colspan="3">발언</td>
		</tr>
<tr>
<td>변위(변위)</td>
			<td>0-10 μm</td>
			<td colspan="3" rowspan="5">이러한 기능은 함께 네트워크의 일반적인 운동성 역학을 알려줍니다. 고정 미토콘드리아는 짧은 변위와 낮은 속도로 트랙 길이를 표시합니다. 한편, 진동 입자는 트랙 길이와 변위(직선성이 낮음)와 정적에 비해 증가된 속도 사이의 차이로 분화될 수 있다.</td>
		</tr>
<tr>
<td>트랙 길이(Tr)</td>
			<td>0-10 μm</td>
		</tr>
<tr>
<td>속도 및 속도 분산(Sp 및 SpV)</td>
			<td>0-1.5 μm/s ± 0.2 μm/s</td>
		</tr>
<tr>
<td>직진도</td>
			<td rowspan="2">0–1</td>
		</tr>
<tr>
<td>(Str = 변위/트랙 길이)</td>
		</tr>
</tbody></table>표 3: 미토콘드리아 이동성을 위한 선택한 매개변수의 요약.
보충 코딩 파일 1: 개별 미토콘드리아 형태 분석을 위한 GA3 스크립트 파일. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62957/Mito_Morpho.ga3" target="_blank">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>

이 문서에서는 미토타임제 생체 센서가 장착된 성상세포 배양의 미토콘드리아 타임랩스 이미징 방법과 미토콘드리아 역학, 이동성, 형태, 생물 발생, 레독스 상태 및 회전율의 결과다발성 분석을 설명합니다.

While much attention has been given to mitochondrial alterations at the neuronal level, recent evidence demonstrates that mitochondrial dynamics and ...

이 프로토콜은 긴 획득 기간 동안 개별 세포 내의 미토콘드리아 역학을 추적하는 방법으로 현미경 검사법의 힘을 크게 극대화합니다. 고정된 세포 그룹 또는 한 번에 하나의 셀에 시간 경과와는 달리, 세포 간의 이질성에 대한 각 세포 대조군의 각 측정 기준에 대한 기준선으로 정규화한다. 자동화 된 플랫폼과 적응 된 바이러스 벡터가 장착 된 현미경으로 모든 유형의 세포에 이 프로토콜을 사용할 수 있습니다.멀티 웰 요리에 평방 센티미터 당 20, 000 ~ 25, 000 세포를 도금하여 시작하여 실험의 나머지 부분에 대한 5 %의 이산화탄소를 포함하는 대기 하에서 섭씨 37도에 저장합니다. 시험관 내 8일 동안, 인산염 완충식식염에 희석된 미토콘드리아 바이오 센서 미토타임에 대한 렌티바이러스 벡터 코딩의 세포당 P24 항원 0.6 피코 그램을 첨가한다. 11일 체외에서 미리 데워진 멸균 PBS로 두 개의 세시를 수행하고 페놀 레드 없이 신선한 성상세포 배지를 추가합니다.LV-G1 미토타이머를 가진 렌즈바이러스 감염 후에 적어도 3 5 일 점성세포 미토콘드리아 시스템을 평가합니다. 40배의 배율을 사용하여 충분한 수준의 LV-G1 미토타임을 표현하는 미토콘드리아 네트워크로 잘 5개의 성상세포를 선택하십시오. 가능한 한 평평하고 큰 성상 세포를 선택하고 셀 의 클러스터에 위치하지 않도록주의하십시오.그런 다음 녹색 채널490 나노미터에서 순차적 흥분을 이용한 형광 영상을 캡처하고 녹색 및 빨간색 형광 신호가 있는 빨간색 채널에 대해 550 나노미터를 사용하고 각 좌표에 대해 150배배배배배를 사용한다. ND 프로세싱을 클릭하여 각 이미지 시퀀스에 대한 빨간색 및 녹색 채널의 첫 번째 프레임을 선택하고 프레임을 선택합니다. 그런 다음 변환을 선택하고 채널을 병합하여 빨간색과 녹색 채널을 병합합니다.이미지 샤이딩을 수정하려면 사전 처리를 선택한 다음 자동 그늘 보정을 선택합니다. 사전 처리 및 롤링 볼을 선택하여 롤링 볼 알고리즘을 적용합니다. 각 미토콘드리온에 대해 이진 마스크를 생성하려면 세분화 및 임계값을 선택합니다.이진 처리 및 접기 테두리를 선택하여 테두리에 의해 잘린 객체를 제거합니다. 측정, 다음 객체 영역, EEQ 직경, 길이, 폭, 거칠기, 원형 또는 연신을 선택표면적, 직경, 길이, 폭, 거칠기, 원형, 원형 또는 연신도. 이러한 측정으로 그룹을 구성하고 MOFO 데이터로 이름을 바꿉니다.그런 다음 측정을 선택한 다음 평균 강도를 선택하여 평균 녹색 및 빨간색 강도를 측정합니다. 그리고 녹색 비율로 빨간색을 측정하는 비율. 이제 이러한 측정을 사용하여 작곡가 그룹을 사용하여 비율 데이터로 이름을 바꿉니다.마지막으로 참조 및 테이블을 CSV로 선택하여 CSV 파일로 테이블을 내보낸 다음, NIS에서 추적 모듈을 열고 보기, 분석 및 추적을 선택하여 Save As.Begin을 선택하여 GA 3 분석 스크립트를 저장합니다. 새 ROI 정의를 클릭합니다. 자동 검출 도구를 사용하여 이미지 시퀀스의 첫 번째 이미지에서 25~50개의 미토콘드리아를 선택한 다음 자동 감지 된 ROI 분석을 클릭합니다.필요한 경우 잘못된 ROI 트랙을 삭제하고 테이블을 CSV 파일로 내보냅니다. 수동으로 로그 처리 하기 전에 측정변환. 각 해석 및 기간동안 참조 획득에서 얻은 평균으로 결과 데이터를 수동으로 정규화합니다.그런 다음 Nova와 일치하는 양방향으로 통계 분석을 수행합니다. LV-G1 미토타이머에 감염된 성상세포의 1차 배양은 서로 다른 수준의 단편화를 통해 균형 잡힌 산화 된 미토콘드리아 네트워크를 감소시켰다. 과산화수소 처리 전에 LV-G1 미토타이머를 발현하는 성상세포는 다양한 녹색 및 적색 형광 강도에서 이질적인 미토콘드리아 크기를 보였다.성상세포 배양의 미토콘드리아 형태는 과산화수소로 6시간 동안 배양한 후 단편화되었다. 그것은 더욱 명백한 12 구형 감소 이후 그들의 직경 없이 치료 후 시간. 과산화수소 처리 후에 3 시간, 홍선 상태 및 회전에 관하여, 성상세포에서 녹색 미토콘드리아의 비율이 증가했습니다.치료 후 3 시간 역학 및 이동성에 관한. 모든 기준은 일시적으로 증가했습니다. 이 기술은 다양한 질문에 적합합니다.예를 들면, 신경 퇴행성 질병의 맥락에서, 우리는 두뇌에서 분비된 다른 분자의 에스트로세포 독성을 조사하고 있습니다.

live-imaging-of-mitochondrial-system-in-cultured-astrocytes

Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

우리는 오랜 기간이 이상의 형광 현미경을 통해 뉴런을 생활에서 mitochondria의 이미징 수있는 프로토콜을 설명합니다. 연장 기간 동안 이미지가 mitochondrially 대상으로 형광 단백질과 설계 및 우리 연구실에 지어진 저렴한 무대 위로 보육의 이용 lentivirus - 중재 표현을 통해 수행됩니다.

Neuromodulation 및 Mitochondrial 교통 : 긴 기간이 이상 Hippocampal 뉴런의 라이브 영상

이 연구는 소설 neuronal 축삭과 (천체) glia 공동 문화 플랫폼을 설정하는 절차를 설명합니다. 이 공동 문화 시스템에서 하나의 축삭 (및 단일 glial 세포) 사이의 직접 상호 작용 조작은 glial 신호에 대한 상호 신경 세포의 기계론의 분석을 수 있도록 가능한된다.

마이크로 유체 문화 플랫폼에 Glia 상호 작용 (MCP) 기반 Neuronal 축삭과 Glia 공동 문화 시스템에 신경의 영상 분석

이 비디오는 미토콘드리아 내에서 형광 단백질을 발현하는 유전자 변형 성상세포의 미토콘드리아 건강 평가를 보여줍니다. 이 단백질은 미토콘드리아 형광이 녹색에서 빨간색으로 변할 때 미토콘드리아 건강의 변화를 추적하는 데 도움이 되며, 이는 스트레스나 손상을 나타냅니다. 이미지는 다양한 매개변수를 사용하여 캡처되고 분석됩니다.

Astrocytes의 미토콘드리아 스트레스에 대한 형광 기반 모니터링

출처: Creighton, BA, et al. 성상세포에서 소기관 및 기타 화물의 세포내 수송을 시각화하고 분석합니다. J. Vis. 경험. (2019년)이 비디오는 산성 엔도리소좀 소포를 선택적으로 표지하는 형광 산향성 프로브를 사용하여 배양된 성상세포에서 세포내 화물 수송의 시각화를 보여줍니다. 공초점 현미경을 사용한 타임랩스 이미징 및 Z-스택 획득을 통해 3차원 세포 부피 전체에 걸쳐 형광 표지된 화물을 추적할 수 있습니다. 이 분석은 고정된 화물과 세포 주변이나 핵으로 이동하는 화물을 구별하여 세포 내 수송 역학에 대한 통찰력을 제공합니다.

배양된 성상세포에서 화물의 세포내 수송 시각화

여기에 설명 된 AWESAM 프로토콜은 빠르고, 단순 하 고 저렴 한 방식으로 다른 뇌 세포 분리에서 murine 이다 경작에 최적입니다. AWESAM 이다 자발적인 캘리포니아2 + 신호, 형태학, 및 유전자 식 프로필 이다에서 vivo에서유사한 전시.

Vivo에서경작-Murine 이다 빠르고, 간단 하 고 저렴 한 AWESAM 프로토콜을 사용 하 여 같은

이 프로토콜 생체 외에서 라이브 이미징 먹어서 분석 결과 이다 phagocytic 용량의 측정을 제공 합니다. Microglia 및 순화 된 쥐 이다 pH 지시자 활용 된 synaptosomes 함께 사용 됩니다. 이 방법은 실시간 engulfment과 저하 속도 검색할 수 있습니다 하 고 사이토 식 균 작용을 조절 하는 요소를 식별 하는 적합 한 심사 플랫폼을 제공 합니다.

소설 체 외에 라이브 이미징 분석 결과의 사이토 중재 먹어서 사용 하 여 pH 지시자 활용 Synaptosomes

여기에서 우리는 세포기관의 세포내 수송 및 뮤린 성상 세포에 있는 혈장 막 단백질의 인신 매매를 구상하는 시험관 내 살아있는 화상 진찰 방법을 기술합니다. 이 프로토콜은 또한 화물 운송 일정 및 역학을 결정하는 이미지 분석 방법론을 제시합니다.

성상 세포에서 세포기관 및 기타 화물의 세포내 운송 시각화 및 분석

우리는 마우스 전뇌의 오르노티픽 슬라이스 배양에서 유전자 로 코딩된 FRET 기반 센서 ATeam1.03YEMK의 세포 형 특이적 발현에 대한 프로토콜을 기술한다. 또한, 우리는 뉴런과 성상 세포에서 세포 ATP 수준의 동적 이미징을 위해이 센서를 사용하는 방법을 보여줍니다.

FRET 기반 센서 ATeam1.03YEMK를 사용하여 마우스 뇌의 오르가노티픽 조직 슬라이스에서 세포 내 ATP 이미징

이 프락토콜은 성상세포와 뉴런에서 생체 외 및 생체 내 미토콘드리아 Ca2+ 이미징을 위한 방법을 제공하는 것을 목표로 합니다.

유전자 인코딩 된 Ca2 + 지표 (GECIs)를 사용하여 성상 세포와 뉴런에서 이미징 미토콘드리아 Ca2 + 섭취

이 문서는 공초점 살아있는 현미경 검사를 사용하여 1 차해 및 피질 뉴런에 있는 급성 동요에 기초 redox 상태 및 redox 반응에 있는 다름을 결정하는 프로토콜을 기술합니다. 프로토콜은 최소한의 수정으로 다른 세포 유형 및 현미경에 적용 될 수 있습니다.

비율 표시기를 사용하여 1 차 신경에 있는 미토콘드리아 글루타티온 Redox 상태의 살아있는 화상 진찰

우리는 hSOD1G93A 쥐 모델에서 근 위축성 측삭 경화증의 병태 생리학에 대한 연구를 위해 세포 내Ca 2+의 타임 랩스 비디오 이미징을 위해 쥐 피질에서 신경교 세포, 성상 세포 및 미세 아교 세포의 1 차 배양을 준비하는 방법에 대한 프로토콜을 제시합니다.

쥐 성상 세포와 미세 아교 세포의 1 차 배양과 근 위축성 측삭 경화증 연구에서의 사용

배우세요 성상 세포에서 MitoTimer 바이오센서를 활용한 미토콘드리아 라이브 이미징 방법입니다. 산화 스트레스 전후의 미토콘드리아 역학, 형태 및 적산화 상태 변화를 정량 분석하여 신경퇴행성 질환 메커니즘 연구에 활용할 수 있습니다.

배양 된 성상 세포에서 미토콘드리아 시스템의 라이브 이미징

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