생쥐에서 발달 중인 난소 예비력의 정량적 3D 분석을 위한 전체 난소 면역형광, 투명화 및 다광자 현미경 검사

이 방법은 생식 분야의 주요 질문 중 하나, 즉 유전적으로 조절되는 과정이 여성에게 영향을 미치는 것으로 알려진 난소 예비력의 크기에 어떻게 그리고 언제 영향을 미치는지, 생식 수명에 대한 답을 찾는 데 도움이 될 수 있습니다.이 프로토콜은 다양한 발달 단계의 온전한 난소에 대해 동일한 기술을 사용하는 대규모 연구에 채택될 수 있습니다. 생식 세포의 효율적인 정량화를 제공하여 생산 가능한 데이터를 생성합니다. 유전적으로 다양한 동일한 종의 동물에 적용되는 이 방법은 생식세포와 난소 발달 및 기타 발달 기관과 같은 유전적 요인에 대한 통찰력을 제공할 수 있습니다.

이 절차를 시연하는 것은 제 연구실의 연구 인턴인 Nathaniel Boechat이 맡을 것입니다.풍성한 계단 장소부터 시작하여 편안한 자세로 발 패드를 통해 모든 다리를 보드에 부드럽게 고정하여 마취된 사춘기 암컷 쥐를 등에 고정합니다. 마우스의 흉강을 열려면 견갑골 바로 아래 흉골 양쪽의 갈비뼈를 조심스럽게 자르고 폐에 구멍을 뚫지 말고 집게로 피부나 갈비뼈 덮개를 잡고 덮개를 고정하여 내부 장기를 노출시키고 해부 가위를 사용하여 심장의 우심방을 자르고 시스템에서 혈액을 방출합니다. 그런 다음 겸자로 심장을 잡고 관류 바늘을 좌심실에 삽입하고 부드럽고 일정한 압력으로 PBS 10ml를 펌핑합니다.

간, 신장 및 생식관과 같은 조직이 분홍색에서 흰색으로 변하면 PBS를 갓 만든 1% 파라포름알데히드 또는 PFA로 대체하고 약 10ml의 PFA로 관류를 계속합니다. 다음으로, 신장 아래의 난소가 있는 지방 패드를 찾아 지방 패드, 난소 및 자궁 뿔을 포함한 전체 생식관을 부드럽게 해부하여 4% PFA가 함유된 바이알에 넣습니다. 난소를 실온에서 16-24시간 동안 고정한 후 4% PFA를 70% 에탄올로 교체하십시오.

염색 당일에는 면역 염색을 진행하기 전에 난소를 다듬습니다. 면역 염색 프로토콜 피펫 1일차에 웰당 1ml의 PBS를 깨끗한 24웰 플레이트의 원하는 웰 수에 주입합니다. 1000 마이크로 리터 피펫 팁의 끝을 잘라 넓은 구멍을 만들고 넓은 팁을 사용하여 70 % 에탄올이 함유 된 바이알의 사춘기 난소를 웰로 부드럽게 옮긴 다음 웰의 PBS를 새로운 0.8 밀리리터의 PBS로 교체하십시오. 다음 날 웰에서 PBS를 흡입하여 웰 당 0.8 밀리리터의 투과 완충액으로 교체하십시오.

셰이커의 플레이트를 실온에서 4시간 동안 배양한 후 투과 완충액을 차단 완충액으로 교체하고 3일째에는 차단 완충액에서 희석하여 1차 항체를 준비합니다. 난모세포를 시각화하려면 난모세포 마커를 사용하여 태아기 난소와 사춘기 전 난소를 배양합니다. 8일째에 새 세척 버퍼로 샘플을 2시간 동안 세척한 다음 세척 버퍼를 차단 버퍼에 희석된 0.5ml의 2차 항체 혼합물로 교체합니다.

증발을 방지하기 위해 파라필름으로 플레이트를 밀봉하고 시료를 실온에서 어둠 속에서 3일 동안 배양합니다. 면역 염색 세척 후 11일째에 세척 버퍼를 흡인하고 어두운 곳에서 3일 동안 섭씨 37도에서 0.8ml의 스케일 큐빅 원 솔루션으로 샘플을 배양합니다. 저울 큐빅 하나의 솔루션을 매일 교체하십시오.

15일째에 샘플을 10분 동안 3회 세척하고 PBS 0.8ml를 실온에서 부드럽게 흔들어 세척합니다. 그런 다음 PBS를 갓 준비한 가스 제거 20% 자당 0.8ml로 PBS로 교체한 다음 실온에서 부드럽게 흔듭니다. 1 시간 후에 20 % 자당 용액을 교체하여 앞에서 설명한 것처럼 4-5 일 동안 0.8 밀리리터의 스케일 입방 2 용액으로 샘플을 처리합니다.

샘플 설정을 준비하려면 팁 컷오프가 있는 200마이크로리터 피펫 팁을 사용하여 15-20마이크로리터의 스케일 입방체 2 용액이 있는 사춘기 난소를 접착제 웰의 중앙으로 이동합니다. 일단 난소가 세척 용액 한 방울과 함께 개별 웰로 옮겨지면 접착제 웰에 커버 유리를 부드럽게 놓고 눌러 두 개의 커버 슬립 사이에 샘플과 세척 용액을 끼워 밀봉을 만듭니다. 화상 진찰 장소를 위해, 3D 인쇄된 현미경 접합기 활주에 있는 덮개 미끄러짐 샌드위치.

현미경 코어 또는 제조업체의 사양에 따라 이미지 획득을 위한 매개변수를 설정합니다. 가능한 경우 양방향 이미지 획득을 사용하여 스캔 시간을 줄이고 효율성을 개선하십시오. 소프트웨어에서 라인 평균, 프레임 평균 및 프레임 누적을 조정합니다.

시작 위치와 끝 위치를 식별하여 Z 스택을 설정한 다음, 사춘기 난소의 경우 2마이크로미터, 사춘기 난소의 경우 5마이크로미터의 Z 단계 크기를 선택합니다. 그런 다음 Z 보상 기능과 여기 게인을 활성화합니다. 샘플의 하단과 상단 모두에 대한 레이저 강도를 선택하여 Z 보정을 설정합니다.

단일 시야에서 캡처할 수 없는 더 큰 샘플에 대해 타일링 모드를 사용합니다. 이미지 탐색기를 활성화하고 직사각형 마킹 도구로 전체 샘플을 캡처하는 데 필요한 타일 수를 표시합니다. 설정이 완료되면 여러 타일이 있는 이미지에 대한 이미지 획득부터 시작하여 탐색기로 이미지 획득을 시작하여 모든 타일을 캡처합니다.

이미지 획득 후 모든 이미지를 저장합니다. 여러 타일을 획득한 경우 모자이크 병합 도구를 실행하여 타일을 단일 이미지로 병합합니다. 난모세포의 크기를 확인하려면 이미지를 열고 슬라이스 옵션을 선택하여 Zs 스택 이미지를 엽니다.

선 옵션과 측정 패널을 선택하고 난모세포 또는 마커의 한쪽 가장자리에서 가장 넓은 지점의 다른 가장자리까지 선을 그려 거리를 측정하여 난모세포의 X, Y 직경을 결정합니다. 스택을 통해 이동하여 동일한 유형의 여러 난모세포에 대한 직경 범위를 얻습니다. 가장 짧은 길이를 난모세포 수에 대한 크기 선택 기준으로 사용합니다.

그런 다음 3D 보기 옵션에서 스폿 피쳐를 선택합니다. scene 패널에서 add new spots 함수를 활성화하여 algorithm 패널을 엽니다. 그런 다음 모든 알고리즘 설정을 이전에 얻은 난모 세포 크기를 사용하여 크기 선택 필터로 선택 취소합니다.

채널 앞으로 화살표를 클릭하여 소스 채널로 이동합니다. 그런 다음 선호하는 마커가 있는 채널을 선택하고 추정된 X, Y 지름으로 획득한 지름을 입력합니다. 크기를 선택한 후 자동으로 결정되는 모델 PSF 연신율 및 배경 빼기를 활성화합니다.

그런 다음 단일 앞으로 화살표를 선택하여 필터 스폿 패널로 이동하고 품질 필터를 추가하여 임계값을 결정합니다. 난모세포 수를 정확하게 추정하기 위해 이미지를 확대합니다. 나중에 이중 화살표를 클릭하여 자동 계산을 마칩니다.

편집 탭을 사용하여 누락된 난모세포를 수동으로 선택하거나 자동 임계값에 의해 선택된 비난모세포 입자를 선택 취소할 수 있습니다. 완료되면 추가 분석을 위해 전체 탭 아래의 통계 탭에 데이터를 기록합니다. 총 난모세포 수와 손상된 난소를 추정하려면 MRS로 온전한 난소의 이미지를 열고 프레임 기능을 선택합니다.

프레임 설정에서 상자 그리드 눈금 표시를 선택하고 레이블에 액세스합니다. 위치 XYZ 탭에서 200마이크로메를 선택하여 모든 XYZ 위치에 200마이크로미터 간격의 눈금 표시를 생성합니다. 200마이크로미터 눈금 표시를 사용하여 각 난소 부피의 50% 이내에 속하는 난모세포를 선택합니다.

스폿 기능을 클릭하고 편집 레이블을 선택하여 50% 영역에 속하는 난모세포를 색상별로 분류합니다. 비관류 난소와 관류된 난소의 대표적인 회색조, 다광자 이미지에서, 세포질 DDX4 염색의 얇은 층이 있는 원시 난포의 작은 난모세포를 볼 수 있습니다. 또한, 성장하는 난포 내의 더 큰 난모세포가 발견되었습니다.

태아기와 산후 난소의 다광자 이미지로부터의 3D 렌더링을 연구했습니다. 출생 후 28일째에, 방사선 조사를 받지 않은 대조군 암컷의 난소는 원시 난포에 작은 난모세포를 많이 포함하고 있었다. 대조적으로, 감마선이 0.5 회색인 방사선 조사를 받은 여성의 난소에는 일차 난포에 작은 난모세포가 전혀 없었습니다.

그러나 더 큰 난모세포는 여전히 존재했습니다. 난모세포의 정량화를 위해 3D 다광자 이미지는 goucian 필터를 사용하여 MRS 소프트웨어에서 처리되었으며 스폿 기능을 사용하여 크고 작은 난모세포를 식별하고 정량화했습니다. 다음으로, 각 단계에서 난모세포의 평균 비율을 계산하였으며, 가장 초기에 존재하는 평균 수와 비교하여 E 15.5 난모세포 수는 E 15.5와 E 18.5 사이에서 급격히 감소하였고, E 15.5 및 E 18.5 태아 난모세포는 다광자 이미지에서 볼 수 있듯이 1계통 또는 P선으로 발현되었습니다.

강도 분석은 E 18.5에서 E 15.5보다 난모세포당 1라인 또는 1개의 P가 더 높게 발현되는 것을 보여주었습니다. 손상이 작은 난소를 분석에 사용할 수 있습니다. 총 난모세포 수는 컴퓨터 보정을 사용하여 결정됩니다.

대표적인 모델은 E 15.5 난소에서 G CNA 양성 난모세포를 보여주며, 온전한 난소에서 5개의 10% 영역이 강조되어 있습니다. 유사하게, 난소의 최대 50%가 누락된 10%증분 영역이 있는 시뮬레이션된 난소가 생성되었습니다. 총 난모세포 수와 시뮬레이션된 난소를 원래의 온전한 난소와 비교했습니다.

그리고 그 차이는 백분율 편차로 제시되었습니다 : Good perfusion 결과는 좋은 이미지 품질을 제공합니다. 따라서 PFA로 전환하기 전에 모든 조직을 PBS로 세척해야 합니다. 여분의 조직을 잘라내어 난소가 완전히 노출되었는지 확인하십시오.

이 프로토콜은 많은 수의 샘플을 효율적으로 분석할 수 있으며, 협업 교차 또는 다양성 출력과 같은 유전자 참조 모집단에서 얻은 정량적 데이터는 난모세포 발달 및 난모세포 수의 유전적 변형자를 식별하는 데 도움이 됩니다.