전체 난소 면역 형광, 클리어링 및 마우스에서 난소 예비의 정량적 3D 분석을위한 다중 광자 현미경 검사

이 방법은 생식 분야의 주요 질문 중 하나, 즉 유전자 조절 과정이 여성에게 영향을 미치는 난소 보호 구역의 크기에 어떻게 그리고 언제 영향을 미치는지, 생식 수명에 대한 답변을 도울 수 있습니다.이 프로토콜은 다른 발달 단계의 온전한 난소에 대해 동일한 기술을 사용하여 대규모 연구에 채택 될 수 있습니다. 그것은 생식 세포의 효율적인 정량화를 제공함으로써 생산 가능한 데이터를 생성합니다. 동일한 종의 유전적으로 다양한 동물에 적용된이 방법은 생식 세포 및 난소 발달 및 기타 개발 기관에 직접 유전 적 요인에 대한 통찰력을 제공 할 수 있습니다.

절차를 시연하는 것은 내 실험실의 연구 인턴 인 Nathaniel Boechat이 될 것입니다 증식 단계 장소로 시작하여 마취 된 사춘기 여성 마우스를 뒤쪽에 고정시켜 발 패드를 통해 모든 다리를 부드럽게 보드에 고정시킵니다. 마우스의 흉강을 열려면 견갑골 바로 아래의 흉골 양쪽에있는 갈비뼈를 조심스럽게 자르고 폐에 구멍을 뚫지 말고 포셉으로 피부나 갈비뼈 플랩을 잡고 플랩을 고정하여 내부 장기를 노출시킵니다 해부 가위를 사용하여 심장의 오른쪽 심방을 자르고 시스템에서 혈액을 방출하십시오. 그런 다음 포셉으로 심장을 잡고 관류 바늘을 좌심실에 넣고 부드럽고 일정한 압력으로 PBS 10 밀리리터를 펌핑하십시오.

간 신장 및 생식관과 같은 조직이 분홍색에서 흰색으로 변하면 PBS를 갓 만든 1 % 파라 포름 알데히드 또는 PFA로 교체하고 약 10 밀리리터의 PFA로 관류를 계속하십시오. 다음으로 신장 아래의 난소가있는 지방 패드를 찾아 지방 패드 난소와 자궁 뿔을 포함한 전체 생식관을 부드럽게 해부하여 4 % PFA가있는 바이알에 넣으십시오. 4 % PFA를 70 % 에탄올로 교체하기 전에 난소를 실온에서 16 ~ 24 시간 동안 고정하십시오.

염색 당일에 면역 염색을 진행하기 전에 난소를 다듬는다. 면역염색 프로토콜의 첫째 날에 웰 당 PBS의 밀리리터 하나를 깨끗한 24 웰 플레이트 내의 원하는 수의 웰에 피펫팅한다. 1000 마이크로리터 피펫 팁의 팁을 잘라 넓은 개구부를 만들고 넓은 팁을 사용하여 70 % 에탄올을 함유 한 바이알에서 사춘기 난소를 웰스로 부드럽게 옮긴 다음 우물의 PBS를 신선한 0.8 밀리리터의 PBS로 교체하십시오 다음날 웰에서 PBS를 흡인하여 웰 당 0.8 밀리리터의 투과 버퍼로 교체하십시오.

플레이트를 실온에서 네 시간 동안 진탕기 상에서 인큐베이션한 후 투과 완충액을 블로킹 완충액으로 교체한 후, 셋째 날에, 블로킹 완충액에 희석하여 일차 항체를 준비한다. 난모세포를 시각화하기 위해 난모세포 마커와 함께 산전 및 전즙 난소를 배양한다. 여덟 번째 날에 샘플을 두 시간 동안 신선한 세척 완충액으로 세척한 다음, 세척 완충액을 블로킹 완충액에 희석된 0.5 밀리리터의 이차 항체 혼합물로 교체한다.

증발을 방지하기 위해 플레이트를 파라필름으로 밀봉하고 샘플을 어둠 속에서 실온에서 사흘 동안 인큐베이션한다. 면역염색 세척 후 11일째에, 세척 완충액을 흡인하고, 샘플을 암흑 속에서 3일 동안 섭씨 37도에서 0.8 밀리리터의 스케일 입방 용액으로 인큐베이션한다. 스케일 입방 한 용액을 매일 바꿉니다.

15일째에, 샘플을 10분 동안 세 번 세척하고, 실온에서 0.8 밀리리터의 PBS를 부드럽게 진탕하면서 세척한다. 이어서, PBS를 PBS로 교체하고 갓 제조된 탈기된 20%sucrose의 0.8 밀리리터를 PBS로 교체한 다음, 실온에서 부드럽게 진탕시켰다. 한 시간 후 20 % sucrose 용액을 교체하여 앞에서 설명한 것처럼 0.8 밀리리터의 스케일 입방 두 용액으로 샘플을 4 ~ 5 일 동안 처리하십시오.

샘플 셋업을 준비하려면, 팁 컷오프와 함께 200 마이크로리터 피펫 팁을 사용하여 15 내지 20 마이크로리터의 스케일 입방 2 용액으로 사춘기 난소를 접착제 웰의 중간으로 옮깁니다. 난소가 클리어링 용액 한 방울로 개별 웰로 옮겨지면 접착제 웰에 커버 글라스를 부드럽게 놓고 프레스하여 두 개의 커버 슬립 사이에 샘플을 샌드위치하고 용액을 클리어링하는 씰을 만듭니다. 이미징 장소의 경우, 커버 슬립 샌드위치를 3D 프린팅된 현미경 어댑터 슬라이드에 넣습니다.

현미경 코어 또는 제조업체의 사양에 따라 이미지 수집을 위한 파라미터를 설정합니다. 사용 가능한 경우 양방향 이미지 수집을 사용하여 스캐닝 시간을 줄이고 효율성을 향상시킵니다. 소프트웨어에서 라인 평균, 프레임 평균 및 프레임 누적을 조정하십시오.

시작과 끝 위치를 식별하여 Z 스택을 설정 한 다음 사춘기 난소의 경우 두 마이크로 미터의 Z 단계 크기를 선택하고 사춘기 난소의 경우 다섯 마이크로 미터를 선택하십시오. 그런 다음 Z 보정 기능과 여기 게인을 활성화하십시오. 두 가지 모두에 대해 레이저 강도를 선택하여 샘플의 아래쪽과 위쪽에 대한 Z 보정을 설정합니다.

단일 시야각에서 캡처할 수 없는 더 큰 샘플의 경우 바둑판식 모드를 사용합니다. 이미지 네비게이터를 활성화하고 직사각형 표시 도구를 사용하여 전체 샘플을 캡처하는 데 필요한 타일 수를 표시합니다. 설정이 완료되면 여러 타일이있는 이미지의 이미지 수집부터 시작하여 네비게이터로 이미지 수집을 시작하여 모든 타일을 캡처하십시오.

이미지 수집 후 모든 이미지를 저장합니다. 여러 타일을 획득한 경우 모자이크 병합 도구를 실행하여 타일을 단일 이미지로 병합합니다. 난모세포의 크기를 결정하려면 이미지를 열고 슬라이스 옵션을 선택하여 Zs 스택 이미지를 엽니다.

선 옵션과 측정 패널을 선택하고 난모세포 또는 마커의 한쪽 가장자리에서 가장 넓은 지점에서 다른 가장자리까지 선을 그려 거리를 측정하여 난모세포의 X Y 직경을 결정합니다. 스택을 통해 이동하고 동일한 유형의 여러 난모세포에 대한 직경 범위를 구하십시오. 난모세포의 크기 선택 기준이 계산됨에 따라 가장 짧은 길이를 사용하십시오.

그런 다음 3D 보기 옵션에서 스팟 피쳐를 선택합니다. 장면 패널에서 새 스팟 추가 기능을 활성화하여 알고리즘 패널을 엽니다. 그런 다음 이전에 얻은 난모세포 크기를 가진 크기 선택 필터로 모든 알고리즘 설정을 선택 취소하십시오.

채널 앞으로 화살표를 클릭하여 소스 채널로 이동합니다. 그런 다음 선호하는 마커가있는 채널을 선택하고 추정 된 X, Y 직경에 획득 된 직경을 입력하십시오. 크기 선택 후 모델 PSF 신장 및 배경 뺄셈을 활성화하여 자동으로 결정됩니다.

그런 다음 단일 앞으로 화살표를 선택하여 필터 스팟 패널로 이동하고 품질 필터를 추가하여 임계값을 결정합니다. 난모세포 수의 정확한 추정을 보장하기 위해 이미지를 확대한다. 나중에 이중 화살표를 클릭하여 자동 카운트를 완료합니다.

편집 탭을 사용하여 놓친 난모세포를 수동으로 선택하거나 자동 임계값으로 선택한 비난모세포 입자를 선택 취소합니다. 완료되면 추가 분석을 위해 전체 탭 아래의 통계 탭에 데이터를 기록합니다. 총 난모세포 수와 손상된 난소를 추정하려면 MRS로 손상되지 않은 난소의 이미지를 열고 프레임 특징을 선택하십시오.

프레임 설정에서 상자 격자 눈금 표시를 선택하고 레이블에 액세스합니다. 위치 XYZ 탭에서 200마이크로미터를 선택하여 모든 XYZ 위치에 200마이크로미터 공간이 있는 눈금 표시를 생성합니다. 200 마이크로 미터 틱 마크를 사용하여 각 난소 부피의 50 % 이내에있는 난모세포를 선택하십시오.

반점 특징을 클릭하고 편집 라벨을 선택하여 50 % 영역에 속하는 난모세포를 색상으로 분류하십시오. 비관류 및 관류 난소의 대표적인 회색조, 다중 광자 이미지에서, 세포질 DDX4 염색의 얇은 층과 함께 원시성 난포에 있는 작은 난모세포가 보여질 수 있었다. 또한, 성장하는 난포 내에서 더 큰 난모세포가 발견되었습니다.

산전 및 산후 난소의 다중 광자 이미지로부터의 3D 렌더링이 연구되었다. 출생 후 28일째에, 대조군 비조사된 여성으로부터의 난소는 원시적 난포에 작은 난모세포의 큰 집단을 함유하였다. 대조적으로, 감마 방사선의 0.5 회색을 가진 조사 된 암컷으로부터의 난소는 원발성 난포에 작은 난모세포가 전혀 결여되어 있었다.

그러나 더 큰 난모세포는 여전히 존재했다. 난모세포의 정량화를 위해, 3D 다중 광자 이미지를 구시안 필터를 사용하여 MRS 소프트웨어에서 처리하고 작고 큰 크기의 난모세포를 스팟 특징을 사용하여 식별하고 정량화했습니다. 다음으로, 난모세포의 평균 백분율은 다중 광자 이미지에서 볼 수 있는 바와 같이 E15.5 및 E 18.5 사이에서 급격히 감소한 E 15.5 및 E 18.5 태아 난모세포 발현 라인일 orf일 P에 존재하는 평균 수와 비교하여 각 단계에서 계산되었다.

강도 분석은 E 15.5보다 E 18.5에서 난모세포 당 하나의 orf 1P의 선 1의 더 높은 발현을 나타냈다. 작은 손상이있는 난소는 분석에 사용할 수 있습니다. 총 난모세포 수는 계산 보정을 사용하여 결정됩니다.

대표적인 모델은 E15.5 난소에서 G CNA 양성 난모세포를 나타내며 무손상 난소에서 강조 표시된 5 개의 10 % 영역을 가지고 있습니다. 유사하게, 난소의 최대 50%까지 누락된 10% 증분 영역을 갖는 시뮬레이션된 난소가 생성되었다. 총 난모세포 수 및 시뮬레이션된 난소를 원래의 온전한 난소와 비교하였다.

그리고 그 차이는 퍼센트 편차로 제시되었다 좋은 관류 결과는 좋은 화질에서 결과이다. 따라서 PFA로 전환하기 전에 PBS로 모든 조직을 제거해야합니다. 여분의 조직을 트리밍하여 난소가 완전히 노출되었는지 확인하십시오.

이 프로토콜은 많은 수의 샘플의 효율적인 분석을 허용하며, 협업 교차 또는 다양성 출력과 같은 유전 참조 집단으로부터 얻은 정량적 데이터는 난모세포 발달 및 난모세포 수의 유전 적 변형자를 식별하는 데 도움이 될 것입니다.