אין ויוו הדמיית סידן בשדה רחב ושני פוטונים מעכבר באמצעות חלון גולגולתי גדול

פרוטוקול זה מראה יצירה של חלון גולגולתי גדול למדידת פעילויות של שדה רחב והזמנה של תא בודד באותו עכבר. בשיטה שלנו ניתן להכין חלון גולגולתי גדול ויציב עם עטיפת מזון בעלות נמוכה. שיטה זו יעילה לחקר הפעילות העצבית והגלילית במהלך התנהגות ברמות מקרוסקופיות ומיקרוסקופיות.

מומלץ להתחיל עם חלון גולגולתי קטן. ואז אם זה הצליח, להגדיל את גודל החלון. התחילו בהסרת המלט הנוסף מעל הגולגולת באמצעות מקדחה דנטלית.

סמן את האזור שיש לחתוך בעט. חותכים לתוך העצם באמצעות אזמל עם קצה קהה כדי להבטיח כי הקצה אינו חודר את הגולגולת. מגרדים את העצם שוב ושוב עם אזמל כדי להעמיק את החריץ עד שהעצם באזור שיש לחתוך נעה כאשר נוגעים קלות.

הסר את העצם החתוכה עם פינצטה עדינה. היזהרו לא לדחוף את דש העצם לתוך המוח, מה שעלול להזיק למוח. כדי להסיר את הדורה מאטר, חותכים את הדורה באמצעות פיפטה זכוכית משוכה עם קצה מחודד של כ -10 מיקרומטר.

השתמש במחט בצורת U כדי להרחיב את החתך הזה על פני כל החלון. תחת מיקרוסקופ סטריאו המוגדר בזום של 60 עד 100x, הסר את הדורה מאטר הכרות באמצעות פינצטה עדינה במיוחד. במקרה של דימום, יש לשטוף עם aCSF או להשתמש בספוג ג'לטין כדי לעצור את הדימום.

לאחר מכן, עקרו חתיכה גדולה של עטיפת PVDC על ידי אוטוקלבינג ועם 70% אתנול. תחת מיקרוסקופ סטריאו, השתמש בפינצטה ובאזמל כדי לחתוך עטיפה בגודל הנדרש. הניחו את העטיפה על פני המוח תוך השארת ה-aCSF על פני השטח.

שאבו את ה-aCSF מקצה העטיפה, ואפשרו לעטיפה להידבק בחוזקה לפני השטח של המוח. חותכים את העטיפה עם אזמל ופינצטה כך שיש בערך מרווח של מילימטר אחד בין קצה חלון הגולגולת לעטיפה. לאחר שהעטיפה נמצאת במקומה, הדביקו את קצה העטיפה לגולגולת בדבק ביולוגי.

תנו לדבק להתייבש במשך כ-30 דקות. בעזרת מתקן עם קצה ערבוב, יש למרוח אלסטומר סיליקון שקוף על גבי העטיפה. מניחים את הכיסוי בעובי 0.12 עד 0.17 מילימטרים מעל.

אטמו את היקף זכוכית הכיסוי עם סרט עמיד למים, superglue או מלט דנטלי. ראשית, ערבבו תמיסות פיברואין ו-AAV ביחס של אחד עד ארבעה בצינור דגימה קטן. משליכים אליקוט של התמיסה על הניילון הנצמד לחלון הגולגולת ומייבשים אותו לפחות שלוש שעות.

לאחר מכן הצמידו את העטיפה לפני השטח של המוח כפי שמוצג בסעיף הקודם. בדוק את מצב העכברים והחלונות באופן קבוע, שבועיים עד ארבעה שבועות. בשלב זה, מחווני הסידן המקודדים גנטית יבואו לידי ביטוי מספיק לאחר יצירת החלון המטופל ב- AAV.

באמצעות פרוטוקול זה, ניתן היה לתחזק חלונות גולגולתיים בשמונה מתוך עשרה עכברים למשך עד 10 שבועות. חלון רחב נוצר עם ניילון נצמד, סיליקון שקוף וזכוכית כיסוי בעכבר מהונדס המבטא מחוון סידן מקודד גנטית מעוגן בממברנה באסטרוציטים. הדמיית סידן בשדה רחב בוצעה דרך חלון זה ושינויים פלואורסצנטיים נצפו כאשר גירוי נפיחות אוויר הופעל על שפם קונטרלטרלי.

מהלך הזמן של השינוי הפלואורסצנטי בקליפת המוח הסומטוסנסורית הראה פעילות קליפת המוח. הדמיה של שני פוטונים אפשרה תצפית על תמונות פלואורסצנטיות של תאים בודדים ספציפיים לתאי גליה. שינויים פלואורסצנטיים המושרים על ידי גירוי חושי נצפו בתאים בודדים מאזורים שונים בקליפת המוח.

עטוף מקודד עם AAV המבטא מחוון סידן מקודד גנטית;ופיברואין שימש להכנת חלון הגולגולת. הדמיית סידן בשדה רחב הראתה פעילות קליפת המוח המתפשטת על פני קליפת המוח המושרה על ידי גירוי חושי שבועיים עד ארבעה שבועות לאחר הניתוח. מאחר שהחלון היה גדול, צולמו אזורים שונים בקליפת המוח של אותו עכבר, ונצפו שינויים פלואורסצנטיים המושרים על-ידי גירוי חושי בתאים בודדים.

חשוב למנוע נזק למוח בעת ביצוע חלון גולגולתי. אפשר לבצע משימות התנהגות על עכברים עם חלון גולגולתי גדול. זה יאפשר לבחון את הקשר בין פעילות עצבית להתנהגות עכברים.

שיטה זו יכולה להיות מיושמת על מגוון רחב של מחקרים במדעי המוח. לדוגמה, ניתן להשתמש בו כדי לבחון פעילות קליפת המוח במהלך משימות קבלת החלטות, ריצה מוטורית, ובמודלים המוניים של פגיעה מוחית ומחלות.