Laser Microdissection Toegepast op gen expressie profilering van de subset van cellen uit de Drosophila Wing Disc

Hierin geven wij een grondige beschrijving van laser-microdissectie die is toegepast om een vergelijkende RNA-transcriptprofilering uit te voeren van gesilenced en niet-gesilenced gebieden van de vleugelschijf van drosophila. Deze aanpak vereist als biologisch materiaal handmatig gedissecteerde drosophila-imaginale schijven en als hoofdapparatuur een laser-microdissector. Wij maken gebruik van de LI A-L-L-M-D 6, 000 en een real-time PCR-apparaat.

We hebben een BioRad iq gebruikt. De vijf benodigde kleine instrumenten zijn een concave plaat, een klein schilderspenseel, microdissectie-pincetten, een objectglas voor hangende druppels en insectenpinnen, gemonteerd op spuitnaalden, een metalen frame met PET-membraan en kleine plastic buisjes. Deze methode omvat de volgende stappen.

Stap één: het kruisen van twee geschikte oph-transgene lijnen om een lokale en specifieke gen-silencing in het nageslacht te triggeren met behulp van het GAL4-UAS-systeem. Stap twee: het behandelen van de dissectiekaders. Stap drie: het instellen van de laser-microdissector.

Stap vier: het handmatig verzamelen van de vleugel-imaginale schijven uit het larvale nageslacht van de genetische kruising. Stap vijf: het uitvoeren van laser-microdissectie van specifieke gebieden van de GFP-gelabelde imaginale schijven. Stap zes: transcriptieprofilering van equivalente gebieden van gedempte en niet-gedempte regio's van de schijf maakt het mogelijk om de effecten vast te stellen die worden getriggerd door het dempen van uw gen van interesse.

Voor transcriptieprofilering in vivo van gen X is de extractie van RNA uit de micro-gedissecteerde gebieden vereist, samen met controle van de nauwkeurigheid van de handmatige dissectie, evaluatie van de GFP-expressie in de twee monsters via RT-PCR, en kwantificering van de expressie van vermeende targets van het gesilencede gen in de twee monsters via real-time RT-PCR of door het uitvoeren van een microarray-analyse. Hier volgen meer details over elke stap.

De eerste stap is de genetische kruising. De genetische kruising maakt gebruik van GAL4 UAS-transgene stammen en is gericht op het verkrijgen van gesilenceerde imaginale schijven in het larvale nageslacht. Het veelzijdige GAL4-systeem stelt u in staat om specifieke en gelokaliseerde gensilencing uit te lokken via RNA-interferentie.

Eén stam introduceert in de kruising het driver-transgen dat GAL4 tot expressie brengt in een specifiek temporeel of ruimtelijk patroon, en een UAS-GFP-reporter die de visualisatie van het GAL4-expressiedomein mogelijk maakt. De tweede stam introduceert een UAS-responder-transgen dat hairpin-silencing-RNA tot expressie brengt, dat in staat is om gen X specifiek te targeten zodra het in de cel tot expressie komt.

Dit RNA wordt gesplitst om small interfering RNA te genereren, dat in staat is om het geselecteerde gen X specifiek uit te schakelen in het nageslacht van deze kruising. Het UAS-silencing transgene wordt alleen getranscribeerd in cellen die het GAL4-eiwit tot expressie brengen, waardoor een ruimtelijk beperkte silencing van het X-gen wordt geïnduceerd. Van de diverse toepassingen hebben wij ons gericht op RNA-transcriptprofilering in de vleugelschijf die is gesilenced door de Grailed GAL4-driver, welke specifieke silencing in het posterieure compartiment aanstuurt.

De stilte regio wordt gemarkeerd door de expressie van het U-A-S-G-F-P transgeen. In het posterieure compartiment zullen twee gebeurtenissen worden getriggerd: de expressie van GGFP en de silencing van gen x.

Stap twee: behandeling van de dissectiekaders om de RNase-activiteit te remmen. Was de objectglazen voor de kaders en de dissectie-instrumenten gedurende ten minste één uur bij kamertemperatuur met DEPC-water en laat ze drogen in een steriele kamer. Om de RNase-activiteit te remmen, gebruikt u een gloednieuwe, reeds RNase-vrije koker van 50 ml, gevuld met DEPC-water, waarin met een pincet een hangend-druppel-objectglas en een pet-kader zijn geplaatst.

Beide zijn nodig voor de microdissectie. Sluit de buis, keer deze om en laat het mengsel ten minste één uur reageren. Bij kamertemperatuur, breng het DEPC-water na één uur met de pincet over naar een andere buis.

Houd de objectglazen in de buis zodat ze niet vallen. Laat de objectglazen vervolgens in de buis drogen. Stap drie, opstelling voor microdissectie.

Zet eerst alle benodigde apparatuur aan: de fluorescentielamp, de microscoop en de software voor de microdissectie. Een waarschuwingsvenster herinnert u eraan om ook de laser in te schakelen. Doe dit en laat de laser opwarmen terwijl u de configuratie voor de microdissectie voltooit.

Nu is het tijd om de putjes voor te bereiden waarin het weefsel wordt opgevangen. De Leica LMD 6,000 laser-cutapparatuur maakt het mogelijk om maximaal vier buisjes te laden voor het verzamelen van verschillende monsters. Voor ons doel hebben we slechts twee buisjes nodig.

De ene om GFP-positief gene-silenced weefsel te verzamelen, de andere om GFP-negatief niet-silenced weefsel te verzamelen met een micropipet. Vul beide buisdoppen met 20 µL TRI-reagensoplossing om het RNA te conserveren. Nu is de microdissectie klaar voor gebruik. Stap vier: handmatige dissectie van vleugelschijven uit joof-larven.

Isoleer vleugelschijven uit het larvale nageslacht zoals eerder beschreven, en zorg ervoor dat andere weefsels de schijven niet contamineren. Om dit doel te bereiken, is de dissectieaanpak wezenlijk anders dan die welke gewoonlijk wordt gebruikt om de bulk van alle oorspronkelijke schijven te verzamelen. Was de larve eerst in ringersoplossing om aanhechtend medium te verwijderen. Breng deze vervolgens over naar een hanging drop slide en snijd de kop direct af terwijl de mond naar beneden wordt getrokken.

Gebruik de insectenpennen om nu voorzichtig andere weefsels weg te dissecteren. De rode omtrek geeft de imaginale vleugelschijven aan die moeten worden verzameld. Houd de schijven vrij van aanhechtend weefsel; breng elke geïsoleerde vleugelschijf snel en voorzichtig over naar een dissectiekader voor onmiddellijk snijden.

Deze procedure moet worden herhaald totdat een totaal aantal van honderd vleugelschijven is bereikt. Stap vijf, laser-microdissectie van specifieke gebieden van GFP-gelabelde vleugelschijven. Zodra de oorspronkelijke vleugelschijf zich op het membraan bevindt, kunt u overgaan tot het snijden.

Plaats het frame in de houder en bevestig de houder op de gemotoriseerde tafel. Zoek de oorspronkelijke vleugelschijf op door de LMD 6, 000 als gewone microscoop te gebruiken. Stel scherp op de schijf en stel de snede in.

Teken een ovaal gebied dat op beide zijden van de schijf past, zowel de GFP-positieve zijde als de andere zijde. Selecteer de buisdop waarin u het GFP-positieve deel wilt verzamelen. Druk op de knop Start cut.

De microdissector gaat over tot het snijden van het weefsel met de snelheid en kracht die u vooraf heeft ingesteld door de functies verplaatsen en snijden te selecteren. U kunt het snijden handmatig verfijnen totdat het niet-geselecteerde stuk weefsel loslaat. De 3D-animatie laat zien wat er gebeurt tijdens het snijden met de microdissector: een laser wordt op het weefsel gefocust om een snede langs de geselecteerde omtrek te maken.

Zodra de snede is voltooid, valt het stuk weefsel in de geselecteerde dop van de buis en vervolgens in het tri Reagent. Verplaats na de eerste snede het snijgebied naar de andere zijde van de vleugelschijf om een gelijkwaardig GFP-negatief gebied uit te snijden. Zorg ervoor dat u vóór de nieuwe snede een andere dop van de buis selecteert om de GFP-positieve weefsels gescheiden te houden van de GFP-negatieve weefsels.

Druk op de knop voor het starten van de snede na de automatische snede. Ga over tot het handmatig verfijnen van de snede, zoals getoond in de 3D-animatie vóór de tweede snede. De gemotoriseerde tafel verplaatst de geselecteerde dop van de buis naar het snijgebied.

De laserstraal focust op het weefsel langs de geselecteerde omtrek, en zodra de snede is voltooid, valt het weefselstuk in de geselecteerde buisdop met Tri-reagens. Om voldoende materiaal te verzamelen, herhaalden we de procedure bij honderd imaginale vleugelschijven. Zodra de monsters zijn verzameld, verwijdert u de buisjes.

Dit is een delicate stap waarbij u al het tot nu toe verrichte werk kunt verliezen. Wees daarom voorzichtig. Sluit de dop ondersteboven en ga verder met het experiment.

Dit is degene met GFP-positief weefsel. Dit is de andere met GFP-negatief weefsel. Stap zes, transcriptieprofilering.

Centrifugeer de buisjes om de vloeistof van de dop te scheiden en voeg tot 1 mL Try-reagens toe. Voer de RNA-extractie uit volgens het standaard Try-reagensprotocol vanaf honderd gebieden van ongeveer 5.000 µm² elk. Onze opbrengst was 1,5 µg RNA.

We gebruiken superscript drie in vitrogen om CD NA te synthetiseren met willekeurige hexa. De nauwkeurigheid van de handmatige dissectie werd gecontroleerd door de GFP-expressie in de twee monsters te controleren via R-T-P-C-R. Zoals getoond in de gel met kwantitatieve R-T-P-C-R.

We hebben de expressieniveaus van het stilgelegde gen X geëvalueerd, samen met die van mogelijke vermeende doelen van het door gen X gemedieerde regulatoire pad. Dit diagram toont een voorbeeld van de expressieniveaus van gen X en een van de vermeende doelen ervan. Deze worden genen Y genoemd met betrekking tot hun basale expressieniveaus in de anterieur-posterieure compartimenten van ongesolideerde vleugelschijven.

De activiteit van het geselecteerde gen X bleek na silencing te zijn afgenomen tot 40%. In contrast hiermee was een van de vermeende targets, gen Y, significant upgereguleerd met een zevenvoudige toename, wat ons leidde tot de validatie van de hypothese dat dit gen negatief werd gereguleerd door gen X. We concluderen dat de hierboven beschreven experimentele aanpak succesvol kan worden toegepast voor de validatie van vermeende targets in diverse regulatoire pathways.