Name: Laser Microdissection Toegepast op gen expressie profilering van de subset van cellen uit de Drosophila Wing Disc (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-04-30T17:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 59 s
Description: Leer laser microdissectie voor genexpressieprofilering in Drosophila vleugelschijven. Deze methode combineert RNA-interferentie met qRT-PCR om genregulatie in specifieke weefselcompartimenten te analyseren.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

De auteurs danken prof.. Chiara Campanella en AMRA Center of Competence, Universiteit van Napels Federico II, Napels, Italië, hen te voorzien van het gebruik van de laser microdissector, en de heer Vincenzo Vicidomini voor genereuze hulp in de 3D-animatie.

Deel 1. De voorbereiding van Drosophila imaginaire Wing Discs onderworpen aan specifieke en lokale RNAi. Als biologisch materiaal, gebruikten we Drosophila verbeelding vleugels schijven verkregen uit transgene larven onderworpen aan de lokale en specifieke gene silencing door middel van het GAL4/UAS systeem 1. Deze larven nageslacht orginates van een genetische kruising waarbij twee ouders lijnen: een uitvoering van de GAL4 bestuurder, de tweede de UAS responder. In aanvulling op GAL4 uit te drukken in een bepaalde temporele en / of ruimtelijke patroon, de bestuurder lijn draagt ​​een UAS-GFP reporter die het mogelijk maakt te visualiseren van de GAL4 uitdrukking domein. De UAS responder lijn uitdrukt, onder de controle van de UAS-sequentie, een hairpin zwijgen RNA (hpRNA) in staat om specifiek op de geselecteerde gen van belang (noem het gen X) 2. Eenmaal uitgedrukt in de cel, wordt het hpRNA X gesplitst in kleine interfererende RNA (siRNA) in staat om specifiek geluid van de geselecteerde gen te genereren. In het larvale nageslacht, dat draagt ​​zowel de bestuurder en responder transgenen, de UAS-silencing bouwen alleen is getranscribeerd in die cellen die de GAL4 eiwit, en is dus in staat om een ​​ruimtelijk beperkte zwijgen van de geselecteerde genen te induceren X. Onder de verscheidenheid van mogelijke toepassingen, passen we deze benadering van een geselecteerd gen van ons belang (gen X) onder de controle van de engrailed-GAL4 (nl) driver, welke specifieke zwijgen kan leiden in het achterste compartiment van de vleugel schijf 3 stilte , was het grondgebied waarvan gekenmerkt door de expressie van het UAS-GFP transgen. Het zwijgen verbeelding vleugel schijven werden met de hand ontleed, en zorg ervoor dat omliggende vervuilende weefsels, met name het vasthouden luchtpijpen te elimineren. Elke geïsoleerde vleugel schijf werd vervolgens snel en voorzichtig overgebracht naar een eerder behandeld, RNase vrij dissectie frame voor onmiddellijke laser microdissectie van de geselecteerde gebieden. Deel 2. Laser microdissectie van geselecteerde gebieden van het zwijgen (posterior) en unsilenced (anterior) compartimenten van de vleugel schijf. Nadat de vleugel disc is op het membraan, laser microdissectie van specifieke gebieden van zwijgen (posterior, GFP-label) en unsilenced (anterior, GFP-niet gemerkt) compartimenten werd bereikt. Dit werd uitgevoerd door het tekenen van een gebied dat makkelijk zou kunnen passen bij beide is de GFP-positieve en GFP-negatieve kanten van de schijf. Onder de microdissector, moeten we eerst gericht de laserstraal op het GFP-positieve weefsel, het maken van een snede langs de geselecteerde omtrek. De microdissector gaat door met het snijden op de geselecteerde snelheid en kracht, maar het is mogelijk om het snijden handmatig verfijnen, totdat het geselecteerde gebied van weefsel valt in de buis eronder. Deze buis bevat een kleine hoeveelheid van de TRI reagens, zodat de GFP-positieve weefsel is klaar voor de volgende RNA-extractie. We vervolgens verhuisde het snijden gebied aan de overkant, GFP-negatieve kant van de vleugel schijf, om een ​​gelijkwaardige grondgebied ontleden van de unsilenced, GFP-negatieve weefsel. Nogmaals, na de automatische knippen, we overgegaan tot het verfijnen van het snijden handmatig. Eens de snede werd gedaan, ook het GFP-negatieve weefsel werd teruggevonden in de TRI Reagens, klaar voor RNA-extractie. Deel 3. RNA-extractie en transcriptie Profilering van gemicrodissecteerde Tissue Areas. We gesponnen de buizen om de vloeistof los te maken van de dop en toegevoegd TRI Reagens tot 1 ml, vervolgens uitgevoerd RNA-extractie uit volgens het standaard TRI Reagens protocol. Voor het verzamelen van voldoende materiaal, herhaalden we het snijden procedure op 100 imaginaire vleugel schijven. Vanaf 100 gebieden van ongeveer 5000 um 2 per stuk, onze opbrengst van 1,5 ug van RNA. De nauwkeurigheid van de handleiding dissectie werd vervolgens gecontroleerd door het controleren van GFP expressie in de tot zwijgen gebracht en unsilenced monsters door RT-PCR, met behulp van Super Script III (Invitrogen) te synthetiseren cDNA met willekeurige hexameren. Latere kwantitatieve analyses gericht om de expressie niveaus van het zwijgen gen X bepalen, samen met die van de vermeende doelwitten van haar regelgevende pad, werden uitgevoerd door Real Time RT-PCR met behulp van Master Mix (Invitrogen).

<ol><li>Elliott, D. A., Brand, A. H. The GAL4 System A Versatile System for the Expression of Gene. Dahmann, C. , Humana Press Inc. Totowa, NJ. (2008).</li>
<li>Klein, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wing+disc+development+in+the+fly%3A+the+early+stages.+%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Genetics+%26+Development%22%5BJournal%5D)">Wing disc development in the fly: the early stages. </a> Current Opinion in Genetics & Development. 11, 470-475 (2001).</li>
<li>Dietzl, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genome-wide+transgenic+RNAi+library+for+conditional+gene+inactivation+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A genome-wide transgenic RNAi library for conditional gene inactivation in Drosophila.</a> Nature. 448, 151-U1-151-U1 (2007).</li>
<li>Martin, F. A., Morata, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Compartments+and+the+control+of+growth+in+the+Drosophila+wing+imaginal+disc%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Compartments and the control of growth in the Drosophila wing imaginal disc.</a> Development. 133, 4421-4426 (2006).</li>
<li>Tabata, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetics+of+morphogen+gradients%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">Genetics of morphogen gradients.</a> Nature Reviews Genetics. 2, 620-630 (2001).</li>
<li>Moreno, E. &amp, Basler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((dMyc+transforms+cells+into+super-competitors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">dMyc transforms cells into super-competitors.</a> Cell. 117, 117-129 (2004).</li>
</ol>

Met betrekking tot hun basale expressie niveau bereikt in het voorste / achterste compartimenten van unsilenced vleugel schijven, was de activiteit van de geselecteerde gen X gevonden verlaagd tot 40% na zwijgen op te leggen. In tegenstelling, was een van zijn vermeende doelen (genen Y) significant gevonden up-gereguleerd (7 voudige-toename), die ons tot de hypothese te bevestigen dat het negatief was geregeld door Gene X. We concluderen dat de hierboven beschreven experimentele benadering s...

Fly stammen Drosophila UAS-silencing lijnen kunnen worden verkregen bij VDRC RNAi collectie 2. Een verzameling van GAL4-driver lijnen is beschikbaar op de Bloomington Drosophila Stock Center (Indiana, USA). Uitrusting Benodigde apparatuur omvat Laser microdissector (Leica LMD6000), Coulter microfuge 22R (Beekman), PCR (BIO-RAD My Renner), Real Time PCR (BIO-RAD iQ5). Gereedschap Benodigde gereedschappen zijn onder andere: glas putten, borstel, microdissectie tang, opknoping druppel dia&#39;s, insect pinnen gemonteerd op spuit naalden, metalen frames met een PET-membraan, plastic buizen (50 ml, 05 ml, 0,25 ml).

laser microdissection toegepast op gen expressie profilering van de subset van cellen uit de drosophila wing disc

Laser Microdissection Applied to Gene Expression Profiling of Subset of Cells from the Drosophila Wing Disc

Heterogene karakter van de weefsels heeft zich bewezen als een beperkende factor zijn in de hoeveelheid informatie die kan worden gegenereerd op basis van biologische monsters, ten koste gaat stroomafwaarts analyses. Gezien de complexe en dynamische cellulaire verenigingen bestaande in vele weefsels, om de in-vivo-interacties diepgaande moleculaire analyse samenvatten men moet in staat zijn om specifieke celpopulaties te analyseren in hun oorspronkelijke context. Laser-gemedieerde microdissectie kan dit doel te bereiken, waardoor ondubbelzinnige identificatie en succesvolle oogst van cellen van belang in de directe microscopische visualisatie met behoud van moleculaire integriteit. We hebben paste deze technologie om de genexpressie te analyseren in bepaalde gebieden van de ontwikkeling van Drosophila vleugel schijf, die een voordelig modelsysteem om de groei controleren, celdifferentiatie en organogenese studie vertegenwoordigt. Larvale verbeelding schijven zijn vroegtijdig onderverdeeld in voorste en achterste, dorsale en ventrale compartimenten door afkomst beperking grenzen. Door gebruik te maken van het induceerbare GAL4-UAS binaire expressie systeem, elk van deze compartimenten kunnen specifiek worden geëtiketteerd in transgene vliegen hebben een UAS-GFP transgene onder de controle van de juiste GAL4-driver te construeren. In de transgene schijven, kan de genexpressie profilering van discrete subsets van cellen nauwkeurig kan worden bepaald na de laser-gemedieerde microdissection, met behulp van de TL-GFP signaal naar laser gesneden gids. Onder de variëteit van downstream-toepassingen, hebben we ons gericht op de RNA-transcript profilering na gelokaliseerde RNA-interferentie (RNAi). Met de komst van RNAi-technologie, kan de etikettering GFP gekoppeld worden met gelokaliseerde knockdown van een bepaald gen, het mogelijk maakt om de transcriptionele respons van een discrete celpopulatie aan de specifieke gen-silencing bepaald. Om deze aanpak te valideren, we ontleed gelijkwaardige gebieden van de schijf van de achterste (gelabeld door GFP expressie), en de voorste (ongelabelde) compartiment op het regionale zwijgen op te leggen in de P-compartiment van een alom anders uitgedrukt gen. RNA werd geëxtraheerd uit gemicrodissecteerde zwijgen opgelegd en unsilenced gebieden en vergelijkende gen expressie profilering bepaald door kwantitatieve real-time RT-PCR. We laten zien dat deze methode effectief kan worden toegepast voor nauwkeurige transcriptomics van subsets van cellen in het Drosophila imaginaire schijven. Sterker nog, terwijl de grote schijf voorbereiding als bron van RNA over het algemeen veronderstelt cel homogeniteit, is het algemeen bekend dat transcriptionele expressie sterk kan variëren binnen deze structuren ten gevolge van positionele informatie. Met behulp van gelokaliseerde fluorescerende GFP signaal naar laser gesneden gids, kunnen meer accurate transcriptie analyses worden uitgevoerd en winstgevend toegepast op uiteenlopende toepassingen, waaronder transcript profilering van verschillende cellijnen in hun oorspronkelijke context.

Laser microdissection werd toegepast op de gen expressie profilering te analyseren in specifieke compartimenten van Drosophila vleugel schijf onderworpen aan een gelokaliseerde RNAi<em&gt; In vivo</em&gt;. RNA geëxtraheerd uit gelijkwaardige gebieden van zwijgen en unsilenced compartimenten werd geanalyseerd door kwantitatieve RT-PCR vergelijkende gen expressie profilering vast te stellen in het kader van inheemse weefsel microecology.

Laser Microdissection Toegepast op gen expressie profilering van de subset van cellen uit de Drosophila Wing Disc

De heterogene aard van weefsels is een beperkende factor gebleken voor de hoeveelheid informatie die uit biologische monsters kan worden gegenereerd, ...

Hierin geven wij een grondige beschrijving van laser-microdissectie die is toegepast om een vergelijkende RNA-transcriptprofilering uit te voeren van gesilenced en niet-gesilenced gebieden van de vleugelschijf van drosophila. Deze aanpak vereist als biologisch materiaal handmatig gedissecteerde drosophila-imaginale schijven en als hoofdapparatuur een laser-microdissector. Wij maken gebruik van de LI A-L-L-M-D 6, 000 en een real-time PCR-apparaat.We hebben een BioRad iq gebruikt. De vijf benodigde kleine instrumenten zijn een concave plaat, een klein schilderspenseel, microdissectie-pincetten, een objectglas voor hangende druppels en insectenpinnen, gemonteerd op spuitnaalden, een metalen frame met PET-membraan en kleine plastic buisjes. Deze methode omvat de volgende stappen.Stap één: het kruisen van twee geschikte oph-transgene lijnen om een lokale en specifieke gen-silencing in het nageslacht te triggeren met behulp van het GAL4-UAS-systeem. Stap twee: het behandelen van de dissectiekaders. Stap drie: het instellen van de laser-microdissector.Stap vier: het handmatig verzamelen van de vleugel-imaginale schijven uit het larvale nageslacht van de genetische kruising. Stap vijf: het

laser-microdissection-applied-to-gene-expression-profiling-subset

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

In deze video-artikel stellen we een methode voor het isoleren van een of...

Laser capture microdissectie van Drosophila Perifere neuronen

De volwassen structuren van Drosophila zijn afgeleid van zak-achtige structuren die imaginale schijven worden genoemd. Analyse van deze schijven biedt inzicht in vele ontwikkelingsprocessen, waaronder weefselbepaling, oprichting van compartimentgrenzen, celproliferatie, celbestemmingsspecificatie en cellulaire planaire polariteit. Dit protocol wordt gebruikt om imaginale schijven voor te bereiden op licht-/fluorescentiemicroscopie.

Dissectie en Immunokleuring van Imaginal schijven uit Drosophila melanogaster

Hier presenteren we een protocol voor laser-geassisteerde microdissectie van specifieke plantencellen voor transcriptioneel profileren. Hoewel het protocol geschikt is voor verschillende soorten en celtypen, is de focus op zeer ontoegankelijke cellen van de vrouwelijke kiemlijn die belangrijk zijn voor seksuele en apomictische reproductie in het kruisbloemigengeslacht Boechera.

Laser-assisted Microdissection (LAM) als een tool voor Transcriptionele Profiling van individuele cel Types

Dit protocol laat zien hoe fluorescent gemerkt, genetisch bepaald klonale tumoren in de Drosophila oog / antennaal verbeelding schijven (EAD) te genereren. Het beschrijft hoe de EAD en de hersenen ontleden van de derde instar larven en hoe ze te verwerken te visualiseren en te kwantificeren genexpressie veranderingen en tumor invasiviteit.

De<em&gt; Drosophila</em&gt; Imaginal Disc Tumor Model: visualisatie en kwantificering van genexpressie en Tumor Invasiviteit met behulp van genetische Mozaïeken

Veel ontwikkelingsbelangrijke genen hebben cel- of weefselspecifieke expressiepatronen. Dit artikel beschrijft LM RNA-seq experimenten om genen te identificeren die differentieel tot expressie worden gebracht op de grens tussen het blad en de schede van maïs en in lg1-R mutanten in vergelijking met het wildtype. De experimentele overwegingen die hier worden besproken, zijn van toepassing op transcriptomische analyses van andere ontwikkelingsverschijnselen.

Experimental Design for Laser Microdissection RNA-Seq: Lessen uit een analyse van maïs Leaf Development

De mogelijkheid om nauwkeurig detecteren afschriften of eiwitten in Drosophila weefsels is essentieel voor de studie van hun overvloed en localisatie gerelateerde aan het ontwikkelingsproces. Hier is de beschrijving van een eenvoudige procedure om te ontleden pop vleugels. Deze vleugels kunnen worden gebruikt als de monsters in verschillende technieken (PCR assay, immunohistochemistry, enz.).

Een snelle en doeltreffende methode om te ontleden pop vleugels van Drosophila geschikt voor Immunodetections of PCR-testen

Dit protocol beschrijft de laser Capture micro dissectie voor de isolatie van kraakbeen en bot uit verse bevroren delen van de muis embryo. Kraakbeen en botten kunnen snel worden gevisualiseerd door Cresylacetaat-Violet kleuring en precies worden verzameld om RNA van hoge kwaliteit te leveren voor transcriptomische analyse.

Laser Capture Microdissectie van de muis embryonale kraakbeen en bot voor genexpressie analyse

De timing van blootstelling aan liganden kan invloed hebben op hun ontwikkelings gevolgen. Hier laten we zien hoe het beeld vrijkomen van een Drosophila bot morfogenetische eiwit (BMP) genaamd DPP uit cellen van de vleugel schijf.

Imaging DPP-release van een Drosophila -vleugel schijf

Er wordt een protocol beschreven dat lasermicrodissectie gebruikt om individuele nematodenweefsels te isoleren voor RNA-sequencing. Het protocol vereist geen soortspecifieke genetische toolkits, waardoor genexpressieprofielen kunnen worden vergeleken tussen verschillende soorten op het niveau van single-tissue monsters.

Laser microdissectie voor species-agnostische single-tissue toepassingen

We beschrijven een protocol voor het meten van contacten tussen cellen in aangrenzende epitheellagen in levende imaginaire schijven van de Drosophila-vleugel met behulp van een op GFP-reconstitutie gebaseerde benadering.

Een op GFP-complementatie gebaseerd systeem met dubbele expressie voor het beoordelen van cel-celcontact gemedieerd door cytonemen in levende imaginaire schijven van de Drosophila-vleugel

Dit artikel beschrijft een efficiënt protocol voor beeldende schijfdissectie en antistofkleuring dat zuinig is met reagentia en het hanteren van imaginale schijven in kleine aantallen vergemakkelijkt.

Kleinschalige dissectie en antilichaamkleuring van oog-antenne en vleugelbeeldschijven van Drosophila melanogaster

Leer laser microdissectie voor genexpressieprofilering in Drosophila vleugelschijven. Deze methode combineert RNA-interferentie met qRT-PCR om genregulatie in specifieke weefselcompartimenten te analyseren.

Laser Microdissection Toegepast op gen expressie profilering van de subset van cellen uit de Drosophila Wing Disc

Meer video's verkennen