Laser Microdissection Toegepast op gen expressie profilering van de subset van cellen uit de Drosophila Wing Disc
April 30th, 2010
Laser microdissection werd toegepast op de gen expressie profilering te analyseren in specifieke compartimenten van Drosophila vleugel schijf onderworpen aan een gelokaliseerde RNAi In vivo. RNA geëxtraheerd uit gelijkwaardige gebieden van zwijgen en unsilenced compartimenten werd geanalyseerd door kwantitatieve RT-PCR vergelijkende gen expressie profilering vast te stellen in het kader van inheemse weefsel microecology.
Hier bieden we een grondige beschrijving van laser microdissectie toegepast om A te bereiken vergeleken RNA transcript profilering van gesilencede en niet-gesilencede gebieden van de drosophila vleugelschijf. Deze aanpak vereist als biologisch materiaal, handmatig gedissekteerde drosophila beeldschijven als hoofdapparatuur, een laser micro dissector. We gebruiken de LI A-L-L-M-D 6.000 en een real time PCR machine.
We gebruikten een BioRad iq. Vijf kleine gereedschappen die nodig zijn, zijn een concave plaat, een kleine verfkwast microdissectietang, een hangende druppelschuif, insectenpins, gemonteerd op spuitnaalden, een metalen frame met een petmembraan, kleine plastic buisjes. Deze methode omvat de volgende stappen.
Stap één om twee geschikte oph transgene lijnen te kruisen om een lokale en specifieke gensilencing te activeren in de nakomelingen, gebruik makend van het GAL vier UAS systeem. Stap twee, om de dissectieframes te behandelen. Stap drie, om de laser micro dissector op te zetten.
Stap vier, om handmatig de vleugel imaginaire schijven te verzamelen uit de larvale nakomelingen van de genetische kruising. Stap vijf, om laser microdissectie van specifieke gebieden van de GFP gelabelde imaginaire schijven uit te voeren. Stap zes, transcriptie profilering van equivalente gebieden van gesilencede en niet-gesilencede regio's van de schijf zal het mogelijk maken om de effecten te vaststellen die worden veroorzaakt door het silencen van uw gen van belang.
Noem het gen X in vivo transcriptie profilering zal het extractie van RNA uit de micro gedissekteerde gebieden vereisen, controle van de nauwkeurigheid van de handmatige dissectie, evaluatie van GFP expressie in de twee monsters door R-T-P-C-R, kwantificering van de expressie van putatieve. Doelwitten van het stilzwijgende gen in de twee monsters door real time R-T-P-C-R of door het uitvoeren van een microarray analyse. Nu meer details over elke stap.
De eerste stap, de genetische kruising. De genetische kruising omvat GAL vier UAS transgene stammen en is gericht op het verkrijgen van gesilenceerde imaginaire schijven in de larvale nakomelingen. Het veelzijdige GAL vier systeem stelt u in staat om specifiek en gelokaliseerd gensilencing te activeren door RNA interferentie.
Een stam introduceert in de kruising het driver transgen dat GAL vier in een specifiek tijds- of ruimtelijk patroon tot expressie brengt. En een A-U-A-S-G-F-P reporter die de visualisatie van het GAL vier expressiedomein mogelijk maakt. De tweede stam introduceert een UAS responder transgen dat hairpin silencing RNA tot expressie brengt, in staat om gen X specifiek te targeten zodra het in de cel tot expressie wordt gebracht.
Dit RNA wordt gekliefd om kleine interfererende RNA te genereren, die in staat is om het geselecteerde gen X specifiek te silencen in de nakomelingen van deze kruising. Het UAS silencing transgen wordt alleen getranscribeerd in die cellen die het GAL vier eiwit tot expressie brengen, waardoor een ruimtelijk beperkte silencing van het X gen wordt geïnduceerd. Onder de verscheidenheid aan toepassingen, concentreerden we ons op RNA transcript profilering in vleugelschijf gesilenced door de Grailed GAL vier driver, die specifieke silencing in het achterste compartiment richt.
Het stiltegebied wordt gemarkeerd door de expressie van het U-A-S-G-F-P transgen. In het achterste compartiment. Twee gebeurtenissen zullen worden geactiveerd: expressie van GGFP en silencing van gen x.
Stap twee, behandeling van de dissectieframes om de RNA activiteit te remmen. Was de frameschijven en dissectiegereedschappen met DEPC water gedurende ten minste een uur bij kamertemperatuur en laat ze drogen in een steriele kamer. Om de RNA activiteit te remmen, gebruik een gloednieuwe 50 ml buis die al RNA-vrij is, gevuld met DEPC water met een pincet in de buis, een hangende druppelschuif en een petframe.
Beide nodig voor de microdissectie. Sluit de buis, Draai hem ondersteboven en laat hem minimaal een uur reageren. Bij kamertemperatuur, Een uur later, verplaats het DEPC water naar een andere buis met het pincet.
Houd de schotten Binnen in de buis zodat ze niet vallen. Laat vervolgens de schotten in de buis drogen. Stap drie, microdissectie setup.
Eerst, zet alle apparaten aan Nodig, de fluorescentielamp, de microscoop en de software voor de microdissectie. Een waarschuwingsvenster herinnert u eraan ook de laser aan te zetten. Doe het en laat de laser opwarmen terwijl je de microdissectie setup voltooit.
Nu is het tijd om de putjes voor te bereiden Waarin het weefsel wordt verzameld.Snijden. De Leica LMD 6.000 laser snijapparatuur maakt het mogelijk om maximaal vier buizen te laden om verschillende monsters te verzamelen. Voor ons doel hebben we slechts twee buizen nodig.
Een, om het GFP positieve stilteweefsel te verzamelen, de andere om GFP negatief ongekleurd weefsel te verzamelen Met een micro pec. Vul beide buisdoppen met 20 microliters tri reagent oplossing om de RNA te bewaren. Nu is de microdissectie klaar voor gebruik Stap vier, handmatige dissectie van vleugelbeeldschijven uit joof larven.
Isoleer vleugelschijfjes van de larvale nakomelingen verkregen zoals eerder beschreven, en zorg ervoor dat andere weefsels de schijven niet besmetten Om dit doel te bereiken, is de dissectiebenadering vrij anders dan die gewoonlijk wordt gebruikt om de bulk van alle originele schijven te verzamelen. Eerst, was de larve in ringer's oplossing om aanhangend medium te verwijderen. Breng het vervolgens over in een hangende druppelschuif en snij het hoofd af door de mond naar beneden te trekken.
Gebruik nu de insectenpins om voorzichtig andere weefsels weg te snijden. De rode omtrek toont de imaginaire vleugelschijfjes die moeten worden verzameld. Houd de schijven snel en voorzichtig vrij van het aanhangende weefsel Overbreng elk geïsoleerd vleugelschijfje naar een dissectieframe voor onmiddellijke snede.
Deze procedure moet worden herhaald totdat het totale aantal van honderd vleugelschijfjes is bereikt. Stap vijf, laser microdissectie van specifieke gebieden van GFP gelabelde vleugelschijfjes. Zodra
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Overzicht
Deze studie demonstreert de toepassing van laser microdissectie om genexpressieprofilering in specifieke compartimenten van de Drosophila vleugelschijf te analyseren. Door verstilde en niet-verstilde gebieden te vergelijken, biedt het onderzoek inzichten in genexpressie binnen de context van de micro-ecologie van natieve weefsels.
Belangrijkste onderdelen van het onderzoek
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschappen
- Genexpressie
- Ontwikkelingsbiologie
Achtergrond
- Laser microdissectie maakt een nauwkeurige analyse van specifieke weefselgebieden mogelijk.
- Drosophila vleugelschijven dienen als model voor het bestuderen van genexpressie.
- RNA interferentie (RNAi) wordt gebruikt om genexpressie in gerichte compartimenten te dempen.
- Kwantitatieve RT-PCR wordt gebruikt om genexpressieniveaus te beoordelen.
Doel van het onderzoek
- Om de effecten van gelokaliseerde RNAi op genexpressie in Drosophila vleugelschijven te onderzoeken.
- Om genexpressieprofielen te vergelijken tussen verstilde en niet-verstilde compartimenten.
- Om het begrip van weefsel-micro-ecologie in ontwikkelingsprocessen te verbeteren.
Gebruikte methoden
- Laser microdissectie van Drosophila vleugelschijven.
- RNA-extractie uit gedissekteerde weefselmonsters.
- Kwantitatieve RT-PCR voor genexpressieanalyse.
- Vergelijking van genexpressieprofielen tussen compartimenten.
Belangrijkste resultaten
- Identificatie van differentiële genexpressie in verstilde versus niet-verstilde gebieden.
- Inzichten in de rol van specifieke genen in de ontwikkeling van de vleugelschijf.
- Demonstratie van de effectiviteit van laser microdissectie in genprofilering.
- Bijdrage aan het begrip van weefselspecifieke genregulatie.
Conclusies
- Laser microdissectie is een waardevol hulpmiddel voor het bestuderen van genexpressie in specifieke weefselregio's.
- Gelokaliseerde RNAi kan effectief genexpressieprofielen in Drosophila veranderen.
- De bevindingen vergroten de kennis van genregulatie in de ontwikkelingsbiologie.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Laser microdissection combined with compartment-specific gene silencing enables precise transcriptomic profiling of defined cell populations within heterogeneous tissues. This approach addresses the challenge of cellular heterogeneity in discovery-stage gene expression studies, supporting mechanistic de-risking and target validation in complex biological systems. The method enhances predictive confidence for early-stage portfolio decisions by enabling accurate measurement of transcriptional responses in native tissue contexts.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of gene function and regulatory pathways in spatially defined cell populations.
- Supports biological de-risking by isolating transcriptional effects of gene silencing within native compartments.
- Facilitates functional target validation through direct measurement of downstream gene expression changes.
- Improves predictive confidence for advancing targets with context-dependent activity.
Screening & Assay Development
- Prepares validated, compartment-specific biological samples for downstream transcriptomic analysis.
- Standardizes sample collection and RNA extraction from defined tissue regions, enhancing reproducibility.
- Enables quantitative RT-PCR and microarray readouts for robust assay development.
- Supports reliable evaluation of gene knockdown effects in screening workflows.
Translational & Preclinical Research
- Aligns gene expression profiling with disease-relevant tissue architecture in model systems.
- Provides continuity from discovery through preclinical validation by enabling localized transcriptomic analysis.
- De-risks translational advancement by confirming target engagement in physiologically relevant compartments.
- Supports biomarker identification within specific cell lineages when justified by the model system.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates into the discovery-to-preclinical continuum by enabling hypothesis-driven gene function studies in defined tissue compartments, supporting lead identification and mechanistic validation.
- Discovery Biology: Facilitates hypothesis testing and pathway clarification by isolating transcriptional responses to gene silencing.
- Screening: Provides reproducible, quantitative gene expression outputs for assay readiness and compound evaluation.
- Analytics: Delivers compartment-specific RT-PCR and microarray data for comparative analysis of silenced versus control regions.
- Translational Research: Connects discovery findings to preclinical models by maintaining native tissue context in gene expression studies.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable workflow for transcriptomic profiling across diverse genetic perturbations and tissue types.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target validation.
- Operational Value: Standardizes sample preparation and enhances reproducibility of transcriptomic analyses.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions and improves capital efficiency by clarifying context-dependent gene function.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of targets with validated compartment-specific activity.
Implementation Considerations
- Requires expertise in genetic model systems and laser microdissection instrumentation.
- Demands access to fluorescence-guided microdissection platforms and quantitative RT-PCR infrastructure.
- Necessitates rigorous cross-team standardization of sample handling and RNA extraction protocols.
- May require adaptation for different tissue types or model organisms based on compartmentalization and marker availability.
- Sample yield and RNA integrity are critical limitations that must be managed during collection and processing.
