Name: Bacteriële Gene Expression analyse met behulp van Microarrays (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-05-28T00:00:00.000+00:00
Duration: 29 min 41 s
Description: Leer bacteriële genexpressieanalyse met microarrays via indirecte labeling met Cy3- en Cy5-fluorescentie. Deze methode vergelijkt wildtype- en mutantstalen betrouwbaar zonder kleurvoorkeur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Reverse transcriptase reactie Draai verwarming blok naar 70-80 ° C en 42 ° C. Waterbaden kan ook gebruikt worden in deze stap. Bij gebruik van verwarmings-blokken, dus zet wat water dat de warmte uniform is. <ol><li> Priming reactie <ol><li> Neem 3 pg RNA </li><li> Volume aan te passen tot en met 13 ul met RNase vrij water </li><li> Voeg 2,5 ul van willekeurige hexameer primers (2mg/mL) </li></ol></li><li> Meng goed en incuberen bij 70-80 ° C gedurende 8 minuten. Dan, plaats op ijs gedurende 5 minuten. </li><li> Bereid RT cocktail (14,5 ul / rxn): <table border="0"><tbody><tr><td> Bestanddeel </td><td> Volume </td></tr><tr><td> 5X Eerste Strand buffer </td><td> 6 pl </td></tr><tr><td> 0,1 M DTT </td><td> 3 pl </td></tr><tr><td> 25X aminoallyl-dNTP mix </td><td> 1,2 pl </td></tr><tr><td> Superscript II RT (200U/μl) </td><td> 2,3 pl </td></tr><tr><td> Water </td><td> 2,0 pl </td></tr></tbody></table> * Voor n reacties, voor te bereiden Master Mix voor n +0.5 fracties van de cocktail te verzekeren dat u niet zal opraken. </li><li> Voeg 14,5 ul aan gekoelde reacties. </li><li> Mix (niet vortex) en incubeer bij 42 ° C gedurende 3-4 uur </li><li> Monsters kunnen worden opgeslagen bij -20 ° C indien nodig. </li></ol> Hydrolyseren RNA <ol><li> Aan elk monster, voeg 3 pl van 1 N NaOH en 0,6 pi 0,5 M EDTA. (Final conc.s = 100mm NaOH, 10mm EDTA) </li><li> Mix en incubeer bij 65 ° C gedurende 10 minuten. </li><li> Neutraliseren door het toevoegen van 33,6 ul 1 M HEPES, pH = 7,0 (laatste conc .= 500mm HEPES) </li><li> Monsters kunnen worden opgeslagen bij -20 ° C, indien nodig. </li></ol> Reactie Zuivering: Verwijderen van zonder rechtspersoonlijkheid aa-dUTP en vrije aminen Opmerking: Deze zuivering protocol is gewijzigd ten opzichte van de Qiagen QIAquick PCRpurification kit protocol. Het fosfaat wassen en elutiebuffers zijn vervangen door de meegeleverde Qiagen buffers omdat de Qiagen buffers bevatten vrij amines die concurreren met de Cy kleurstof koppelingsreactie. De kolommen van de mini-prep-kit kan ook gebruikt worden. <ol><li> Meng cDNA reactie met 300 ul (of 5x reactie volume = 336 ul) buffer PB (Qiagen meegeleverd) en over te dragen aan QIAquick kolom. </li><li> Plaats de kolom in een 2 ml collectie buis (Qiagen meegeleverd) en centrifugeer bij ~ 13000 rpm gedurende 1 minuut. Lege verzameling buis. </li><li> Om zich te wassen, voeg 750 ul fosfaat-wasbuffer (niet Qiagen&#39;s) naar de kolom en centrifugeer bij ~ 13000 rpm gedurende 1 minuut. </li><li> Leeg de verzamelbuis en herhaal de 750 ul wassen en centrifugeren stap. </li><li> Leeg de collectie buis en centrifugeer de kolom een ​​extra 1 minuut bij maximale snelheid. </li><li> Transfer kolom naar een nieuwe 1,5 mL microfugebuisje en voorzichtig 30 pl fosfaat elutiebuffer. (Zie oplossing voorbereiding sectie) </li><li> Incubeer gedurende 1 minuut bij kamertemperatuur. </li><li> Elueer door centrifugeren bij ~ 13.000 rpm gedurende 1 minuut. </li><li> Elueren een tweede keer (met een andere 30 ul van fosfaat elutiebuffer) in dezelfde buis door het herhalen van de stappen 6-8. Het uiteindelijke elutievolume moet ~ 60 ul worden. </li><li> De hoeveelheid cDNA kunnen worden gekwantificeerd in deze fase: ng cDNA = (verdunningsfactor) (OD260) (37) (totaal volume geëlueerd uit kolom) </li><li> Monster in een Speed ​​Vac bij 45 ° C. </li><li> Monsters kunnen worden opgeslagen bij -20 ° C indien nodig. </li></ol> Koppeling aa-cDNA te Dye Ester Cy <ol><li> Resuspendeer aminoallyl-gelabeld cDNA met 10 ul 50 mM Na-bicarbonaat, pH = 9,0 indien nodig. (Deze buffer moet worden vers gemaakt om de twee weken) </li><li> Werken in een donkere plaats, voeg de sonde aan een buis van de juiste Cy kleurstof. Pipet op en neer meerdere malen op de kleurstof mengen. </li><li> Incubeer de reactie gedurende 1 uur in het donker bij kamertemperatuur. (Incubatie kan oplopen tot twee uur) </li></ol> Reactie Zuivering II: Verwijdering van afgekoppelde kleurstof <ol><li> Aan het reactiemengsel toe te voegen 35 pl 100 mM NaOAc pH 5,2. Meng goed. </li><li> Voeg 250 ul (of 5x reactie volume = 225 pl) Buffer PB (Qiagen meegeleverd) aan elk monster en meng door en neer te pipetteren. </li><li> Plaats een QIAquick spin-kolom in een 2 ml collectie buis (Qiagen meegeleverd), past u het monster op de kolom en centrifugeer bij ~ 13.000 gedurende 1 minuut. Lege verzameling buis. </li><li> Om zich te wassen, voeg 0,75 ml Buffer PE (Qiagen bijgeleverd) om de kolom en centrifugeer bij ~ 13.000 gedurende 1 minuut. </li><li> Herhaal stap 4. </li><li> Lege verzameling buis en centrifugeer kolom voor een extra 1 minuut bij maximale snelheid. </li><li> Plaats kolom in een schoon 1,5 ml microfugebuisje en voorzichtig 30 ul buffer EB (Qiagen bijgeleverd) aan op het midden van de kolom membraan. </li><li> Incubeer gedurende 1 minuut bij kamertemperatuur. </li><li> Elueer door centrifugeren bij ~ 13.000 rpm gedurende 1 minuut. </li><li> Elueren een tweede keer in dezelfde buis door het herhalen vanstappen 7-9. De laatste geëlueerd volume moet ~ 60 ul worden. </li></ol> Analyse van de labeling reactie De hoeveelheid cDNA en label gekwantificeerd kan worden in deze fase: <ul><li> Meten OD 260, 550 en 650 (Blank is water.) Gebruik nanodrop microarray-programma. </li><li> Bereken de pmol van kleurstoffen oprichting en pmol DNA en nuc / dye-verhouding met de gegeven vergelijkingen hieronder: pmol nucleotiden = [OD260 * volume (pi) * 37 ng / ul * 1000 pg / ng] / 324,5 pg / pmol </li></ul> Let op: 1 OD260 = 37 ng / ul voor cDNA; 324,5 pg / pmol gemiddeld moleculair gewicht van een dNTP) pmol Cy3 = OD550 * volume (pi) / 0,15 pmol Cy5 = OD650 * volume (pi) / 0,25 nucleotiden / dye ratio = pmol cDNA / pmol Cy dye Als u gebruik maakt nanodrop, het geeft al pmol / ul voor elke kleurstof. U hoeft alleen dit aantal vermenigvuldigen met het volume van de totale pmol kleurstof incorporatie te krijgen. Let op:&gt; 150 tot 200 pmol van de kleurstof oprichting per monster en een verhouding van minder dan 20 nucleotiden / kleurstofmoleculen is optimaal voor kruisingen. <ul><li> Monsters kunnen worden bewaard bij -20 ° C bij donker. <ul><li> Combineer probes worden gehybridiseerd samen en droog in speedvac bij 42 ° C. </li><li> Monsters kunnen worden opgeslagen bij -20 ° C tot klaar te hyb. </li></ul></li></ul> Pre-hyb slides <ol><li> Plaats glijden naar beneden dan RT 100 ml water in een schone rode glijbaan houder gedurende 3-5 minuten </li><li> Snap droog de foto door het plaatsen van het gezicht op een 100 ° C verwarmen blok voor een paar seconden - horloge voor de condensatie te verdwijnen </li><li> UV cross-link de foto op 250 mJoules (Voer 2500 tot de UV-crosslinker) </li><li> Hydrate dia&#39;s door dompelen in voorverwarmde 42 ° C water. Spin 5 min op 700 RPM bij RT. </li><li> Broed dia&#39;s in 50 ml Coplin pot met voorverwarmde pre-hyb (5XSSC, 1% BSA, 0,1% SDS) voor ten minste 45 minuten @ 42 ° C, en incubatie kan langer gaan indien nodig. 50 ml pre-hyb buffer: 12,5 ml 20x SSC, 10 ml 5% BSA, 0,5 ml 10% SDS, 27 ml water </li><li> Dipslides in voorverwarmde water (42 ° C) en schud een paar minuten voor pre-hyb buffer te verwijderen. </li><li> Spoel in isopropanol en spin 5 min bij 700 rpm, kamertemperatuur, om te drogen. </li></ol> Voorbereiding van de monsters voor hybridisatie <ol><li> Resuspendeer sonde in het water (volumes worden hieronder gegeven) <table border="0"><tbody><tr><td> Voor de totale vol. = 30μl </td><td> Voor de totale vol. = 35μl </td><td> Voor de totale vol .= 40μl </td><td></td></tr><tr><td> 19,8 ul water </td><td> 23.55 ul water </td><td> 27,2 ul water </td><td> </td></tr><tr><td> 1,5 pl </td><td> 1,5 pl </td><td> 1,5 pl </td><td> 10 mg / ml zalmsperma DNA (Invitrogen) </td></tr><tr><td> 1,2 pl </td><td> 1,2 pl </td><td> 1,2 pl </td><td> 12,5 mg / ml tRNA </td></tr><tr><td> 4,5 pl </td><td> 5,25 ul </td><td> 6 pl </td><td> 20XSSC (3X definitief) </td></tr><tr><td> 3 pl </td><td> 3,5 pl </td><td> 4 pl </td><td> 1% SDS </td></tr></tbody></table> Opmerking: De volgorde van toevoeging van de reagentia zijn belangrijk. Niet voor te bereiden master mix. </li><li> Kook gedurende 5 minuten, dan draaien 5 minuten bij 14.000 rpm. Cool gedurende 2 minuten bij kamertemperatuur. </li></ol> Hybridisatie <ol><li> Voeg 10 tot 12 pl 3x SSC aan de putjes van de hybridisatie kamer op elke rand en in het midden. </li><li> Voeg een schone lifter slip naar het gewenste gebied van de dia en voorzichtig belasting in hybridisatie-oplossing (30 -40 pl). Er moet een extra monster op de randen van het dekglas worden. </li><li> Plaats de dia in de kamer. &#39;S nachts draai de schroeven en plaats in een 65 ° C waterbad. Niet direct plaatsen van de kamer op de bodem van het water bad. Plaats een blok op de top van de bovenste kamer om alles op zijn plaats. Houd het deksel op het waterbad om de lichtgevoelige monsters te beschermen. </li></ol> Hyb Wast <ol><li> Bereid de volgende buffers: <ul><li> 1X SSC, 0,05% SDS </li><li> 0.06 X SSC </li></ul></li><li> Na de incubatie ontsluiten hybridisatie kamer. Haal de dia uit de kamer, zorg ervoor dat u het dekglaasje verstoren. </li><li> Om dekglaasjes verwijderen, onderdompelen dia&#39;s in een schotel met warm 1X SSC, 0,05% SDS wasbuffer dekglaasje met uitzicht op de bodem van de schaal. Het dekglaasje wordt af te vallen door het bewegen van de schuif van links naar rechts. </li><li> Nadat het dekglaasje is verwijderd, plaatst u de dia in een rack een vers bad met warm 1XSSCm 0,05% SDS. Agiteren voor een paar minuten </li><li> Overdracht dia&#39;s plus rek aan een bad van 0,06 X SSC. </li><li> Overdragen naar een andere dia bae van 0,06 X SSC met een frisse rek, blotting de dia op een papieren handdoek om zoveel SDS-bevattende buffer als mogelijk te verwijderen alvorens deze in het frisse bad. </li><li> Agiteren dia&#39;s voor een paar minuten. </li><li> Spin onmiddellijk bij kamertemperatuur gedurende 5 min @ 700 rpm, dan dia&#39;s zijn klaar om te scannen. Bewaren in het donker tot gescand. </li></ol>

<ol><li>Hasseman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TIGR+Aminoallyl+Labeling+of+RNA+for%5BTitle%5D)+AND+%22Microarrays+%26+TIGR+Microarray+Labeled+Probe+Hybridization%22%5BJournal%5D)">TIGR Aminoallyl Labeling of RNA for.</a> Microarrays & TIGR Microarray Labeled Probe Hybridization. , Forthcoming.</li>
<li>Gilbert,, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TIGR+Microbial+RNA+Aminoallyl+Labeling+for+Microarrays+%26+Hybridization+of+probed+labels%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">TIGR Microbial RNA Aminoallyl Labeling for Microarrays & Hybridization of probed labels.</a> , Forthcoming.</li>
<li>Hedge,, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+concise+guide+to+cDNA+Microarray+analysis-II%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">A concise guide to cDNA Microarray analysis-II.</a> , Forthcoming.</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>AA-dUTP</td><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A0410</td><td>5-(3-aminoallyl)-2&amp;rsquo;deoxyuridine-5&amp;rsquo;-triphosphate</td></tr><tr><td>dNTP</td><td></td><td>Amersham</td><td>27-2035-01</td><td>100 mM dNTP-set PCR-grade</td></tr><tr><td>Random Hexamer primers</td><td></td><td>Amersham</td><td>27-2166-01</td><td>3mg/mL</td></tr><tr><td>SuperScript III RT</td><td></td><td>Invitrogen</td><td>80800444</td><td>200U/&amp;#x03BC;L</td></tr><tr><td>CyDye&amp;#8482;</td><td></td><td>Amersham</td><td>RPN5661</td><td>Post-Labelling Reactive Dye Pack</td></tr><tr><td>QIAquick</td><td></td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td>PCR-zuiveringskit</td></tr><tr><td>1 M K2HPO4</td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1 M KH2PO4</td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1 M KPO4</td><td>Buffer</td><td></td><td></td><td>Om een 1M fosfaatbuffer (KPO4, pH 8.5-8.7) te maken, combineer: 9.5 mL 1M K2HPO4 en 0.5 ml 1M KH2PO4</td></tr><tr><td>Fosfaat-wasbuffer</td><td>Buffer</td><td></td><td></td><td>Voor 100 mL fosfaat-wasbuffer (5 mM KPO4, pH 8.0, 80% EtOH) meng: 0.5 ml 1 M KPO4 pH 8.5 + 15.25 mL MilliQ-water + 84.25 mL 95% ethanol. De wasbuffer zal licht troebel zijn.** BELANGRIJK: Fosfaat-wasbuffer moet dagelijks worden bereid.</td></tr><tr><td>Fosfaat-elutiebuffer</td><td>Buffer</td><td></td><td></td><td>Verdun 1 M KPO4, pH 8.5 tot 4 mM met steriel water</td></tr><tr><td>Natriumcarbonaatbuffer</td><td></td><td></td><td></td><td>(Na2CO3): 0.5M, pH 9.0. Los 4.2 g NaHCO3 op in 80 mL steriel water en stel de pH in op 9.0 met 10 N NaOH; vul het volume aan tot 100 mL met steriel water. Om een 50 mM oplossing te maken voor de kleurstofkoppelingreactie, verdun deze 1:10 met water. Opmerking: De samenstelling van de carbonaatbuffer verandert na verloop van tijd; maak deze elke paar weken tot een maand opnieuw.</td></tr></tbody></table>

bacteriële gene expression analyse met behulp van microarrays

Bacterial Gene Expression Analysis Using Microarrays

Bacteriële Gene Expression analyse met behulp van Microarrays

Hallo, mijn naam is Ena en wij voeren in het laboratorium routinematig genexpressieprofilering uit. We gebruiken deze techniek om differentieel gereguleerde genen tussen meth en wildtype te monitoren. Vandaag heb ik RNA-monsters van wildtype en meth en we beginnen allemaal met cDNA-synthese.Wij maken gebruik van indirecte labelingsmethoden en het voordeel van deze techniek is dat oogbias, die bij directe labeling kan optreden, wordt voorkomen. Hiervoor gebruiken we RNA-monsters waarbij we streven naar 3 µg RNA in een totaalvolume van 13 µL. Vervolgens voegen we 2,5 µg random hexameren toe aan onze monsters.Vervolgens incuberen we het monster bij 75 °C gedurende acht minuten om de RNA-structuur te denatureren. Nu voegen we de reverse transcriptie-cocktail toe, die bestaat uit AM L-D-L-D-U-T-P continu mix, reverse transcriptase-buffer en ook ET TT. We centrifugeren het kort en incuberen het monster vier uur lang bij 42 °C. Na vier uur halen we de monsters eruit.In de buis bevindt zich nu een mengsel van cDNA en RNA. We gaan nu het RNA hydrolyseren door natriumhydroxide en EDTA toe te voegen, waarbij de eindconcentratie voor natriumhydroxide 100 mM moet zijn. De eindconcentratie voor

bacterial-gene-expression-analysis-using-microarrays

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

We presenteren een methode voor het genereren van cDNA van milieu-mRNA. In het algemeen, totaal RNA eerste is verzameld uit de omgeving, is rRNA selectief verwijderd, mRNA wordt selectief versterkt, en cDNA gesynthetiseerd uit de verrijkte mRNA zwembad is gesequenced. Herstelde sequenties kunnen worden geannoteerd met behulp van standaard bioinformatica technieken om de uitdrukking genen te identificeren.

Het analyseren van genexpressie van Marine microbiële gemeenschappen met behulp van het milieu transcriptomics

Gen microarrays zijn krachtige tools in gen expressie profilering bij een genoom-brede niveau. Deze technologie heeft toepassing in een verscheidenheid van biologische disciplines, waaronder ontwikkelingsbiologie en toxicologie. In deze video, we detail een protocol voor de wereldwijde genexpressie analyse met behulp van een uitgebreid oligonucleotide microarray platform voor de zebravis.

Global analyse van genexpressie met behulp van een zebravis oligonucleotide microarray platform

Microarray analyse voor Saccharomyces cerevisiae</em

Microarray analyse werd uitgevoerd om genetische expressie profielen...

Het bepalen van genetische expressie profielen in C. elegans Met behulp van microarray en real-time PCR

Systematische, grootschalige synthetische genetische (gen-gen of epistase) interactie schermen kunnen worden gebruikt om genetische redundantie en route overspraak verkennen. Hier hebben we een high-throughput kwantitatieve synthetische genetische scala screening technologie te beschrijven, genoemd eSGA door ons ontwikkelde voor het ophelderen van epistatisch relaties en het verkennen van genetische interactie netwerken...

Het in kaart brengen Bacteriële Functionele Netwerken en Wegen in<em&gt; Escherichia Coli</em&gt; Gebruik van synthetische Genetische Arrays

Dit manuscript beschrijft het gebruik van de nieuwste technologie die wordt geleverd door DNA-microarrays. Microarrays geven een overzicht van de transcriptomische veranderingen in bacteriën die ontstaan onder specifieke omstandigheden. Bovendien benadrukken we hoe gemakkelijk grote hoeveelheden gegevens kunnen worden geanalyseerd door gebruik te maken van handige, in eigen beheer ontwikkelde softwarepakketten.

Een snelle en betrouwbare Pipeline voor Bacteriële Transcriptome Analyse Case study: Serine-afhankelijke genregulatie in<em&gt; Streptococcus pneumoniae</em

We ontwikkelden een protocol dat snel, gevoelig en reproduceerbaar is voor het profileren van pathogene genexpressie tijdens een infectie.

Genexpressie infecteren Microben Met behulp van een digitale Bar-codering Platform

Hier wordt beschreven, is een methode voor het analyseren van bacteriële genexpressie in dierlijke weefsels op een cellulair niveau. Deze methode biedt een bron voor de studie van de fenotypische verscheidenheid die zich voordoen binnen een bacteriële bevolking in antwoord op het milieu weefsel tijdens een infectie.

Een fluorescentie gebaseerde methode om te studeren van bacteriële genregulatie in geïnfecteerde weefsels

Deze procedure wordt beschreven hoe de primaire hematopoietische celculturen te zetten vanaf knaagdier beenmerg en wordt gevolgd door transfectie met de Gene Puiser MXCell elektroporatie systeem.

De vervaardiging van primaire hematopoietische cellen culturen uit Murine Bone Marrow voor Elektroporatie

Protocol voor Vaccinia infectie van HeLa cellen en analyse van de gastheer en virale gen-expressie. Deel 1 van 3.

Vaccinia virus infectie en Temporele Analyse van de Virus Gene Expression: Deel 1

Leer bacteriële genexpressieanalyse met microarrays via indirecte labeling met Cy3- en Cy5-fluorescentie. Deze methode vergelijkt wildtype- en mutantstalen betrouwbaar zonder kleurvoorkeur.

Bacteriële Gene Expression analyse met behulp van Microarrays

Meer video's verkennen