Bacteriële Gene Expression analyse met behulp van Microarrays

Hallo, mijn naam is Ena en wij voeren in het laboratorium routinematig genexpressieprofilering uit. We gebruiken deze techniek om differentieel gereguleerde genen tussen meth en wildtype te monitoren. Vandaag heb ik RNA-monsters van wildtype en meth en we beginnen allemaal met cDNA-synthese.

Wij maken gebruik van indirecte labelingsmethoden en het voordeel van deze techniek is dat oogbias, die bij directe labeling kan optreden, wordt voorkomen. Hiervoor gebruiken we RNA-monsters waarbij we streven naar 3 µg RNA in een totaalvolume van 13 µL. Vervolgens voegen we 2,5 µg random hexameren toe aan onze monsters.

Vervolgens incuberen we het monster bij 75 °C gedurende acht minuten om de RNA-structuur te denatureren. Nu voegen we de reverse transcriptie-cocktail toe, die bestaat uit AM L-D-L-D-U-T-P continu mix, reverse transcriptase-buffer en ook ET TT. We centrifugeren het kort en incuberen het monster vier uur lang bij 42 °C. Na vier uur halen we de monsters eruit.

In de buis bevindt zich nu een mengsel van cDNA en RNA. We gaan nu het RNA hydrolyseren door natriumhydroxide en EDTA toe te voegen, waarbij de eindconcentratie voor natriumhydroxide 100 mM moet zijn. De eindconcentratie voor EDTA moet 5 mM zijn.

We incuberen de monsters nu gedurende 10 minuten in een waterbad van 65 °C. De incubatie is nu voltooid en we behandelen de monsters door pH 7 HEPES-water toe te voegen tot een eindconcentratie van 500 molar. Op dit punt kunnen de monsters worden bewaard bij -20 °C of kan de reiniging worden voortgezet.

Voor de zuivering van het cDNA gebruiken we de KaiGen PCR-zuiveringskit. Aangezien de Bush-buffer en de ionbuffer echter freezing bevatten, bereiden we onze eigen phosphate bush-buffer en phosphate ion-buffer; voeg 300 µL PPI toe en pipetteer dit langzaam naar beneden. Transfer vervolgens het mengsel naar de kolommen en centrifugeer één minuut op de hoogste snelheid. Gebruik de buffer die we hebben bereid, de phosphate wash-buffer; voeg 750 µL toe en centrifugeer vervolgens opnieuw gedurende één minuut.

We centrifugeren opnieuw om er zeker van te zijn dat alles goed is neergeslagen. Vervolgens dragen we deze buisjes over naar lege centrifugebuisjes. Ik voeg 30 µL fosfaatbuffer E toe, wat bestaat uit 4 M kaliumfosfaat bij pH 8.5.

Zorg er hier nu voor dat u alles in het midden van de kolom toevoegt en incubeer dit gedurende één minuut bij kamertemperatuur. Het zal dus opnieuw één minuut centrifugeren en ik voeg nog eens 30 µL buffer toe en incubeer dit bij kamertemperatuur. Vervolgens verwijder ik de kolom, waardoor we een totaal volume van 60 µL CDA hebben.

Zodra we het cDNA hebben gezuiverd, kan het worden bewaard bij -20 °C; we kunnen het ook drogen en vervolgens bewaren, dus we kunnen het cDNA in een VacuCentric drogen. In de buis hebben we nu droog cDNA, dat is am-gemodificeerd. Wat we nu gaan doen, is het droge monster resuspenderen in.

Ik zal het monster suspenderen in 10 µL van 15 mM bicarbonaat bij pH 9. Dit doe ik door het monster herhaaldelijk op en neer te pipetteren; in deze stap is het zeer belangrijk om het cDNA goed te resuspenderen. Voor een succesvolle incorporatiereactie moet deze reactie plaatsvinden in een donkere kamer, aangezien fluorescerende labels lichtgevoelig zijn.

Omdat deze echter uit de levenswetenschappen komen, werden ze in individuele verpakkingen geleverd. S5 heeft een paarse dop en S3 heeft een oranje dop; bovendien lijkt S5 cyaan wanneer het wordt gesuspendeerd en Cary lijkt magenta. Daarom zal ik in de donkere kamer deze monsters overbrengen naar kleurstofbuisjes, de kleurstof opnieuw suspenderen en ze vervolgens terugoverbrengen naar de buis die ik heb.

Daarna incubeer ik het twee uur in het donker. Na twee uur incubatie wordt de reactie gestopt door het toevoegen van 35 µL van 100 millimolair natriumacetaat bij pH 5.2. Vervolgens hebben we de reiniging uitgevoerd met een soortgelijke reinigingsprocedure. Deze keer hebben we echter de door Qiagen geleverde wasbuffer en elutiebuffer gebruikt.

U kunt de plaatsen beschrijven waar u het monster plaatst en dat zou het instrument moeten reinigen. U kunt uw monster of uw mengsel nu toevoegen. Dit is mijn scifi-gelabelde monster en hier zien we OD 260, wat het DNA-gehalte aangeeft, en OD 650, wat de D-incorporatie voor scifi aangeeft. En hier is mijn side three-gelabelde monster.

Draai opnieuw zes concentraties en vijf 50-metingen voor site drie incorporatie. Omdat mijn D-corporatie efficiënt werkt, zal ik de monsters nu combineren. Meng het kort. En nu zullen we opnieuw een monster schrijven met behulp van feedback.

Oké, voor de preparatie van de slide zullen we rehydrateren door de slide universeel op water te plaatsen, waardoor de spots groter worden. Om dit vervolgens te beschermen, drogen we ze snel bij 100 °C en zullen we de spots via UV-hybridisatie of UV-crosslinking aan de slide binden, waarna we incuberen in de aanwezige pre-hybridisatiebuffer. Ik plaats de slide met de voorkant naar beneden, maar hij raakt het water nog niet aan.

En we wachten zo vijf minuten. Deze box ziet er groter uit, ze zouden glanzender moeten zijn dan vóór het aanbrengen, en u droogt het simpelweg door de slide op 100 °C te plaatsen en u observeert op condensatie. En we zullen crosslinken met youi.

Voor de hydratatie dip ik de slide kort in pre-warm water. Dit moet zeer snel gebeuren, omdat het doel is om alle spots of alle oligos op de spot die niet gekoppeld zijn te verwijderen. Als u dit proces te langzaam uitvoert, ontstaan er comet-tails bij uw spots.

Zorg ervoor dat u dit echt snel doet en dat u uw glasplaatje niet uit het water tilt; voer deze handelingen 30 seconden lang uit en laat het vervolgens onmiddellijk vijf minuten rusten bij kamertemperatuur en 700 rpm. Plaats dit glasplaatje in de vooraf voorbereide station-buffer en schuif het glasplaatje langzaam in de pot, waarna we dit ten minste 45 minuten incuberen bij 42 °C. Hier hebben we ons gedroogde monster dat gehybridiseerd moet worden. We zullen dit eerst resuspenderen in water.

Bij deze stap resuspenderen we enkel door het monster op en neer te pipetteren en we vermijden dat het monster te veel wordt blootgesteld aan licht. Vervolgens voegt u 1,5 µL sperma-DNA toe met een concentratie van 10 mg/ml. Daarna voegt u 1,2 µM tRNA toe.

De concentratie is 12,5 mg/mL; we voegen tRNA en wat sperma-DNA toe om aspecifieke hybridisatie te blokkeren. Vervolgens voegen we 5,35 µL marker 0,3 XSSC toe, wat resulteert in een eindconcentratie van 3x. Ten slotte voegen we 3,5 µL 1% SDS toe.

Nu koken we het mengsel gedurende vijf minuten en centrifugeren we op de hoogste snelheid gedurende vijf minuten, waarna het klaar is voor gebruik. Het is nu een uur geleden dat we het preparaat hebben geïncubeerd en ik heb nu water en isopropanol bij de hand. Daarom schud ik het preparaat eerst in water om SDS te verwijderen, was ik het vervolgens met isopropanol en plaats ik het direct in de standaardmeting.

En wees hier voorzichtig dat u het preparaat niet te veel aan de lucht blootstelt om uitdroging te voorkomen. Ik ga dus direct van de harm station buffer naar het water en we wassen het objectglas. Een paar minuten, zorg erbij voor dat de beweging alleen op en neer is, niet zijwaarts.

Zorg er daarnaast voor dat het preparaat niet onder water blijft staan en breng het onmiddellijk over naar isopropanol. Laat het hier opnieuw enkele minuten in liggen. Laat het preparaat vervolgens vijf minuten bij kamertemperatuur rusten.

700 R.Cool. Onze objectglas is nu ook klaar voor hybridisatie en het is raadzaam om deze in een objectglazen doos te bewaren ter bescherming tegen stof. Voor het oogststation gebruiken we een lift of slip.

Er bevinden zich witte strips op het dekglas die voor enige lift zorgen en ruimte creëren voor ons monster tussen het dekglas en het objectglas. Ik maak het schoon met ethanol en leg het daarna neer, waarbij ik controleer of er geen stofdeeltjes aanwezig zijn. Vervolgens nemen we het sjabloon-objectglas waarop het printgebied is gemarkeerd en plaatsen we daarop het objectglas dat we hebben voorbereid, waarbij we ervoor zorgen dat ze perfect zijn uitgelijnd.

Zorg dat ze perfect zijn uitgelijnd. Controleer daarnaast of de strips zich aan de zijde bevinden die we naar beneden zullen richten. Het is erg moeilijk te zien, maar zorg ervoor dat u het kunt waarnemen.

De strepen moeten zich aan de zijkanten van de objectglazen bevinden. We laden het monster vanaf de zijkanten. Ik neem kleine hoeveelheden monster; ik neem eerst 15 µL en begin met laden vanaf de hoek van het dekglas.

Vervolgens trek ik het langzaam naar binnen en beweeg ik langs de rand om het hele oppervlak te bedekken. In dit stadium is het zeer belangrijk om geen luchtbellen te introduceren; ik neem nog een 15 µL pipet en breng dit aan aan de zijkanten van de objectglazen om uitdroging te voorkomen. Ons monster is nu klaar en u incubeert de objectglazen en prioriteringskamers, die microkanalen hebben om het objectglas te hydrateren tijdens de hybridisatie.

Vervolgens voegen we 10 µL van 3X SSC toe aan de zes hoeken van het objectglas. Er zijn zes posities op de kamer, sorry, op elke hoek en aan elke zijde. Zorg ervoor dat u het objectglas zeer voorzichtig verplaatst, zodat het dekglas niet verschuift. Wanneer u het objectglas rechtop plaatst, zult u zien dat het hecht aan het water dat u heeft toegevoegd en het dekglas plaatst. Zorg ervoor dat de schroeven stevig zijn aangedraaid.

We incuberen de conversiekamer in een waterbad van 65 °C, maar we willen deze niet direct op de bodem plaatsen. Daarom plaatsen we een plastic barrière om overmatige warmteoverdracht te voorkomen. Vervolgens plaatsen we de conversiekamer voorzichtig en, om elke verschuiving te voorkomen, kunt u ook een gewicht toevoegen.

Deze incubatie vindt gedurende de nacht plaats, doorgaans tussen de 10 en 12 uur. Voor het wassen van de coupes gebruiken we 1X SSC met 0,05% SDS. Dit dient voor het verwijderen van het dekglas.

En dit is voor de eerste wasstap. Vervolgens voeren we nog twee stappen uit met uitsluitend 0,06% six XSC om al het SDS te verwijderen. We sluiten de conversatie af, nemen de objectglazen en plaatsen deze met de voorkant naar beneden in een container.

Vervolgens schudden we het voorzichtig van links naar rechts en we zien dat het dekglas er zachtjes afvalt. Goed, en we brengen het nu over naar een andere wasbuffer die XES bevat. Laat dit één minuut inwerken.

Ga over naar stap zes XSSC. En om er zeker van te zijn dat we alle FDS hebben verwijderd, herhalen we dit nog één keer. Centrifugeer om te drogen bij kamertemperatuur gedurende vijf minuten bij 700 RP. Bewaar dit preparaat in de objectglaskas omdat het lichtgevoelig is.

Dit is de slide-scanner; u plaatst de slide hier, in deze kleine ruimte, met de zijde met het monster naar beneden en het label naar voren. Bij de tweede slide definieert u simpelweg het gebied dat u wilt scannen. We selecteren dit gebied op onze slides; we gebruiken 16 pins om onze slides te printen.

Elk blok correspondeert dus met één pin en onze slides bevatten meer dan 8.000 spots. We representeren het vi-kleurgenoom twee keer omdat het ongeveer 4.000 genen bevat. We hebben dus twee spots voor elke oligo die we gebruiken.

En als we inzoomen, ziet u in dit specifieke experiment dat we transcriptieregulator-mutanten vergelijken met het wildtype; de mutant is gelabeld met scifi, wat een rode kleur geeft. Het wildtype was site drie, wat een groene kleur geeft. Alles wat rood lijkt, zoals deze vlekken, geeft aan dat de abundantie van de transcripten in de mutant hoger was dan in het wildtype.

Hierdoor verschijnen ze rood of in tinten van rood, en alles wat groen verschijnt geeft aan dat de abundantie van het transcript hoger was in het wildtype vergeleken met de mutant. Elke stip die geel verschijnt geeft aan dat dat transcript in gelijke mate aanwezig was in zowel de mutant als het wildtype. Wanneer ze over elkaar heen vallen, verschijnen ze dus geel, zoals deze stippen.