Bacteriële Gene Expression analyse met behulp van Microarrays

Hallo, mijn naam is Ena en we doen routinematig genexpressieprofilering in het laboratorium. En we gebruiken deze techniek om differentieel gereguleerde genen tussen meth en wild type te monitoren. En vandaag heb ik een wild type en meth RNA monsters en we doen allemaal eerst C.

We gebruiken indirecte labelmethoden en het voordeel van deze techniek is om oogbias te voorkomen die kan optreden bij directe labelmethoden. En om dat te doen hebben we RNA monsters en we kiezen voor het verkrijgen van drie microgram RNA in 13 microliter van het totale volume. En we voegen 2,5 micro van willekeurige he toe in onze parken.

En we zullen de monster incuberen bij zeven vijf graden om de aard van het RNA gedurende acht minuten te behouden. En nu zullen we toevoegen, we zullen reverse transcriptie cocktail toevoegen dat AM L-D-L-D-U-T-P continu mix bevat, reverse transcriptase buffer en ook ET TT Big it down En incubeer het monster gedurende vier uur op 42 graden. Dus na vier uur halen we de monsters er gewoon uit.

En nu hebben we in de buis CDNA en RNA mix. En wat we willen doen is hydrox RNA doen door natriumhydroxide en EDTA toe te voegen en de eindconcentratie voor natriumhydroxide moet honderd molair zijn. En de eindconcentratie voor e BT moet vijf molair zijn.

En nu zullen we de monsters incuberen in een waterbad van 65 graden gedurende 10 minuten. Dus de incubatie is voltooid en we zullen de monsters gebruiken door pH zeven heaps een water toe te voegen tot een eindconcentratie van 500 molair. Op dit punt kunt u de monsters bewaren bij min 20 of u kunt doorgaan met de reiniging.

Voor de reiniging van de CDNA gebruiken we KaiGen PCR-zuiveringskit. Maar omdat Bush-buffer en ion-buffer freon bevatten, bereiden we onze eigen fate Bush-buffer en fate ion-buffer voor en je voegt 300 liter van PPI toe en we zullen die pond langzaam naar je toe pijplijnen. Je zult de mix in kolommen overbrengen En je zult een minuut spinnen op de hoogste snelheid En je zult de, de buffer die we hebben bereid. Fosfaatwasbuffer, je voegt 750 microliter toe en zo, en je voegt er nog een toe voor één opnieuw.

Dus we zullen opnieuw spinnen om er zeker van te zijn dat we alles hebben. En we zullen deze buizen overbrengen naar lege ontvangerbuizen. En ik zal 30 markers van fosfaat E-buffer toevoegen, dat is vier vier molair kaliumfosfaat bij een pH van 8,5.

En hier hoef je alleen maar zeker te zijn dat je alles in het midden van de kolom toevoegt en je zult incuberen bij kamertemperatuur gedurende een minuut. Dus het zal weer een minuut spinnen en ik zal nog eens 30 micro zero buffer toevoegen ik incubeer of slaapkamer. Dus ik verwijder de kolom en we hebben een totaalvolume van 60 micro of CDA.

Eenmaal we de CDNA hebben opgeruimd, kun je het bewaren bij min 20 graden en we kunnen het ook drogen en vervolgens opslaan, dus we kunnen de CDNA in feedback drogen. Dus nu hebben we in de buis droge CDA, die am-gemodificeerd is. En wat we zullen doen is ik zal het droge monster opschorten in.

Ik zal het monster opschorten in 10 turen van 15 LAR-bicarbonaat bij een pH van negen. En ik zal dit doen door op en neer te bewegen. In deze stap is het erg belangrijk om de cDNA te resuspenseren. Wel, voor de biotinyleringsreactie om te werken, moet deze reactie plaatsvinden in de donkere kamer omdat fluorescerende labels gevoelig zijn voor licht.

Echter, deze zijn verkregen van Life Sciences en ze komen in individuele verpakkingen. S vijf heeft een paarse dop en side drie heeft een oranje dop en ook S vijf verschijnt sion wanneer het wordt opgeschort en Cary verschijnt magenta. Dus wat ik zal doen in de donkere kamer is ik zal deze monsters overbrengen naar kleurstofbuizen, ik zal de kleurstof opnieuw opschrijven en ze overbrengen naar de buis die ik heb.

En dan zal ik in het donker incuberen gedurende twee uur. Na twee uur incubatie stopt deze reactie door 35 re van honderd millimolair natriumacetaat toe te voegen bij een pH van 5,2. En daarna zullen we opruimen met een vergelijkbare opruimprocedure. Maar deze keer gebruiken we Cajun-geleverde wasbuffer en elutiebuffer.

Je kunt de plaatsen beschrijven waar je het monster hebt geplaatst en dat zou het instrument moeten reinigen. Dus je kunt je monster of je blend nu opruimen I To, Dus dit is mijn scifi-gelabelde monster en hier zien we OD twee 60, wat de CDA-inhoud aangeeft en OD zes 50, wat de D-incorporatie voor scifi aangeeft. En hier is mijn side drie-labelmonster.

Nogmaals, twist zes concentratie en vijf 50 meet site drie-incorporatie. Aangezien mijn D-incorporatie efficiënt werkt, zal ik de monsters combineren Nu, Ms.Miss it kort. En nu zullen we een monster opnieuw schrijven met behulp van feedback.

Oké, dus voor isatie van de plaat zullen we rehydrateren door de plaat universeel op het water te leggen en dat zorgt ervoor dat de vlekken groter worden. En om dat te beschermen, zullen we het snel drogen bij honderd graden Celsius en we zullen UV hybridiseren of UV crosslink de vlekken in de plaat en vervolgens incuberen in de prehoge buffer die we hebben. Dus ik plaats de plaat met de voorkant naar beneden, maar het raakt het water nog niet.

En we zullen zo wachten gedurende vijf minuten. Ik, Dus deze doos ziet er groter uit, ze zouden moeten glanzen dan voordat je het hebt geplaatst, en je zal snel drogen door de plaat op honderd graden te leggen en je zal observeren op condensatie. En we zullen crosslink met joui.

Dus voor hydratatie zal ik de plaat gewoon in vooroorlogs water dompelen. En dit moet heel snel gaan omdat het doel hier is om alle vlekken of alle oligo's op de vlek die niet gelinkt is kwijt te raken. En als je langzaam gaat in dit proces, krijg je gewoon com-staarten op je vlekken.

Dus zorg ervoor dat je het echt snel doet en zorg ervoor dat je je vliegt niet uit het water haalt en doe Dit Stuff