Geoptimaliseerd protocol voor Efficiënte Transfectie van dendritische cellen zonder Cell Rijping
July 8th, 2011
We presenteren onze geoptimaliseerde high-throughput nucleofection protocol als een efficiënte manier transfecteren primaire menselijke monocyt-afgeleide dendritische cellen met een plasmide DNA of siRNA, zonder dat cel rijping. We verder bewijs leveren voor een succesvolle siRNA zwijgen van gerichte gen RIG-I zowel op mRNA-en eiwitniveau.
Het algemene doel van deze procedure is om de expressie van doelgenen in DCS te verminderen door middel van SI RNA-transfectie. Dit wordt bereikt door eerst de AM Maxin Nucleo effector te programmeren. De tweede stap van de procedure is om DCS en siRNA samen te mengen en de resulterende celoplossing in Nucleo QVE-modules te pipetteren.
De derde stap van de procedure is om de plaat in de amaxa shuttle tray te plaatsen om het transfectieproces te starten. De laatste stap van de procedure is om de cellen met het virus te infecteren om de interferonrespons te activeren. Uiteindelijk kunnen resultaten worden verkregen die genknockdown tonen door middel van kwantitatieve R-T-P-C-R en Western blotting.
Deze techniek is waardevol voor het karakteriseren van signaalroutes in dendritische cellen en kan bijdragen aan de ontwikkeling van dendritische cel-gebaseerde immuuntherapieën. Om de Maxon 96-well shuttle nucleo factor voor DC-transfectie te programmeren, opent u een nieuw parameterbestand. Selecteer het aantal wells dat u zult gebruiken voor standaardtransfectie door de cursor over het diagram van de 96-well plaat te slepen.
Gebruik minimaal drie wells om te poolen voor elk experimenteel monster. Voer nu de programmacode in in deel een, selecteer F, F en i, deel twee, selecteer 1 68 uit de pull-down menu's. Selecteer vervolgens monocyte human in het oplossingsvak, selecteer standard onder controleoptie en klik vervolgens op toepassen.
Om een controle zonder transfectie op te nemen, moet u extra wells van het diagram selecteren. Kies vervolgens geen programmacontrole in de controleoptie en klik opnieuw op toepassen. Laat de nucleo affectieoplossing opwarmen tot kamertemperatuur nadat u het hebt gemengd.
Plaats het aantal nucleo vete modules dat nodig is in de nucleo VETE-plaat in de juiste oriëntatie zoals hier getoond door de eerste in rose één en twee te plaatsen en dan zo voor alle volgende buizen. Breng voldoende DCS over van een celcultuurflacon in een 50 milliliter buis om 500.000 cellen per well te hebben voor de transfectie, centrifugeer de cellen gedurende 10 minuten bij 400 G bij vier graden Celsius en verwijder vervolgens voorzichtig het supernatant. Voeg vervolgens nucleaire affectieoplossing toe aan de buis en resuspendeer de DCS vervolgens door een paar keer voorzichtig op en neer te pipetteren.
Label nu de eind DPH-buizen volgens de specifieke behandeling die moet worden uitgevoerd en verdeel vervolgens de gesuspendeerde cellen in de gelabelde buizen. Voeg SI RNA toe met een uiteindelijke concentratie van 0,25 microgram per 500.000 cellen toe aan de geschikte epi endorfbuizen en meng vervolgens de celsuspensies door te pipetteren. Gebruik niet-doel SI RNA voor het controlemonster zonder transfectie.
Pipetteer vervolgens 20 microliters van de SI RA DC celsuspensie in de nucleo vete modules volgens het eerder geprogrammeerde experimentele lay-out, zorg ervoor dat de vloeistof op de bodem van de well wordt afgegeven, bedek de nucleo vete plaat met een deksel en tik een paar keer op de plaat op een harde ondergrond om de verwijdering van luchtbellen te vergemakkelijken om de dcs te transfecteren. Plaats de voorbereide nucleo Yvette-plaat in de nucleo effector 96-well shuttle tray. Klik vervolgens op de upload en start-knop.
Volg de voortgang van het transfectieproces op het display. Een zwart kruis op een groene achtergrond duidt op een succesvolle transfectie in die well, terwijl een zwarre balk op een rode achtergrond betekent dat het onsuccesvol was terwijl de cellen worden getransfecteerd. Verwarm DC-groeimedium voor op het moment dat het transfectieproces is voltooid, verwijder de plaat en voeg 80 microliters van het voorverwarmde DC-groeimedium toe aan elke well.
Incubeer de plaat nu gedurende 10 minuten bij 37 graden Celsius en 5% CO2 met behulp van een multikanaals pipetteerder. Voeg tijdens de incubatieperiode 100 microliters van het voorverwarmde DC-groeimedium toe aan matrixbuizen in dezelfde oriëntatie als de nucleo cuvette plaatset-up. Na de incubatieperiode, breng alle 100 microliters van de celsuspensies van de nucleo CVE's over in de vooraf geplaatste matrixbuizen.
Verwijder en gooi vervolgens de buizen waar transfectie niet is opgetreden. Incubeer vervolgens de matrixbuizen gedurende 24 uur of een andere gewenste tijdsperiode. Label einor buizen voor elk van de incuberende matrixbuizen.
Breng vervolgens de matrixbuizen van de incubator over naar een celcultuurhood en pool de matrixbuizen voor elk experimenteel monster in de vooraf gelabelde eend dfs. Pellet vervolgens de cellen voorzichtig door de eend DPH-buizen 10 minuten in een desktopcentrifuge te draaien. Verwijder bij 400 G het snat en resuspendeer de cellen in serumvrij groeimedium dat Newcastle disease virus of NDV bevat met een MOI van één losjes.
Dek de epi-endorfines op een steriele manier af en incubeer vervolgens de buizen gedurende 45 minuten. Voeg na deze incubatieperiode 900 microliters DC-groeimedium toe en incubeer de buizen nog eens acht tot tien uur. Om de getransfecteerde en geïnfecteerde dcs te oogsten.
Pellet de cellen door de einor-buizen in een desktopcentrifuge te draaien zoals eerder en verwijder het snat. Monocyte dcs werden getransfecteerd met ofwel IRNA die RIG I targette of niet-specifiek glow irna en geïnfecteerd met NDV zoals aangegeven door een plusteken of bleven ongeïnfecteerd zoals aangegeven door een minteken zoals gedetecteerd door kwantitatieve R-T-P-C-R-A. Knockdown van R RGA met 75% Op het transcriptieniveau werd een vergelijkbare vermindering in de expressie van interferon beta waargenomen. Een downstream effector van RGA in de interferon-signaleringscascade werd ook waargenomen. Bovendien was de expressie van interferon beta in niet-geïnfecteerde controle getransfecteerde cellen niet detecteerbaar.
Terwijl die van MXA en interferon beta downstream responsgen minimaal was. Hier. Gegevens van een tweede transfectie van DCS met rigi targeting irna die werd uitgevoerd zoals in de vorige figuur, worden in dit experiment getoond. Alle cellen zijn echter geïnfecteerd met NDV en een extra controle met niet-gesecteerd Monocyte DCS werd opgenomen.
De resultaten van gensilencing waren vergelijkbaar met die waargenomen in de vorige figuur
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Overzicht
Dit artikel presenteert een geoptimaliseerd nucleofectieprotocol met hoge doorvoer voor het transfecteren van primaire humane monocyte-afgeleide dendritische cellen met plasmide-DNA of siRNA. De methode zorgt ervoor dat celrijping niet wordt geïnduceerd tijdens het transfectieproces.
Belangrijke onderdelen van het onderzoek
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschap
- Celbiologie
- Moleculair biologie
Achtergrond
- Transfectie van dendritische cellen is cruciaal voor het bestuderen van immuunresponsen.
- Traditionele methoden kunnen leiden tot ongewenste celrijping.
- Efficiënte gensilencingtechnieken zijn nodig voor functionele studies.
- siRNA kan doelgenexpressie effectief onderdrukken.
Doel van het onderzoek
- Om een nucleofectieprotocol met hoge doorvoer te ontwikkelen.
- Om dendritische cellen te transfecteren zonder celrijping te induceren.
- Om succesvolle genesilencing van RIG-I te demonstreren.
Gebruikte methoden
- Programmeren van de AM Maxin Nucleo effector.
- Mengen van dendritische cellen en siRNA voor transfectie.
- Gebruik van Nucleo QVE modules voor pipetteren van celoplossingen.
- Gebruik van kwantitatieve RT-PCR en Western blotting voor resultaten.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle transfectie van dendritische cellen zonder rijping.
- Effectieve genknockdown van RIG-I op mRNA- en eiwitniveaus.
- Gedemonstreerde methodologie kan in verschillende studies worden toegepast.
- Resultaten gevalideerd door middel van kwantitatieve RT-PCR en Western blotting.
Conclusies
- Het geoptimaliseerde nucleofectieprotocol is efficiënt en betrouwbaar.
- Deze methode kan studies over immuunresponsen verbeteren.
- Toekomstige toepassingen kunnen verschillende gensilencingexperimenten omvatten.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Efficient transfection of primary dendritic cells without inducing maturation addresses a critical bottleneck in immunology-focused drug discovery and target validation. This protocol enables precise genetic manipulation for mechanistic studies, supporting predictive confidence in immune pathway interrogation and facilitating risk-adjusted advancement of immunotherapeutic candidates. The approach enhances portfolio decision-making by enabling robust, reproducible functional genomics in a disease-relevant system.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables functional knockdown of immune signaling genes in primary dendritic cells for pathway de-risking.
- Supports mechanistic validation of immune targets without confounding cell maturation artifacts.
- Facilitates hypothesis-driven interrogation of innate immune sensors and downstream effectors.
- Improves predictive confidence for target selection in immunotherapy pipelines.
Screening & Assay Development
- Provides a standardized, high-throughput workflow for genetic perturbation in primary immune cells.
- Delivers quantitative readouts (qRT-PCR, Western blot) for robust assay development and optimization.
- Enables reproducible assessment of gene function and pathway modulation in screening campaigns.
- Reduces variability by maintaining dendritic cell immaturity during transfection.
Translational & Preclinical Research
- Aligns in vitro immune modulation with disease-relevant cellular contexts for translational continuity.
- Supports biomarker discovery and validation by enabling targeted gene silencing in primary cells.
- Facilitates preclinical evaluation of immune pathway interventions with mechanistic clarity.
- De-risks advancement of immunomodulatory strategies by confirming target engagement in primary human cells.
Pipeline & Workflow Integration
This protocol integrates into the discovery-to-preclinical continuum by enabling genetic manipulation of primary dendritic cells for target validation, assay development, and translational research.
- Discovery Biology: Supports null hypothesis testing and mechanistic de-risking of immune targets.
- Screening: Provides reproducible, quantitative outputs for assay standardization and compound evaluation.
- Analytics: Delivers robust gene knockdown and protein expression data for comparative analysis.
- Translational Research: Maintains disease-relevant cellular context for biomarker and pathway studies.
- Enterprise Reuse: Offers a scalable, high-throughput platform for repeated use across immune target programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in immune pathway studies.
- Operational Value: Standardizes transfection and readout workflows for reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Enables informed go/no-go decisions and capital-efficient portfolio advancement.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of immunotherapeutic targets and modalities.
Implementation Considerations
- Requires expertise in primary cell culture and nucleofection instrumentation.
- Demands access to quantitative analytical platforms (qRT-PCR, Western blot).
- Necessitates cross-team standardization of transfection and readout protocols.
- May require adaptation for different donor sources or immune cell subtypes.
- Efficiency and viability thresholds should be validated for each experimental context.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:05
Program the Amaxa 96-well Shuttle Nucleofactor
2:00
Prepare DCs for Transfection
3:40
Transfect DCs
5:07
Infection and Harvest of Cells with Newcastle Disease Virus
6:09
siRNA Gene Targeting Results in Drastic Reduction of Message and Total Reduction of Protein Expression in Monocyte DCs
7:51
Conclusion
