Geoptimaliseerd protocol voor Efficiënte Transfectie van dendritische cellen zonder Cell Rijping

Het algemene doel van deze procedure is om de expressie van het doelgen in DCS te reduceren door middel van siRNA-transfectie. Dit wordt bereikt door eerst de AM Maxin Nucleo-effector te programmeren. De tweede stap van de procedure is het mengen van DCS en siRNA en het pipetteren van de resulterende celoplossing in Nucleo QVE-modules.

De derde stap van de procedure is het plaatsen van de plaat in de amaxa shuttletray om het transfectieproces te starten. De laatste stap van de procedure is het infecteren van de cellen met het virus om de interferonrespons te activeren. Uiteindelijk kunnen resultaten worden verkregen die gen-knockdown aantonen via kwantitatieve R-T-P-C-R en Western blotting.

Deze techniek is waardevol voor het karakteriseren van signaleringspaden in dendritische cellen en kan bijdragen aan de ontwikkeling van immuuntherapieën op basis van dendritische cellen. Om de Maxon 96-well shuttle nucleo factor te programmeren voor DC-transfectie, opent u een nieuw parameterbestand. Selecteer het aantal wells dat u voor standaardtransfectie gaat gebruiken door de cursor over het diagram van de 96-wells plaat te slepen.

Gebruik voor elk experimenteel monster een minimum van drie wells om te poolen. Voer nu de programmacode in; selecteer in deel één F, F en in deel twee selecteert u 1 68 uit de vervolgkeuzemenu's. Selecteer vervolgens in het vak voor de oplossing monocyte human, selecteer onder de optie controle 'standard' en klik daarna op toepassen.

Om een controle zonder transfectie op te nemen, moeten er extra putjes uit het diagram worden geselecteerd. Kies vervolgens bij de controleoptie voor de optie zonder programma-controle en klik opnieuw op toepassen. Laat de nucleofectie-oplossing na het mengen opwarmen tot kamertemperatuur.

Plaats het benodigde aantal nucleo VETE-modules in de juiste oriëntatie in de nucleo VETE-plaat, zoals hier getoond, door de eerste module in rij één en twee te plaatsen en dit vervolgens te herhalen voor alle volgende buizen. Breng voldoende DCS over van een celkweekfles naar een buis van 50 milliliter om 500.000 cellen per well te verkrijgen voor de transfectie. Centrifugeer de cellen gedurende 10 minuten bij 400 G bij 4 °C en verwijder vervolgens voorzichtig het supernatant. Voeg daarna nucleo-fectie-oplossing toe aan de buis en resuspendeer de DCS door voorzichtig een paar keer op en neer te pipetteren.

Label nu de DPH-buisjes volgens de specifieke behandeling die moet worden uitgevoerd en verdeel vervolgens de geresuspendeerde cellen over de gelabelde buisjes. Voeg SI RNA toe aan de betreffende epi endorf-buisjes tot een eindconcentratie van 0,25 micrograms per 500 000 cellen, en meng vervolgens de celsuspensies door te pipetteren. Gebruik non-target SI RNA voor de controlemonsters zonder transfectie.

Pipetteer vervolgens 20 µL van de SI RA DC-celсусpensie in de nucleo vete-modules volgens het vooraf geprogrammeerde experimentele ontwerp, waarbij u ervoor zorgt dat de vloeistof op de bodem van de well wordt afgeleverd. Dek de nucleo vete-plaat af met een deksel en tik de plaat een paar keer op een hard oppervlak om de verwijdering van luchtbellen te vergemakkelijken om de DC's te transfecteren. Plaats de voorbereide nucleo Yvette-plaat in de nucleo effector 96-well shuttle-tray. Klik vervolgens op de upload- en startknop.

Volg de voortgang van het transfectieproces op het display. Een zwart kruis op een groene achtergrond geeft een succesvolle transfectie in die put aan, terwijl een zwarte balk op een rode achtergrond betekent dat de transfectie is mislukt terwijl de cellen worden getransfecteerd. Warm het DC-groeimedium voor zodra het transfectieproces is voltooid, verwijder de plaat en voeg 80 µL van het voorverwarmde DC-groeimedium toe aan elke put.

Incubeer de plaat nu gedurende 10 minuten bij 37 °C en 5% CO2 met behulp van een meerkanaalpipet. Voeg tijdens de incubatieperiode 100 µL van het voorverwarmde DC-groeimedium toe aan de matrixbuisjes in dezelfde oriëntatie als de opstelling van de nucleo-cuvetteplaat. Draag na de incubatieperiode alle 100 µL van de cel-suspensies over van de nucleo CVE's naar de vooraf klaargezette matrixbuisjes.

Verwijder vervolgens de buisjes waarin geen transfectie heeft plaatsgevonden en gooi deze weg. Incubeer tot slot de matrixbuisjes gedurende 24 uur of een ander gewenst tijdsinterval. Label einor-buisjes voor elk van de incuberende matrixbuisjes.

Breng vervolgens de matrixbuisjes van de incubator over naar een celkweekkast en voeg de matrixbuisjes voor elk experimenteel monster samen in de vooraf gelabelde eend dfs. Pelleteer daarna de cellen voorzichtig door de eend DPH-buisjes 10 minuten te centrifugeren in een desktopcentrifuge. Bij 400 G verwijdert u de snat en resuspendeert u de cellen voorzichtig in serumvrij groeimedium dat Newcastle disease virus of NDV bevat bij een MOI van één.

Dek de epi endorphines op steriele wijze af en incubeer de buisjes vervolgens gedurende 45 minuten. Voeg na deze incubatieperiode 900 µL DC-groeimedium toe en incubeer de buisjes opnieuw gedurende nog eens acht tot 10 uur, om de getransfecteerde en geïnfecteerde dc's te oogsten.

Pellet de cellen door de einor-buizen zoals eerder beschreven in een desktopcentrifuge te centrifugeren en verwijder de snat monocyten. De dcs werden getransfecteerd met ofwel siRNA gericht tegen RIG I of niet-specifieke glow irna en geïnfecteerd met NDV, zoals aangegeven door een plusteken, of bleven ongeïnfecteerd, zoals aangegeven door een minteken, zoals gedetecteerd via kwantitatieve R-T-P-C-R. Er werd een knockdown van R RGA van 75% op transcriptieniveau waargenomen; een soortgelijke afname in de expressie van interferon bèta, een downstream effector van RGA in de interferon-signaalcascade, werd eveneens waargenomen. Bovendien was de expressie van interferon bèta in niet-geïnfecteerde, getransfecteerde controlecellen niet detecteerbaar.

Terwijl die van MXA en het downstream responsgen voor interferon bèta minimaal was. Hier worden de gegevens van een tweede transfectie van DCS met rigi-targeting irna getoond, uitgevoerd zoals in de vorige figuur. Echter, alle cellen zijn geïnfecteerd met NDV en er is een aanvullende controle toegevoegd met niet-geresecteerde monocyten-DCS.

De resultaten van de gen-silencing waren vergelijkbaar met die in de vorige figuur waargenomen. Een western blot voor RGA onthulde dat de eiwitexpressie van dit gen volledig was geblokkeerd. Banen één en twee tonen gegevens van lysaten van niet-gereseceerde cellen.

Baan drie en vier tonen lysaten van cellen die met glow irna zijn getransfecteerd en baan vijf en zes tonen lysaten van cellen die zijn getransfecteerd met RIG I-targeterende S Irna. Zodra deze techniek onder de knie is, kan deze in één uur worden uitgevoerd, inclusief het gelijktijdig uitschakelen van meerdere genen.