Bioengineering van Humanized Botmarg Microenvironments in Mouse en hun visualisatie door Live Imaging
1 augustus 2017
Een methode om verschillende gehumaniseerde beenmergnissen in muizen te creëren en te leven, wordt gepresenteerd. Op basis van de ondersteunende niche die door menselijke mesenchymale cellen is gecreëerd, induceert de toevoeging van menselijke endotheelcellen de vorming van menselijke vaten, terwijl de toevoeging van rhBMP-2 de vorming van chimerisch volwassen weefsel van humane muizen veroorzaakt.
Het algemene doel van deze methode is om menselijke celdragersteunen in muizen te implanteren om gehumaniseerde beenmergnissen te creëren en vervolgens het gedrag van de menselijke cellen binnen de implantaten live te beeldvormen. Deze methode zal helpen om belangrijke vragen in het menselijke hematopoietische veld te beantwoorden omdat het mogelijk maakt om te reproduceren en live te beeldvormen met een resolutie van één cel verschillende componenten van het beenmerg. De veelzijdigheid van dit systeem is een van de belangrijkste voordelen, omdat het mogelijk maakt om verschillende nichecomponenten één voor één of in combinatie te implanteren.
Deze methodologie kan mogelijk worden toegepast op andere onderzoeksgebieden, zoals tumormetastase of geneesmiddelenonderzoek. Gebruik de juiste steriele techniek, begin door een gesteriliseerde gelatinespons in 24 stukken van vergelijkbare grootte te snijden. Reconstitueer de gelatinescheuten door ze onder te dompelen in ethanol en vervolgens in PBS.
Dab vervolgens voorzichtig elke schotel op een steriele doek om het overtollige vocht te verwijderen en breng de schildpadden over in afzonderlijke putjes van een ultralage aanhechting 24-wellsplaat. Injecteer met een insulinesyringe voorzichtig één keer 10 tot de vijfde tot één keer 10 tot de zesde stromale cellen in 50 microliters kweekmedium in elke schotel en plaats de plaat in een celkweekincubator. Zorg er bij het injecteren van de cellen in de schotel voor dat er geen lekkage uit de schotel komt.
Na één uur vult u elke put met drie milliliter vers kweekmedium en plaatst u de schildpadden terug in de incubator. Na 24 uur injecteert u één keer 10 tot de vijfde hematopoëtische cellen in de schildpadden, gevolgd door incubatie en verdere media-toevoeging, en 24-urige incubatie zoals net gedemonstreerd. Voor het genereren van recombinante menselijke botmorfogenetische eiwit twee dragersschildpadden, plaatst u de gereconstitueerde schildpadden in afzonderlijke putjes van een U-bodem 96-wellsplaat en voegt u vijf microliters recombinant menselijk botmorfogenetisch eiwit twee toe aan elke schotel.
Bedek vervolgens de schildpadden met 20 microliters trombine en 20 microliters fibrinogeen. Voor chirurgische implantatie van de bio-engineered schildpadden, scheer eerst het chirurgische gebied op de rug van de experimentele muis en gebruik een wattenstaafje gedrenkt in verdunde chloorhexidine om het blootgestelde huidoppervlak drie keer in elke richting te reinigen. Gebruik vervolgens steriele pincetten en een scalpel om een 0,5 tot 0,7 centimeter voorste tot achterste incisie in de huid te maken en steek de pincetten onder het onderhuidse weefsel om een zakje te maken.
Breng de schotel diep in de zak en sluit de incisie met chirurgische lijm. Laat de geïmplanteerde schildpadden zich gedurende acht tot 24 weken ontwikkelen voordat ze worden verwijderd. Na intraveneuze toediening van fluorescerende stoffen en euthanasie van de dieren, steriliseert u de huid zoals net gedemonstreerd en maakt u een longitudinale huidsnede op de rug van het dier, dicht bij de oorspronkelijke implantatieplaats.
Scheiden zorgvuldig de huid van de subcutane zak waar de schotel werd geïmplanteerd en gebruik vervolgens pincetten om voorzichtig de schotel vast te grijpen en voorzichtig de resterende membraan en weefsels rond de schotel door te snijden om de structuur te herstellen. Gebruik snelhardende kleefstof om de schotel vast te zetten op een 35 bij 10 milliliter petrischaal. Voor botmorfogenetisch eiwit twee schildpadden, voordat u de plaat vult met PBS, gebruikt u een chirurgische microboor onder een microchirurgische microscoop om het botoppervlak te verdunnen, waardoor visualisatie van de fluoroforen en hoge resolutie opname van de beelden mogelijk wordt.
Wees vooral voorzichtig tijdens het boorproces omdat de dikte van het bot typisch varieert tussen schildpadden en het is belangrijk om het oppervlak niet te breken. Vul de schaal met PBS op kamertemperatuur. Voor 2-foton microscopie beeldvorming van de bio-engineered schildpadden, plaats de schotel op de confocale microscoopstandaard en selecteer de 20 keer 1,0 NA waterimmersielens.
Selecteer vervolgens in de acquisitiemodus van de beeldvormingssoftware het vakje handmatige hulpmiddelen tonen. Schakel in het lasermenu de 2-foton laser in en laat de laser opwarmen en stabiliseren. Wanneer de laser klaar is, activeert u in het beeldinstellingsmenu de kanaalmodus en schakelt u track every frame.
Selecteer in het lichtpadmenu non descanned en main beam splitter MBS 760 plus. Activeer de vier niet-descanned detectoren en stel de configuratie in zoals geïllustreerd in de schematische weergave. In het kanalenmenu stelt u de lasergolflengte in op 890 nanometer en het vermogen op 50%. Stel de gain master in op 500 tot 600, de digitale offset op nul en de digitale gain op 15 voor elk kanaal.
Stel in de acquisitiemodus de juiste parameters in voor het verkrijgen van hoge resolutie beelden zonder het weefsel te beschadigen en de fluoroforen te bleken. Stel vervolgens de zoom in op één voor de eerste scan van het beeld. Wanneer alle parameters zijn ingesteld, laat de lens zakken tot het de zoutoplossing raakt en stel handmatig de lensfocus in met behulp van een lamp als lichtbron.
Activeer nu het Z-stack menu en selecteer de eerste laatste functie. Stel het vereiste interval in tussen twee achtereenvolgende plakjes en selecteer live om een live scan van het monster te beeldvormen, waarbij u de digitale gain en digitale offset indien nodig aanpast voor een optimale belichting. Om meerdere kanalen tegelijkertijd te visualiseren, selecteert u de split functie.
In het stagesmenu, terwijl u in de live modus bent, scant u het beeld en markeert u de interessante gebieden, zoals de locatie van beenholtes. Wanneer de monsterscan voltooid is, gaat u naar het eerste gebied van belang en gebruikt u de functies eerste instellen en laatste instellen in de live modus om de boven- en onderkant van de 3D Z-stack rond het gebied van belang in te stellen. Stel vervolgens het centrum, C, in en klik op de knop experiment starten om de Z-stack beeldacquisitie van het gebied van belang te
Overzicht
Dit artikel presenteert een methode voor het creëren en live-beelden van gehumaniseerde beenmergnissen in muizen. De aanpak omvat de implantatie van humane celdragende scaffolds, waardoor de observatie van menselijk celgedrag binnen de implantaten mogelijk wordt.
Belangrijke studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschappen
- Beenmergonderzoek
- Cellulaire beeldvorming
Achtergrond
- Gehumaniseerde beenmergnissen zijn cruciaal voor het bestuderen van hematopoëse.
- De interactie tussen menselijke mesenchymale en endotheelcellen is belangrijk voor vascularisatie.
- Live beeldvorming met single-celresolutie biedt inzichten in cellulaire dynamica.
- Deze methodologie heeft potentiële toepassingen in verschillende onderzoeksgebieden.
Doel van het onderzoek
- Om een methode te ontwikkelen voor het implanteren van humane celscaffolds in muizen.
- Om live beeldvorming van menselijke cellen in een gecontroleerde omgeving mogelijk te maken.
- Om de vorming van humaan-muis chimerisch botweefsel te onderzoeken.
Gebruikte methoden
- Bereiding van gelatine scaffolds voor celimplantatie.
- Injectie van stromale en hematopoietische cellen in de scaffolds.
- Chirurgische implantatie van scaffolds in muizen.
- 2-foton microscopie voor live beeldvorming van de geïmplanteerde scaffolds.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle creatie van gehumaniseerde beenmergnissen in muizen.
- Verbeterde vascularisatie waargenomen met menselijke endotheelcellen.
- Vorming van chimerisch volwassen botweefsel bevestigd.
- Methodologie maakt veelzijdige experimenten met nichecomponenten mogelijk.
Conclusies
- De methode biedt een waardevol hulpmiddel voor het bestuderen van humane hematopoëse.
- Live beeldvorming maakt real-time observatie van cellulaire interacties mogelijk.
- Deze aanpak zou kunnen worden aangepast voor andere onderzoeksgebieden, inclusief geneesmiddelenonderzoek.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
This method enables biopharma researchers to model human hematopoietic stem cell interactions within a tunable bone marrow microenvironment, supporting target validation and mechanistic de-risking in hematologic drug discovery. Live imaging at single-cell resolution provides quantitative readouts for assessing compound effects on cell engraftment, differentiation, and niche interactions, improving predictive confidence in preclinical models. The system’s versatility allows for systematic interrogation of stromal components, facilitating assay development and translational biomarker discovery in leukemia, lymphoma, and bone marrow failure disorders.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables functional interrogation of human hematopoietic stem cell behavior in response to stromal signals, supporting target hypothesis testing.
- Operational Value: Provides a reproducible system to assess how niche components influence HSC quiescence, self-renewal, and differentiation.
- Scientific Value: Supports mechanistic de-risking by visualizing human-mouse chimeric tissue formation and cellular crosstalk in situ.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantifiable imaging outputs such as vascularization density, engraftment levels, and cavity formation for compound screening.
- Operational Value: Standardized scaffold preparation and implantation enable scalable, reproducible assays across multiple conditions.
- Scientific Value: Facilitates preparation of validated biological systems for downstream drug screening and phenotypic screening workflows.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Models disease-relevant human bone marrow microenvironment to study malignant hematopoiesis and therapy resistance.
- Operational Value: Supports longitudinal tracking of human cell engraftment over 8–24 weeks, enabling chronic preclinical studies.
- Scientific Value: Enhances translational continuity by allowing retrieval of live cells post-imaging for further functional analysis.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from early target validation through preclinical evaluation, particularly for hematologic malignancies and bone marrow-targeted therapies.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of stromal factors influencing HSC fate decisions and malignant transformation.
- Screening: Enables assay readiness through standardized, vascularized humanized niches with quantifiable imaging endpoints.
- Analytics: Provides high-resolution, multiplexed imaging data on cell localization, vessel formation, and tissue architecture for comparative condition analysis.
- Translational Research: Models human-specific niche interactions relevant to preclinical validation of hematopoietic therapies.
- Enterprise Reuse: Platform adaptability allows reuse across multiple projects by varying stromal, endothelial, or hematopoietic cell inputs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence by reducing reliance on xenograft models lacking human stromal context.
- Operational Value: Enhances reproducibility through standardized scaffold fabrication and implantation procedures.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing mechanistic insights into drug effects on niche-HSC interactions.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of compounds based on effects on engraftment, differentiation, and niche remodeling.
Implementation Considerations
- Requires expertise in sterile cell culture, microsurgical implantation, and two-photon microscopy operation.
- Dependent on access to two-photon microscopes with non-descanned detectors and appropriate laser tuning (e.g., 890 nm).
- Necessitates cross-team standardization between cell biology, imaging, and animal surgery teams for consistent scaffold preparation.
- Adaptation considerations include varying human cell sources (e.g., patient-derived HSCs, stromal lines) and niche components (BMP2, endothelial cells).
- Practical limitations include human-mouse chimera formation and variability in scaffold integration, which may affect imaging consistency.
