Bioengineering van Humanized Botmarg Microenvironments in Mouse en hun visualisatie door Live Imaging

Het algemene doel van deze methode is om menselijke celdrager-scaffolds in muizen te implanteren om gehumaniseerde beenmergniches te creëren en vervolgens het gedrag van de menselijke cellen binnen de implantaten in vivo te beeldvormen. Deze methode zal helpen bij het beantwoorden van kernvragen in het menselijke hematopoëtische veld, omdat het mogelijk maakt om verschillende componenten van het beenmerg te reproduceren en in vivo te beeldvormen met een resolutie op enkelcelniveau. De veelzijdigheid van dit systeem is een van de belangrijkste voordelen, aangezien het de implantatie van verschillende nichecomponenten één voor één of in combinatie mogelijk maakt.

Deze methodologie zou potentieel toegepast kunnen worden op andere onderzoeksgebieden, zoals tumormetastase of studies naar drugscreening. Begin met het snijden van een gesteriliseerde gelatinespons in 24 stukken van vergelijkbare grootte, waarbij de juiste steriele techniek wordt gehanteerd. Reconstitueer de gelatinescaffolds door onderdompeling in ethanol en vervolgens in PBS.

Dep vervolgens elk scaffold voorzichtig af op een steriel tissue om overtollige vloeistof te verwijderen en breng de scaffolds over naar individuele wells van een 24-wells plaat met ultra-lage hechting. Injecteer met een insulinespuit voorzichtig 1 x 10⁵ tot 1 x 10⁶ stromale cellen in 50 µL kweekmedium in elk scaffold en plaats de plaat in een celkweekincubator. Let er bij het injecteren van de cellen in het scaffold op dat er geen lekkage uit het scaffold optreedt.

Vul na één uur elke put bij met drie milliliters vers celcultuurmedium en plaats de scaffolds terug in de incubator. Injecteer na 24 uur 1 × 10⁵ hematopoëtische cellen in de scaffolds, gevolgd door incubatie en verdere toevoeging van medium, en een incubatie van 24 uur zoals zojuist gedemonstreerd. Voor de generatie van carrier-scaffolds met recombinant humaan botmorfogenetisch proteïne 2, plaats de gereconstitueerde scaffolds in individuele putten van een U-bodem 96-wells plaat en voeg vijf microliters recombinant humaan botmorfogenetisch proteïne 2 toe aan elke scaffold.

Bedek de scaffolds vervolgens met 20 µL trombine en 20 µL fibrinogeen. Voor de chirurgische implantatie van de bio-engineered scaffolds wordt eerst het chirurgische gebied op de rug van de experimentele muis geschoren; gebruik daarna een wattenstaafje gedoopt in verdunde chloorhexidine om het blootgelegde huidoppervlak drie keer in elke richting te reinigen. Maak vervolgens met een steriele pincet en een scalpel een incisie van 0,5 tot 0,7 cm in de huid van anterieur naar posterieur, en breng de pincet onder het subcutane weefsel om een pocket te creëren.

Plaats het steunmateriaal diep in de pocket en sluit de incisie met chirurgische lijm. Laat de geïmplanteerde steunmaterialen acht tot 24 weken rijpen voordat ze worden geëxplanteerd. Na intraveneuze toediening van fluorescerende stoffen en euthanasie van de dieren, steriliseert u de huid zoals zojuist gedemonstreerd en maakt u een longitudinale huidincisie op de rug van het dier, nabij de oorspronkelijke implantatieplaats.

Scheid de huid voorzichtig van de subcutane pocket waar de scaffold is geïmplanteerd, gebruik vervolgens een pincet om de scaffold voorzichtig vast te pakken en snijd het resterende membraan en de weefsels rondom de scaffold zorgvuldig door om de structuur te bergen. Gebruik snelhardende lijm om de scaffold te bevestigen aan een Petri-schaal van 35 bij 10 milliliter. Voor scaffolds met bone morphogenetic protein two dient men, voordat de plaat met PBS wordt gevuld, een chirurgische microbeur onder een microsurgical microscoop te gebruiken om het botoppervlak dunner te maken, zodat de fluorforen zichtbaar worden en beelden met een hoge resolutie kunnen worden vastgelegd.

Wees bijzonder voorzichtig tijdens het boren, omdat de dikte van het bot doorgaans varieert tussen de scaffolds en het belangrijk is om het oppervlak niet te breken. Vul het schaaltje met PBS op kamertemperatuur. Voor 2-foton microscopie-imaging van de bio-engineered scaffolds plaatst u de scaffold op de tafel van de confocale microscoop en selecteert u de 20 keer 1.0 NA waterimmersielens.

Select vervolgens in de acquisitiemodus van de imagingsoftware het selectievakje 'handmatige tools tonen'. Schakel in het laser-menu de 2-fotonenlaser in en laat de laser opwarmen en stabiliseren. Wanneer de laser gereed is, activeert u in het menu voor de imaging-instellingen de kanaalmodus en de optie 'elk frame track wisselen'.

Selecteer in het menu voor het lichtpad 'non descanned' en de hoofdstraalsplitser 'MBS 760 plus'. Activeer de vier non-descanned detectoren en stel de configuratie in zoals weergegeven in het schema. Stel in het kanalenmenu de lasergolflengte in op 890 nanometer en het vermogen op 50%. Stel de gain master in op 500 tot 600, de digitale offset op nul en de digitale gain op 15 voor elk kanaal.

Stel in de acquisitiemodus de juiste parameters in om beelden met een hoge resolutie te verkrijgen zonder het weefsel te beschadigen of de fluorforen te bleken. Stel vervolgens de zoom in op één voor de initiële scan van het beeld. Wanneer alle parameters zijn ingesteld, wordt de lens verlaagd tot deze de zoutoplossing raakt, waarna de focus van de lens handmatig wordt ingesteld met een lamp als lichtbron.

Activeer nu het Z-stack-menu en selecteer de functie first last. Stel het gewenste interval tussen twee opeenvolgende coupes in en selecteer live om een live scan van het monster te maken, waarbij de digitale gain en digitale offset naar behoefte worden aangepast voor een optimale belichting. Selecteer de split-functie om meerdere kanalen tegelijkertijd te visualiseren.

Scan in de live-modus via het menu van de objecttafel het beeld en markeer de regio's van belang, zoals de locatie van botcaviteiten. Zodra de scan van het monster is voltooid, gaat u naar de eerste regio van belang en gebruikt u de functies 'set first' en 'set last' in de live-modus om de boven- en onderkant van de 3D Z-stack rondom het gebied van belang in te stellen. Stel vervolgens het centrum, C, in en klik op de knop 'start experiment' om de Z-stack beeldacquisitie van de regio van belang te starten.

Wanneer de acquisitie is voltooid, slaat u de beelden op in de daarvoor bestemde map en scant u het volgende interessegebied. In deze representatieve beelden kan de grove morfologie van verschillende scaffolds worden waargenomen die acht weken na implantatie zijn teruggewonnen uit immuundeficiënte NSG-muizen. Co-seeding met menselijke endotheelcellen verhoogt de vascularisatie van de scaffold, terwijl de toevoeging van recombinant menselijk botmorfogenetisch proteïne twee botvorming induceert.

Deze steigers, gevisualiseerd met live 2-fotonenmicroscopie, onthullen de aanwezigheid van bloedvaten in de steigers en de langdurige ingroei van menselijke hematopoëtische cellen in het parenchym van de steiger. Steigers gezaaid met menselijke endotheliale en mesenchymale stromale cellen illustreren de deelname van de menselijke endotheliale cellen aan de vorming van vaten binnen de steiger, wat resulteert in een muis-mens chimerische vasculatuur. De vorming van botweefsel kan worden gevisualiseerd met 2-fotonenmicroscopie, evenals de vorming van holtes in de gehumaniseerde vasculatuur in het endostale weefsel, dat sterk lijkt op endostaal beenmergweefsel.

Verder vertoont de morfologie van het weefsel binnen de dragers met recombinant menselijk botvormend eiwit twee gelijkenis met volgroeid beenmerg met vetweefsel, wat suggereert dat de menselijke mesenchymale stromale cellen ook bijdragen aan de vorming van vetweefsel. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van alle bio-engineering en de belangrijkste muisscaffolds. Denk eraan om altijd een aseptische omgeving te handhaven en wees extra voorzichtig bij het hanteren van de scaffolds.

Houd rekening met de beperkingen die verbonden zijn aan deze methode, zoals mens-muis-chimeren van de weefsels. Onthoud dat monsters na beeldvorming kunnen worden gebruikt voor verdere studies, aangezien de scaffolds kunnen worden afgebroken en levende cellen er derhalve uit kunnen worden teruggewonnen.