Name: Bioengineering van Humanized Botmarg Microenvironments in Mouse en hun visualisatie door Live Imaging (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-08-01T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 3 s
Description: Leer hoe je menselijke beenmergniches bioengineert in muizen met behulp van gelatinescaffolds en levende celimaging. Deze methode maakt real-time observatie van hematopoëtische celdynamiek op enkelcelresolutie mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Wij bedanken het personeel in de kernfaciliteiten bij het Francis Crick Institute (Biologische Onderzoeksfaciliteit, In Vivo Imaging and Experimental Histopathology) en Yolanda Saavedra-Torres en Mercedes Sanchez-Garzon, de dierenartsen bij Crick en LRI, voor hun waardevolle hulp. Wij zijn dankbaar voor Dr. W. Gray voor het kritisch lezen van het manuscript. DP werd ondersteund door een non-clinical research fellowship van de EHA. Dit werk werd ondersteund door The Francis Crick Institute, dat haar kernfinanciering ontvangt van Cancer Research UK (FC001045), de UK Medical Research Council (FC001045) en de Welcome Trust (FC001045).

Alle dierproeven werden uitgevoerd onder PPL 70/8904, goedgekeurd door het UK Home Office en overeenkomstig de richtlijnen van Cancer Research UK. Het gebruik van humaan navelstrengbloed (UCB) en primaire humane acute myeloïde leukemie (AML) -monsters werd goedgekeurd door het Ethische Comité van East London na toestemming en werd uitgevoerd overeenkomstig de Verklaring van Helsinki. 1. Bioengineering Collagen-gebaseerde Steigers met Humane Hematopoietische en Stroomcellen OPMERKING: Het gehele protocol moet worden uitgevoerd in steriele omstandigheden en met steriel materiaal. Celcultuurmedium 1 komt overeen met hMSC-medium (MEM-a, P / S en 10% hMSC-FBS); Celcultuurmedium 2 komt overeen met EC-medium (M199, 20% FBS, P / S, 10 mM HEPES, 50 μg / ml heparine, 2 mM glutamine en 50 μg / ml ECGS) en celkweekmedium 3 komt overeen met hematopoietisch celmedium (H5100 En P / S). <ol><li> Bereiding navelstrengbloed mOnonucleaire cellen (CB-MNC&#39;s) of primaire AML (beenmerg of perifere bloed MNC&#39;s) met behulp van een Ficoll-Paque dichtheidsgradiënt, volgens bekende protocollen 53 . <ol><li> Voor AML, verwijder de T-cellen met behulp van OKT.3-antilichaam. Incubeer 4 μg OKT.3 per 1 x 10 6 AML MNCs gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur voordat u de cellen in PBS wassen. Indien nodig, cryopreserve de MNC&#39;s in FBS met 10% DMSO bij 2 x 10 8 cellen per ml. </li></ol></li><li> Bereid hMSC (cultuurmedium 1) en EC (cultuurmedium 2) celculturen op. Plate hMSC-cellen (zie de tabel van materialen ) op reguliere celkweekflessen in hMSC-medium. Plate ECs (zie de Tabel van Materialen ) op collageen 1-beklede oppervlakken in EC-medium. </li><li> 85-90% celconfluentie Verwijder het medium tweemaal wassen met PBS en voeg trypsine-EDTA-oplossing (20 ui per cm2). <ol><li> Controleer na 5 minuten dat cellen losgelaten zijn. Herstel de cellen door 1:3 met celcultuurmedium. Centrifugeer bij 300 xg gedurende 5 minuten en opnieuw opschorten in het bijbehorende medium voor elk celtype en tel de cellen met een Neubauer kamer. </li><li> Gebruik cellen bij 2 x 10 6 - 10 7 cellen per ml. Als beide celtypes samen moeten worden gebruikt, meng dan de hMSC- en EC-suspensies in een 1: 1-verhouding. </li></ol></li><li> Zet de celsuspensie over op een insulinspuit. </li><li> Met behulp van een scalpel, snijd de gelamineerde gelatine spons ( bijv. Gelfoam) eerste steiger (20 mm x 60 mm x 7 mm) in 24 stuks van gelijke grootte (6,6 mm x 7,5 mm x 7 mm, figuren 1A en B ). </li><li> Reconstitute gelatine steigers door onderdompeling in PBS (5 min). </li><li> Eén voor één zet de steigers zachtjes op een steriel weefsel om overtollige PBS te verwijderen. Breng de steigers over naar een putje van een 24-putjesplaat (ultra-lage bevestigingsoppervlak) en gebruik de injectiespuit om 50 μL bevattende 10 5 - 10 6 cellen (hMSC alÉén of in combinatie met hEC; Figuur 1C ). </li><li> Herhaal stap 1.7 met elke steiger totdat alle benodigde steigers worden geplant met stromale cellen. </li><li> Incubeer gedurende 1 uur in een celcultuur incubator (37 ° C en CO 2 5%). </li><li> Vul elk goed met 3 ml celkweekmedium 1 ( Figuur 1D ) en stuur de steigers terug naar een celcultuur-incubator (37 ° C en CO 2 5%) gedurende de incubatie gedurende de nacht. Gebruik celcultuurmedium 2 als EC&#39;s in de steigers gebruikt worden. </li><li> Ontdooi CB-MNC&#39;s en isoleer CD34 + cellen van hen na een geschikt CD34 + sectie kit protocol. Scherp de geselecteerde CD34 + cellen in medium 3 en tel ze in een Neubauer kamer. OPMERKING: Hier werden cellen gebruikt bij een concentratie van 2 x 10 6 cellen per ml. <ol><li> Als AML-patiënt afgeleide primaire monsters worden gebruikt, doe de cellen op, verdun ze 1:10 in FBS, centrifugeer ze gedurende 5 minuten op 300Xg, de cellen resuspenderen in PBS-2% FBS, voeg anti-humaan CD3-antilichaam toe (2 - 4 μg per 10 6 cellen) en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten. Centrifugeer gedurende 5 minuten bij 300 xg en resuspendeer in hematopoietische celmedium aangevuld met cytokinen (20 ng / ml granulocyt-kolonistimulerende factor (G-CSF), 20 ng / ml IL-3 en 20 ng / ml trombopoietine (TPO)) . </li></ol></li><li> Herhaal stappen 1.7 - 1.9, maar in dit geval zaaien 1 x 10 5 humane hematopoietische cellen in plaats van stromale componenten, zoals hierboven. <ol><li> Vul de put met 3 ml celkweekmedium 3 ( Figuur 1D ) en stuur de steigers terug naar een celcultuur-incubator (37 ° C en CO 2 5%) gedurende de incubatie gedurende de nacht. Gebruik een 1: 1 mix van celcultuurmedia 2 en 3 Als EC&#39;s in de steigers gebruikt worden. </li></ol></li><li> Voor alleen recombinant humane botmorfogenetische eiwit-2 (rhBMP-2) dragerschalen, zet de steigers een voor een voorzichtig op een steriel weefsel om overtollige P te verwijderen.BS. Breng de steigers over naar een putje van een u-bodem, 96-putjesplaat ( Figuur 1E ) en voeg 5 μL rhBMP-2 toe, waarbij de steiger grondig wordt bedekt. <ol><li> Voeg 20 μL trombine toe, gevolgd door 20 μl fibrinogeen, waarbij de steiger elke keer grondig bedekt wordt ( Figuur 1F ). Herhaal de procedure voor elke steiger totdat alle benodigde steigers worden behandeld en 5 tot 10 minuten bij 37 ° C incuberen. Controleer of stolling succesvol is gevormd. </li></ol></li></ol> 2. Chirurgische implantatie van Bioengineered Steigers OPMERKING: hier werden mannelijke of vrouwelijke, 6- tot 12-weken oude NSG-muizen gebruikt. Aangezien de dieren immunodeficiënt zijn, dienen alle procedures in steriele omstandigheden te worden uitgevoerd. Stappen 2.10 - 2.13 zijn gerelateerd aan overlevingsstrategieën en post-chirurgische zorg. <ol><li> 60 - 120 minuten voor de operatie, ondergaan pijnstillend medicatie (carprofen, 5 mg / kg lichaamsgewicht / muis) onder de huid.</li><li> Induceren anesthesie in een kamer met 0,5% isofluraan en 2 l / min O2. Muizen moeten continu worden gecontroleerd tijdens de procedure. Verplaats het dier naar het chirurgische gebied in slechte positie om de rug gemakkelijk te kunnen bereiken. Houd het dier onder narcose via een neuskegel toevoeren 1,5% isofluraan en 2 l / min O2. Houd de muis onder de verdoving tijdens de chirurgische procedure en controleer de dierlijke toestand regelmatig. </li><li> Terwijl het onder anesthesie is, gebruik oogmisk gel in de ogen van de muis om droogheid te voorkomen en houd de muis bij 37 ° C. </li><li> Scheer de chirurgische ruimte aan de achterkant van de muis met behulp van een elektrische trimmer. Om de huid te steriliseren, doe een katoenen tip in verdunde clorexidine (verdund 1:10 in PBS) en gebruik deze tip om het huidoppervlak te reinigen. Herhaal deze procedure tweemaal. </li><li> Met behulp van steriele tang en een scalpel (of een schaar), maak een 0,5 tot 0,7 cm anterior-to-posterior volledige insnijding van de huid. Gebruik de ingevoerde pincetOnder het subcutane weefsel om een ​​zak te maken. </li><li> Steek de steiger subcutaan in, zorg ervoor dat het diep in de zak zit ( Figuur 1G en H ). Sluit de incisie met chirurgische lijm ( Figuur 1I en J ). </li><li> Om post-chirurgische pijn te behandelen, moet buprenorfine (0,1 mg / kg lichaamsgewicht) subcutaan toegediend worden. </li><li> Plaats tijdens het herstel het dier aan de zijkant in een voorverwarmde kooi en controleer het herstel tot het normale gedrag wordt waargenomen. </li><li> Verdun pijnstillende medicatie in water (carprofen, 0,1 mg / ml water) en geef het aan dieren als drinkwater gedurende 4 dagen na de operatie. </li><li> Controleer het dier en de wond regelmatig gedurende de 48 uur na de operatieperiode voor mogelijke bijwerkingen. </li></ol> 3. Muisbehandelingen, Euthanasie, en Sample Retrieval voor Imaging OPMERKING: Analyse van de steigers wordt uitgevoerd tussen8 en 24 weken na implantatie. <ol><li> 60 minuten voor beeldvorming, houd de geïmplanteerde muis warm in een verwarmingsbox bij 37 ° C en injecteer 100 μL humaan immunoglobuline intravenously om onspecifieke plaatsen te blokkeren. </li><li> 30 min voor beeldvorming, intravenously toedienen 10 μg (per muis) van specifieke antilichamen om de cellen van belang te labelen. </li><li> 5 minuten voor beeldvorming, toediening 15 μL (verdund in 100 μl PBS) van 655 nm fluorofoor gelabeld, vaatpoolmiddel (655-VPA) voor het visualiseren van vasculaire structuren. </li><li> Euthanize de muis via cervicale dislocatie. </li><li> Gebruik een scherpe schaar, maak een longitudinale huidinsnijding op de achterkant van de muis, in de buurt van de oorspronkelijke implantatieplaats. </li><li> Met behulp van een pincet en een schaar, scheid de huid zorgvuldig van de subcutane zak waar de steiger geïmplanteerd is. </li><li> Houd de steiger met pincet vast en ontkiem het zachtjes uit de huid door het resterende membraan a te snijdenNd weefsel rond de steiger met behulp van een schaar. Zie voorbeelden van steigers die worden hersteld in Figuur 2 . </li><li> Bevestig de steiger met snelwerkende kleeflijm aan een afbeeldingsplaat (een 35 mm x 10 mm Petri-schotel) en vul deze op met zoutoplossing (PBS) bij kamertemperatuur. </li><li> Voor BMP-steigers, voordat u de plaat met PBS invult, gebruik een chirurgische microdrill om het botoppervlak te dunken onder een microchirurgische microscoop; Dit maakt het mogelijk om visualisatie van fluorofore en beeldopname met hoge resolutie te maken. Gebruik de 1.2 of 1.6 mm burren, afhankelijk van de grootte van de steiger. OPMERKING: De gebruiker zal beseffen hoeveel te boren, afhankelijk van de dikte van het bot. In het algemeen, aangezien de BMP-stellingen vascularized zijn, verandert het bot licht en verandert het rood wanneer het de juiste dikte voor beeldvorming nadert. </li><li> Plaats de plaat op het stadium van de confocale microscoop. </li></ol> 4. Live-imaging met behulp van twee-foton microscopy OPMERKING: Gebruik bij gebruik van niet-afgedankte detectors (NDD) altijd de NDD-schuifregelaar voor beeldvorming om de fluorescentie naar de NDD te leiden. De configuratie van de microscoop is verschaft in figuur 3 . <ol><li> Schakel de microscoop en de computer in, start de software door te klikken op &quot;Start systeem&quot; en ga naar de modus &quot;Acquisitie&quot;. </li><li> Tik op het vak &#39;Show manual tools&#39;. In de &quot;Laser&quot; -menu schakel de twee-foton-laser aan en laat het opwarmen en stabiliseren. </li><li> Activeer tegelijkertijd &quot;Kanaalmodus&quot; en &quot;Schakel elk frame in.&quot; Selecteer in het menu &#39;Lichtpad&#39; de optie &#39;Niet Descanned&#39; en &#39;Main Beam Splitter MBS 760+&#39;. Tik op om de vier NDD&#39;s te activeren en de configuratie in te stellen, zoals afgebeeld in Figuur 3 . OPMERKING: Met deze configuratie wordt het collageensignaal van botstructuren (secOnd harmonische generatie, SHG) wordt verzameld bij 380 - 485 nm, FITC-hCD31 + menselijke endotheelcellen en AF488-hCD45 + humane hematopoietische cellen bij 500-550 nm en 655-VPA bij 640 - 690 nm. </li><li> Stel in het menu &#39;Kanalen&#39; de &#39;laserlengte&#39; in op 890 nm en de stroom tot 50%. Stel de &quot;Gain (Master)&quot; in op 500-600, de &quot;Digital Offset&quot; op 0 en de &quot;Digital Gain&quot; op 15 voor elk kanaal. Pas deze waarden aan zodra de aanschaf is gestart. </li><li> Stel in de &#39;Acquisition Mode&#39; de vereiste parameters in om beelden met hoge resolutie te verkrijgen zonder het weefsel te beschadigen en de fluorophoren te bleken. Stel &quot;Scan-modus&quot; in op &quot;Frame&quot;, &quot;Frameformaat&quot; naar &quot;x512 y512,&quot; Line Step &quot;tot 1,&quot; Speed ​​&quot;tot 9,&quot; Gemiddeld getal &quot;tot 8,&quot; Bitdiepte &quot;naar&quot; 8 Bit &quot; Modus &quot;naar&quot; regel, &quot;&quot; richting &quot;naar&quot; bidirectioneel &quot;en&quot; methode &quot;om&quot; te betekenen &quot;. <ol><li> Zet de &quot;ZoOm &quot;naar 1 voor de eerste scan van de afbeelding, en verhoog het indien nodig om op bepaalde gebieden te concentreren. </li></ol></li><li> Plaats de plaat die het steiger op de microscoopstadium bevat onder de 20X, 1.0 NA waterdempingslens en laat de lens zakken tot het de zoutoplossing raakt. Zet de focus van de lens op de steiger met behulp van de microscoop-oculairen, met behulp van een lamp als de lichtbron. </li><li> Activeer het menu &quot;Z-stack&quot;, selecteer de &quot;First / Last&quot; -functie en stel het gewenste interval in tussen twee achtereenvolgende segmenten ( bijvoorbeeld 2-μm Z-stack). Houd de intervallen constant in de Z-stapel. </li><li> Selecteer &#39;Live&#39; om een ​​live scan van het monster te maken en pas de &#39;Digital Gain&#39; en &#39;Digital Offset&#39; aan voor een optimale belichting. Om tegelijkertijd meerdere kanalen te visualiseren, selecteert u de &quot;Split&quot; -functie. </li><li> In het &quot;Stage&quot; menu, in de modus &quot;Live&quot;, scan de afbeelding en &quot;Markeer&quot; regio&#39;s van interEst (ROI), zoals de locatie van humane hematopoietische cellen en vasculaire structuren. Wanneer de scan van het monster is voltooid, ga dan naar de eerste ROI om afbeeldingen te starten. </li><li> Stel in de modus &quot;Live&quot; de boven- en onderkant van de 3D-Z-stack rondom het bezienswaardigheid in met behulp van de &quot;Set first&quot; en &quot;Set last&quot; functies. Zodra u klaar bent, zet u het centrum, &quot;C.&quot; Begin de overname van de ROI met de knop &quot;start experiment&quot;. Zie voorbeelden van afbeeldingen in figuur 4 , figuur 5 en figuur 6 . </li><li> Zodra de aankoop is voltooid, sla de afbeelding op in de aangewezen map. Ga naar de volgende ROI en herhaal stap 4.10. Zodra het experiment is voltooid, verwijder de afbeeldingsplaat uit de microscoop, verwijder het monster zorgvuldig uit de plaat en reinig eventuele resterende lijm. </li><li> Bereid het monster voor de volgende analyse techniek. </li></ol> 5. ProefprocesG voor Histologie en Immunostaining OPMERKING: Monsters worden verwerkt volgens het protocol dat wordt beschreven in de algemene laboratoriumtechnieken van JoVE 54, waarbij de monsterfixatie-, embedings- en sectieprocessen worden beschreven. Botvormende monsters dienen gedurende 7 dagen behandeld te worden in een EDAL-ontkalkingsmiddel tussen de fixatie- en embedingsprocessen. De blokkerende / permeabiliseringsoplossing is 10 mM PBS pH 7,4 buffer met 1% Triton X-100, 1% boviene serumalbumine (BSA) en 10% normaal geiten serum (NGS). <ol><li> Leg de plakjes in xyleen gedurende 10 min), xyleen gedurende 5 min, 100% ethanol gedurende 5 minuten, 70% ethanol gedurende 5 minuten, 50% ethanol gedurende 5 minuten en H2O gedurende 5 minuten. </li><li> Breng de plakken over op een citraat gebaseerde antigeen ontmaskende werkoplossing. </li><li> Kook de plakken gedurende 15 minuten en laat ze afkoelen tot kamertemperatuur. </li><li> Was de plakjes in 10 mM PBS pH 7,4 oplossing met 1% Triton X-100 (5 min, 3 keer). </li><li> Verplaats de samPles aan de blokkerende / permeabiliseringsoplossing en incuberen gedurende 30 minuten. </li><li> Voeg primair antilichaam toe verdund in blokkerende / permeabiliseringsoplossing en incubeer overnacht bij 4 ° C. </li><li> Was de plakjes in 10 mM PBS pH 7,4 oplossing met 1% Triton X-100 (5 min, 3 keer). </li><li> Voeg secundair antilichaam verdund in blokkerende / permeabiliseringsoplossing gedurende 1 uur in het donker bij kamertemperatuur. </li><li> Was met H 2 O (5 min, 3 keer). </li><li> Om de achtergrondfluorescentie te verminderen, dompel de plakjes in Soedan Black werkoplossing gedurende 10 minuten, in het donker en bij kamertemperatuur. </li><li> Was de plakjes in H 2 O (5 min, 3 keer). </li><li> Monteer de plakjes met behulp van fluorescerend montagemedium met DAPI (0,5 μg / ml). </li><li> Bewaar de plakjes bij 4 ° C en controleer of het montagemedium droog is voordat u fluorescente beeldvorming uitvoert. Zie voorbeeldafbeeldingen in Figuur 7 . </li></ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

<html> Betekenis met betrekking tot bestaande methoden: In dit protocol beschreef we een methode om verschillende gehumaniseerde microomgevingen in muizen te genereren en hun architectuur te visualiseren via twee-foton microscopie en histologie. De verstrekte representatieve gegevens tonen de haalbaarheid van de aanpak aan, met behulp van verschillende stromacellen om geanimeerde weefsels te manipuleren. Het protocol heeft specifieke toepassingen op de studie van humane hematopoietische cellen en nicotine-afkomstig van beenmerg in normale en pathologische omstandigheden. Deze toepassingen omvatten de studie van klonale evolutie, drugscreening en kruisvorming tussen menselijke HSC&#39;s en stromale componenten. In het opkomende gebied van weefseltechniek zijn verschillende alternatieve benaderingen voorgesteld. Benaderingen omvatten de ontwikkeling van 3D humanized BM structuren in vitro 55 , 56 , 57 ,S = &quot;xref&quot;&gt; 58 , 59 , 60 , 61 , 62 , 63 en het orthotopische transplantaat van gehumaniseerde BM-steigers in muizen 64 . Onze aanpak heeft het voordeel om zowel de complexiteit van het in vivo systeem te combineren met de makkelijke anatomische toegankelijkheid van het gehumaniseerde weefseltransplantaat. Wijzigingen en probleemoplossing: Een bron van variabiliteit in dit protocol kan worden gevonden in de selectie van cellen die gebruikt worden om de steigers te zaaien. In ons werk hebben we BM-afgeleide hMSC&#39;s gebruikt. Mesenchymale cellen kunnen echter worden verkregen uit verschillende weefsels, die onderscheidende eigenschappen kunnen tonen afhankelijk van de oorsprong. Daarom kan het gebruik van hMSC&#39;s afgeleid van verschillende organen overwogen worden. Echter, hun vermogen om botweefsel in vivo te vormen moet worden getest voor gebruik in deze pRotocol. Dit protocol gebruikt een commercieel beschikbare menselijke endotheelcelbron ( dwz E4ORF1-getransduceerde HUVEC). Onlangs is het gebruik van orgaanspecifieke endotheelcellen voor verschillende doeleinden gerapporteerd 65 , 66 . Bovendien kan het gebruik van primaire hEC&#39;s afgeleid van de BM een interessante verbetering voor het protocol vertegenwoordigen. Daarom kan het gebruik van verschillende bronnen van endotheelcellen verschillende in vivo uitkomsten produceren. We hebben NSG-immunocompromised recipient muizen gebruikt om de implantatie van gehumaniseerde steigers te bevorderen en weefselafwijzing te vermijden. Wij uitsluiten niet de mogelijkheid om dit protocol te gebruiken om ectopische beenmergweefsels te manipuleren in andere muisstammen. Inderdaad kan rhBMP-2 botvorming in verschillende zoogdiermodellen 47 , 48 , 49 , 50 induceren <sup&gt;, 52 . Echter, verschillen in cellevendabiliteit en langetermijntransplantatie zullen waarschijnlijk worden waargenomen met behulp van verschillende stammen / modellen. De timing van het herstel van de steiger kan ook flexibel zijn, afhankelijk van het uiteindelijke doel van het experiment. In het gepresenteerde protocol herstellen we de monsters op 8-12 weken na implantatie om de langdurige hematopoietische ingreep te beoordelen. Om vroege stappen van de menselijke BM nicheformatie te bestuderen ( bijv. Osteochondrale weefselvorming 47 of vaatontwikkeling), kunnen verschillende tijdspunten worden gekozen. De live-imaging techniek die we beschreven in dit protocol zijn aangegeven voor korte termijn beeldvorming van explants. Het gebruik van een evenwichtige kamer voor het behoud van fysiologische temperatuur, zuurstofspanning en CO 2 concentratie dient in aanmerking te worden genomen bij langdurige beeldvorming, zoals het bestuderen van motiliteitsgedrag. Critical StEps in het protocol: Onder de uitdagingen die verband houden met het protocol, wijzen we op de technische vaardigheden die nodig zijn voor een aantal stappen. Mesenchymale en endotheelcellen dienen gebruikt te worden bij cijfers met lage celpassages; anders is, zullen ze niet in staat zijn om de menselijke hematopoietische cellen engraftment te ondersteunen in vivo of deel te nemen aan de novo vaatstelsel en botvorming in vivo. Wij raden aan het gebruik van hMSC&#39;s en hEC&#39;s in de passages 1 - 5. Voorbereiding van de steiger en de zaadcellen hebben basiscellencultuurvaardigheden en kennis van de eigenschappen van de specifieke cellen die in de procedure worden gebruikt. Het operatieprotocol is vrij eenvoudig maar vereist een beetje oefening. Onderhoud van een aseptische omgeving om verontreiniging van de geïmplanteerde steigers in immunodeficiënte muizen te vermijden is cruciaal om het succes van het experiment te waarborgen. Voorbeeld explant en live imaging vereisen chirurgische praktijk (vooral voor het gebruik van de microdrill) en kennis van deMicroscoop systeem. Tenslotte vereisen steekproefverwerking en histologie basiskennis van de te gebruiken technieken. Beperkingen van de techniek: De aanpak die we beschrijven maakt het mogelijk visualisatie van levende humane hematopoietische cellen die een gehumaniseerd beenmergmilieuomgeving bevinden, waarbij menselijke endotheelcellen die vasculaire structuren vormen en mesenchymale cellen vormen bot- / beenmergruimte. Aangezien het weefsel in vivo wordt gevormd, zal de uiteindelijke constructie nog steeds chimère zijn (menselijk en muizen). Dit probleem moet in aanmerking worden genomen, omdat het chimere weefsel de complexiteit en het milieu van menselijk beenmerg niet volledig kan nabootsen. De geïmplanteerde steigers hebben een beperkte grootte (we hebben een maximum van 6,6 x 7,5 x 7 mm geprobeerd) en kunnen daarom een ​​beperkt aantal cellen voor xenotransplantatie hosten. Het absolute aantal herstelde cellen zal ook beperkt zijn; Dus moet het aantal geïmplanteerde steigersBerekend als een functie van het aantal cellen dat nodig is voor het experiment. De afbeeldingsapplicatie die we hebben beschreven is bijzonder nuttig voor het observeren van grote gebieden levend weefsel op dieptes van 150-200 μm van het oppervlak zonder de architectuur te beschadigen en de cellen te beschadigen. Daarom staat het niet voor de visualisatie van de gehele steiger mogelijk. Als een volledige scan van het weefsel nodig is, zouden standaard immunofluorescentiebenaderingen meer geschikt zijn. Toekomstige Toepassingen: De toekomstige richting van dit bioengineered model zou zijn om de complexiteit van de menselijke componenten in het weefsel te verhogen. De kennis en karakterisering van de menselijke BM niche is in de afgelopen jaren gevorderd 67 en het beschreven protocol kan een interessant platform zijn om de functie van deze nieuwe cellulaire componenten en oplosbare factoren te bestuderen, evenals hun rol bij het ondersteunen van normale / maligneMier HSCs. Bovendien biedt de beeldvormingstechniek het potentieel voor intravitale beeldvorming van de steigers in longitudinale studies, die technische verbeteringen vereisen bij het imago van de steigers in levende, verdoofde muizen, met herstel na de operatie. Deze aanpak zou aanvullende stappen vereisen en is momenteel onderzocht in het laboratorium.

Cel-beslissingen die in stamcelcompartimenten worden waargenomen, worden streng geregeld door zowel intrinsieke als extrinsieke factoren. In het bijzonder wordt nu algemeen erkend dat de BM micro-omgeving een fundamentele rol speelt bij het beheersen van de schakelaar in HSC&#39;s van een rustige naar een actieve toestand, evenals in hun zelfvernieuwing of differentiatieleerbeslissing 1 . Bovendien blijkt uit recente bevindingen dat hematologische kwaadaardigheden de functie van de BM micro-omgeving beïnvloeden, wat wijst op het bestaan ​​van actieve kruisvorming tussen de twee compartimenten 2 , 3 , 4 , 5 , 6 . Ondanks recente vooruitgang blijven veel sleutelvragen over hoe de activiteit van specifieke BM-niche-componenten bijdraagt ​​aan HSC-gedrag en maligne transformatie. De BM micro-omgeving is een zeer heterogeen<html> Eenige en complexe mix van veel verschillende celtypes, elk met gespecialiseerde functies. De overvloedige endotheliale (EC) en vasculaire component regelen de omzet van het nutriënten- en metaboliet, de ingreep en uitkomst van verschillende cellen naar en van de BM, en diverse HSC-functies 7 , 8 . Mesenchymale stromale cellen (MSC&#39;s), een heterogene populatie van ongedifferentieerde stamcellen en voorlopers verricht via drie lijnen (dwz osteogene, chondrogene een adipogene), zijn een fundamenteel onderdeel van de BM niche. Deze MSC&#39;s lokaliseren zich zowel in de centrale gebieden van de BM en in de nabijheid van het endostale gebied. Zij kunnen worden geassocieerd met vasculaire structuren en zijn betrokken bij de regulering van HSC functie 9 , 10 , 11 , 12 , 13 ,&quot;&gt; 14 , 15 . Veel rapporten suggereren dat HSCs op verschillende gedefinieerde plaatsen binnen de merg verblijven en dat hun functie kan afhangen van hun precieze lokalisatie. De meeste huidige kennis over HSC&#39;s en hun interactie met de BM micro-omgeving komen uit muizenstudies 1 . Het gebruik van xenograftmodellen heeft deze kennis uitgebreid naar menselijke normale en kwaadaardige HSCs, ingrijpen in de muizen BM van immunodeficiënte muizen 16 , 17 , 18 , 19 , 20 . Hoewel dit een geldig model vertegenwoordigt, bevat het nog steeds vele uitdagingen, zoals de noodzaak om de ontvanger muis in de meeste gevallen voorwaarde te geven voor menselijke HSC homing en engraftment of de cross-species barrière en zijn slecht begrepen invloed op cel-cel interacties en functies. Het gebruik van neutraliserende antilichamen en genetisch gemodificeerde muizen, samen met xenotransplantatie, heeft bijgedragen aan het complexe dialoog dat menselijke HSC&#39;s met hun micro-omgevingen vestigen. De introductie en ontwikkeling van intravitale twee-foton confocale microscopie heeft deze studies een stap vooruit gezet, waardoor de directe, hoge resolutie en dynamische beeldvorming van het beenmerg 19 , 20 , 21 , 22 mogelijk is en een krachtig instrument voor de functionele Karakterisering van de BM micro-omgeving en zijn rol bij het reguleren van de HSC-functie. Om sommige van de problemen die zich voordoen bij klassieke xenotransplantatiemodellen te omzeilen, is het concept engineering een humanized BM structuur op de voorgrond gebracht. Samenvoegen van biomaterialen en cellimplantatieconcepten, rapporten hebben aangetoond dat de haalbaarheid van het menselijk botmPijl-micro-omgeving in heterotopische gebieden 23 , 24 , 25 , 26 , 27 . Dit maakt de mogelijkheid om bioengineering in muismodellen te gebruiken om menselijke normale en kwaadaardige hematopoiesis 28 , 29 , 30 , 31 , 32 , 33 , 34 , 35 , 36 , 37 , 38 , 39 , tumorigenese en metastase 40 , 41 , 42 te bestuderen . , 43 , 44 . Gebaseerd op eerdere ervaring in botweefseltechniek en in vivo beeldvorming 19 , 22 , 45 , 46 , 47 , 48 , 49 , 50 , 51 , 52 beschrijven we een protocol voor bioengineer en organische biologische humane BM-weefsels. Deze structuren zijn afkomstig van de implantatie van humane BM-afgeleide stromacellen in collageen gebaseerde steigers subcutaan ingeënt in immunodeficiënte muizen. In een eerdere rapportage hebben we aangetoond dat menselijke MSC&#39;s de vorming van een menselijke micro-omgeving waarborgen voor de inplanting van humane hematopoietische cellen 45 . Verder beschrijven we hoe de co-implantatie van een ander menselijk BM-celcomponentS, zoals menselijke endotheelcellen (hEC) en / of cytokines die belangrijk zijn voor botvorming ( bijv. HBMP2), werken samen met hMSCs om verschillende gehumaniseerde micro-omgevingen te genereren, die in situ live-imaged kunnen worden.

```html
<table><tbody><tr><td>Ficoll-Paque</td><td>Ge Healthcare</td><td>17-1440-03</td><td></td></tr><tr><td>Cd34 positive selection Kit</td><td>Stemcell</td><td>18056</td><td>Bewaar bij 4°C.</td></tr><tr><td>Magnet</td><td>Stemcell</td><td>18000</td><td></td></tr><tr><td>Anti-human CD3 antibody, clone OKT-3</td><td>Bioxcell</td><td>BE0001-2</td><td>Bewaar bij 4°C. Gebruikt voor T-cel depletie in primaire AML-monsters. </td></tr><tr><td>Cytokines (IL3, G-CSF, en TPO)</td><td>PeproTech</td><td>200-03, 300-23 en 300-18</td><td>Voor het maken van de stock: Verdun elk van de cytokinen in 100 μL water en meng ze. Voeg 200 μL toe, doe alicuots van 45 μL en bewaar bij -20 °C.</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>D4540</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Life technologies</td><td>10270106</td><td>Inactiveren door te verwarmen bij 56 °C gedurende 30 min, doe alicuots en vries ze in. Verwarm in 37 °C waterbad voor gebruik.</td></tr><tr><td>MEM-α</td><td>Invitrogen</td><td>32571-028</td><td>Bewaar bij 4 °C. Verwarm in 37 °C waterbad voor gebruik.</td></tr><tr><td>Myelocult H5100</td><td>corning</td><td>5100</td><td>Bewaar bij 4 °C. Verwarm in 37 °C waterbad voor gebruik.</td></tr><tr><td>199</td><td>Gibco</td><td>41150-020</td><td>Bewaar bij 4 °C. Verwarm in 37 °C waterbad voor gebruik.</td></tr><tr><td>hMSC-FBS, Heat-inactivated</td><td>Gibco</td><td>12662-029</td><td>Bewaar bij -20 °C. Verwarm in 37 °C waterbad voor gebruik.</td></tr><tr><td>P/S</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0781</td><td>Bewaar bij -20 °C. Verwarm in 37 °C waterbad voor gebruik.</td></tr><tr><td>ECGS</td><td>Millipore</td><td>02-102</td><td>Verdun in kweekmedium en gebruik 0.22 mm filter.</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S1558-50ML</td><td>Bewaar bij 4 °C.</td></tr><tr><td>Heparine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3149</td><td>Bewaar bij 4 °C.</td></tr><tr><td>Glutamine</td><td>Gibco</td><td>25030</td><td>Bewaar bij -20 °C.</td></tr><tr><td>Collagen 1 coated cell culture plate</td><td>corning</td><td>354505</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA oplossing</td><td>Thermo-Fisher</td><td>25200056</td><td>Bewaar bij -20 °C. Verwarm in 37 °C waterbad voor gebruik.</td></tr><tr><td>hMSC</td><td>Lonza</td><td>PT-2501</td><td>Alternatief, hMSCs worden ook vriendelijk ter beschikking gesteld door Dr. Dosquet (University Paris Diderot, Parijs) uit humaan beenmerg verkregen tijdens orthopedische chirurgie onder ethische goedkeuring 10-038 van IRB00006477. </td></tr><tr><td>VeraVec HUVEC endotheelcellen</td><td>Angiocrine bioscience</td><td>hVera101</td><td>Alternatief, een andere menselijke endotheelcelbron kan worden gebruikt.</td></tr><tr><td>Menselijke hematopoietische cellen</td><td></td><td></td><td>Navelstrengbloed of primaire Acute Myeloïde Leukemie (AML) monsters werden verkregen van het Royal London Hospital (Londen, VK) na geïnformeerde toestemming en protocol van gebruik werd goedgekeurd door het East London Ethische Comité en uitgevoerd in overeenstemming met de Verklaring van Helsinki. </td></tr><tr><td>Gelfoam, Grootte 12 - 7mm</td><td>Pfizer</td><td>00009-0315-08</td><td>Alternatieve leverancier: Febelco</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Thermo-Fisher</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>Chirurgisch materiaal</td><td>Meerdere</td><td></td><td>Steriele pincetten, tang en scherpe schaar.</td></tr><tr><td>Steriele tissues</td><td></td><td></td><td>Papier tissues hitte-steriliseren.</td></tr><tr><td>1 mL Spuit met naald van 25G</td><td>Terumo</td><td>SS+01H25161</td><td></td></tr><tr><td>Ultra Low Attachment Multiple Well Plates</td><td>Corning</td><td>3473 of 3471</td><td></td></tr><tr><td>BMP2</td><td>Noricum</td><td>rhBMP-2</td><td>Verdun tot 5 mg/mL in azijnzuur 50 mM en bewaar bij 4 °C.</td></tr><tr><td>Trombine</td><td>Sigma</td><td>T8885</td><td>Verdun in CaCl2 2%, 500 mL per flacon, en bewaar bij 4 °C.</td></tr><tr><td>Fibrinogeen</td><td>Sigma</td><td>F3879</td><td>Verdun tot 4 mg/100 mL in PBS. Bewaar bij -20 °C. Verwarm voor gebruik.</td></tr><tr><td>Weefselkweek schalen 35 mm x 10 mm</td><td>Falcon</td><td>353001</td><td></td></tr><tr><td>U-Bottom 96 well plate</td><td>Falcon</td><td>353077</td><td></td></tr><tr><td>NSG muizen</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>5557</td><td>NSG muizen waren een vriendelijke gift van Dr. Leonard Shultz (The Jackson Laboratory).</td></tr><tr><td>Chlorhexidine</td><td>G9</td><td></td><td>Verdun 1:10 voor gebruik</td></tr><tr><td>Carprofen</td><td>Pfizer</td><td>Rimadyl</td><td>5 mg/kg muis</td></tr><tr><td>Buprenorphine</td><td>Alstoe</td><td>Vetergesic</td><td>0.1 mg/kg lichaamsgewicht muis</td></tr><tr><td>Isofluraan</td><td>Abbott</td><td>B506</td><td>Inductie van anesthesie 2%, onderhoud 1%</td></tr><tr><td>Trimmer</td><td>Wella</td><td>Contura HS61</td><td></td></tr><tr><td>Chirurgische lijm</td><td>3M</td><td>Vetbond</td><td></td></tr><tr><td>Carbomer (polyacrylzuur) als Ophtalmisch gel</td><td>Novartis</td><td>Viscotears Liquid Gel</td><td></td></tr><tr><td>Human Normal Immunoglobulin</td><td>Gammaplex</td><td>10g flacon</td><td>100 mL/muis intraveneus, 30 min voor infusie van specifiek antilichaam.</td></tr><tr><td>NT-QTracker</td><td>Invitrogen</td><td>Q21021MP</td><td>Vaat-pooling agent. Toedienen van 15 mL/muis intraveneus 5 min voor beeldvorming.</td></tr><tr><td>AF488-hCD45</td><td>Biolegend</td><td>304017</td><td>100 mL/muis intraveneus, 30 min voor beeldvorming.</td></tr><tr><td>FITC-hCD31</td><td>BD Pharmigen</td><td>555445</td><td>100 mL/muis intraveneus, 30 min voor beeldvorming.</td></tr><tr><td>Superlijm</td><td>Loctite</td><td>Super Glue</td><td></td></tr><tr><td>Micro-Boor Kit</td><td>IDEAL - Fisher Scientific</td><td>NC9010016</td><td></td></tr><tr><td>Microchirurgisch microscoop</td><td></td>

bioengineering van humanized botmarg microenvironments in mouse en hun visualisatie door live imaging

Bioengineering of Humanized Bone Marrow Microenvironments in Mouse and Their Visualization by Live Imaging

Menselijke hematopoietische stamcellen (HSC&#39;s) zijn gevestigd in het beenmerg (BM) niche, een ingewikkeld multifactorisch netwerk van componenten die cytokines produceren, groeifactoren en extracellulaire matrix. Het vermogen van HSCs om stil te blijven, zelfherzien of te differentiëren, mutaties te verwerven en kwaadaardig te worden, hangt af van de complexe interacties die ze met verschillende stromale componenten vestigen. Om de kruispunten tussen menselijke HSC&#39;s en de menselijke BM-niche in fysiologische en pathologische condities te waarnemen, hebben we een protocol ontworpen om ectopisch model en beeld een geanimeerde BM niche in immunodeficiënte muizen te maken. We tonen aan dat het gebruik van verschillende cellulaire componenten de vorming van menselijke structuren mogelijk maakt en de mogelijkheid biedt om langdurig humaan hematopoietische engraftment te behouden. Met behulp van twee-foton microscopie kunnen we deze structuren in situ bij de single-cellresolutie imiteren, waardoor een krachtig nieuw instrument voor de functionele karakterisering van de menselijke BM mMicro-omgeving en zijn rol bij het reguleren van normale en kwaadaardige hematopoiesis.

In figuur 1 worden representatieve afbeeldingen van de zaad- en implantatieprocessen van de steigercel getoond. Let op in figuur 1C dat cellen direct in de steiger worden ingespoten. In figuur 1G , let op dat er in de achterkant van de muis een snede is gemaakt, waar de subcutane zak wordt gecreëerd en de steiger wordt geïmplanteerd. Figuur 2 toont de bruto morfologie van verschillende steigers die in NSG muizen geïmplanteerd zijn en na 8 weken worden opgehaald. Let op de lichte vascularisatie in hMSC-zaadstaven ( Figuur 2A ). Het samenvoegen van menselijke EC&#39;s met hMSC&#39;s in de steiger maakt het mogelijk om meer relevante vasculatuur te vormen in steigers ( Figuur 2B ). Tenslotte veroorzaakt de aanwezigheid van rhBMP-2 botvorming. In deze zaak zijn de opgerichte steigers groter, en ze worden gevormd doorBotachtig hardweefsel. Figuur 3 toont de configuratie van de kanaalconfiguratie op de microscoop voor livebeelden met NDD (details in de figuurlegenda). Figuur 4 en Video 1 tonen menselijke hematopoietische cellen in hMSC-gecoate steigers. Steigers werden 8 weken na implantatie geëxplanteerd en na de intraveneuze inenting van AF488-hCD45 antilichaam en 655-VPA. Deze procedure zorgt voor het visualiseren van geïmplanteerde humane hematopoietische cellen en de vasculaire structuur door twee-foton confocale microscopie. In dit geval tonen de beelden bloedvaten (655-VPA) in steigers en de langetermijngangering van humane hematopoietische cellen (AF488-hCD45) in het steigerparenchym. Figuur 5 en Video 2 komen overeen met menselijke steigers die met hECs en hMSCs worden gezaaid. 8 weken na de operatie werden steigers na de intraveneus geëxplanteerdOus inoculatie van FITC-hCD31 antilichaam en 655-VPA, en beelden werden verworven met een twee-foton confocale microscoop, zoals eerder vermeld. Afbeeldingen tonen de participatie van hEC&#39;s in de vorming van vaten in de steiger, wat resulteert in een murine-menselijke chimere vasculatuur. Figuur 6A toont representatieve gegevens van de aanpak die wordt gebruikt om botvorming in MSC-steigers te stimuleren. In vergelijking met eerdere figuren, 8 weken na implantatie, werd de intraveneuze inoculatie van 655-VPA uitgevoerd, steigers werden opgehaald en beelden werden verkregen met twee-foton confocale microscopie. RhBMP-2-gestimuleerde steigers veroorzaken de vorming van botweefsel, die kan worden geconfronteerd door de SHG (cyan kleur in de beelden) die door het calcium in het bot wordt verstrekt. De afgebeelde afbeeldingen tonen ook de vorming van holtes en vascularized endosteal weefsel, die sterk lijken op het BM endostale weefsel. In figuur 6B </sTrong&gt; en Video 3 werden hECs geïmplanteerd met hMSCs. Steigers werden opgehaald na de intraveneuze inoculatie van FITC-hCD31 antilichaam en 655-VPA, en twee-foton confocal microscopie beelden tonen de participatie van hEC&#39;s in de neovascularisatie in een botvormende steiger. Figuur 7 toont representatieve beelden van histologie, een procedure die is uitgevoerd om eerder beschreven resultaten te bevestigen. Immunofluorescente beelden tonen muisvasculatuur, hECs, hMSCs en langdurig geïmplanteerde humane hematopoietische cellen in de steigerstructuren. Steigers die zijn opgehaald uit muizen werden vastgezet en gebruikt voor immunofluorescentie. In de rhBMP-2 drager botvormende steigers ( Figuur 7D- F ), let op de morfologie van het weefsel, die op rijp beenmerg lijkt met vetweefsel. In deze botvormende steiger tonen we dat hMSC&#39;s fibroblasten zijn, wat t zou aantonenHoed dragen zij bij tot nieuw gevormde weefsel als stromale cellen. We tonen ook menselijke adipocyte marker expressie, wat aangeeft dat hMSCs ook bijdragen aan de vorming van vetweefsel. <img alt="Figuur 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55914/55914fig1.jpg" /> Figuur 1. Representatieve afbeeldingen van de cel-zaaizaad- en implantatieprocessen. A) Aanvankelijke steiger en zijn snijmethode met behulp van een scalpel. B) 24 stuks verkregen uit de eerste steiger. C) Steiger cel-zaaimethode met behulp van een spuit. D) Gezaagde steigers met kweekmedium, klaar om te worden geïmplanteerd. EF) Specifieke stappen voor botvormende steigers: E) Steiger wordt overgebracht naar een 96-putje u-bodemplaat en F) representatief beeld van de methode die wordt gebruikt om rhBMP2, trombine en fibrinogeen aan het steiger toe te voegen. GJ) Surgi<html> Cal implantatie procedure onder algemene verdoving: G) wond gecreëerd in de huid en steiger implantatie, H) implantatie methode, en IJ) wond sluit procedure met behulp van chirurgische lijm. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55914/55914fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> <img alt="Figuur 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55914/55914fig2.jpg" /> Figuur 2. Verschillende steigers die van muizen worden opgehaald. Representatieve beelden van MSC steigers (links), MSC + EC steigers (midden), en MSC + EC + BMP steigers (rechts). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55914/55914fig2large.jpg" target="_blank">Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> 4 / 55914fig3.jpg &quot;/&gt; Afbeelding 3. Kanaalconfiguratie. De installatie van de microscoopfilter wordt weergegeven. A) Er zijn vier NDD detector modules: in de eerste module zijn er twee filterblokken; De tweede en derde module hebben elk een filterkubus; En de laatste module heeft geen kubus (niet gebruikt). De eerste fotomultiplierbuis (PMT) is bestemd voor het verre kanaal (640 - 690 nm), die de lagere golflengten weerspiegelt; De volgende zijn 380 - 485 nm, 500 - 550 nm en 555 - 625 nm (de volgorde is altijd van de lagere tot de hogere golflengten). B) De fluorofore emissies detecteerbaar met de bovenstaande configuraties (kleur gecodeerd). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55914/55914fig3large.jpg" target="_blank">Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> <img alt="Figuur 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55914/55914fig4.jpg" /> Figuur 4. MSC Steiger<html> S toestaan ​​voor de vorming van een niche voor humane hematopoietische cellen. A) en B) 3D reconstructies van Z-stapels, genomen na-explant, na intraveneuze inoculatie met AF488-hCD45 (groen), om humane hematopoietische cellen te etiketteren en 655-VPA (magenta) m om vasculatuur te labelen. Schaalstaven vertegenwoordigen 20 μm in A en B (bovenste panelen) en 5 μm in B (onderste panelen). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55914/55914fig4large.jpg" target="_blank">Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> <img alt="Video 1" src="/files/ftp_upload/55914/55914video1.jpg" /> Video 1. MSC-steigers laten toe voor de vorming van een niche voor humane hematopoietische cellen . 3D reconstructie van humane hematopoietische cellen (AF488-hCD45) geassocieerd met de vasculatuur (655-VPA) in de MSC-steiger (collageenstructuren: SHG, cyaan). Elke stapel meet 140 x 140 μm.Ef = &quot;http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55914/55914video1.mov&quot; target = &quot;_ blank&quot;&gt; Klik hier om deze video te bekijken. (Klik met de rechtermuisknop om te downloaden.) <img alt="Figuur 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55914/55914fig5.jpg" /> Figuur 5. Menselijke EC&#39;s nemen deel aan de vorming van menselijke schepen in MSC-steigers. 3D reconstructie van vasculatuur (655-VPA) gevoerd door EC&#39;s van menselijke oorsprong (FITC-hCD31) in MSC + EC steigers. Schaalstaven vertegenwoordigen 20 μm. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55914/55914fig5large.jpg" target="_blank">Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> <img alt="Video 2" src="/files/ftp_upload/55914/55914video2.jpg" /> Video 2. Menselijke EC&#39;s nemen deel aan de vorming van georganiseerde schepen in MSC-steigers. 3D reconstructie van menselijke EC&#39;s (FITC-hCD31)<html> Sculature (655-VPA) in MSC + EC steigers. Elke stapel meet 240 x 240 μm. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55914/55914video2.mov" target="_blank">Klik hier om deze video te bekijken. (Klik met de rechtermuisknop om te downloaden.)</a> <img alt="Figuur 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55914/55914fig6.jpg" /> Figuur 6. rhBMP-2 Carrier Steigers hebben botoppervlakken en geanualiseerde vasculatuur die vergelijkbaar zijn met de Beenmerg. A) 3D reconstructie van MSC + BMP steigers die de vorming van botstructuren (SHG-cyaan) en vasculatuur (655-VPA) tonen. Schaalstaven vertegenwoordigen 100 μm (links), 70 μm (midden) en 50 μm (rechts). B) 3D reconstructie van MSC + EC + BMP steigers die gehumaniseerde vaten tonen (655-VPA) gevoerd met menselijke ECs (FITC-hCD31). Schaalstaven vertegenwoordigen 50 μm (links) en 30 μm (midden en rechts).14 / 55914fig6large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te zien. <img alt="Video 3" src="/files/ftp_upload/55914/55914video3.jpg" /> Video 3. rhBMP-2 Carrier Steigers hebben botoppervlakken en geanualiseerde vasculatuur die vergelijkbaar is met de Beenmerg. 3D reconstructie van MSC + VERA + BMP steiger (bot: SHG; schepen: 655-VPA; menselijke ECs: FITC-hCD31). Elke stapel meet 600 x 600 μm. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55914/55914video3.mov" target="_blank">Klik hier om deze video te bekijken. (Klik met de rechtermuisknop om te downloaden.)</a> <img alt="Figuur 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55914/55914fig7.jpg" /> Figuur 7. Representatieve beelden van immunofluorescentie uitgevoerd op vaste steigers. AF) Immunofluorescentie studies uitgevoerd om menselijke cellen geïmplanteerde i te lokaliserenN steigers. AC) Steigers geïmplanteerd met hECs, hMSCs en hHSCs. DF) Botvormende steigers geïmplanteerd met hECs, hMSCs en hHSCs. De kleurkanalen zijn als volgt: AD) menselijke EC (hCD31) en muisvasculaire structuur (endomucine, ENDOM), BE) hMSCs (hVimentin, hVIM) en muisvasculaire cellen (endomucine, ENDOM), C) humane hematopoietische cellen (hCD45) En muisvasculatuur (endomucine, ENDOM) en F) humane adipodifferentiatie-gerelateerde eiwitten (hADRP) en muisvasculatuur (endomucine, ENDOM). Schaalstaven vertegenwoordigen 10 μm (A en C), 20 μm (B en E) en 40 (D en F) μm. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55914/55914fig7large.jpg" target="_blank">Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>

Een methode om verschillende gehumaniseerde beenmergnissen in muizen te creëren en te leven, wordt gepresenteerd. Op basis van de ondersteunende niche die door menselijke mesenchymale cellen is gecreëerd, induceert de toevoeging van menselijke endotheelcellen de vorming van menselijke vaten, terwijl de toevoeging van rhBMP-2 de vorming van chimerisch volwassen weefsel van humane muizen veroorzaakt.

Bioengineering van Humanized Botmarg Microenvironments in Mouse en hun visualisatie door Live Imaging

Human hematopoietic stem cells (HSCs) reside in the bone marrow (BM) niche, an intricate, multifactorial network of components producing cytokines, growth ...

Het algemene doel van deze methode is om menselijke celdrager-scaffolds in muizen te implanteren om gehumaniseerde beenmergniches te creëren en vervolgens het gedrag van de menselijke cellen binnen de implantaten in vivo te beeldvormen. Deze methode zal helpen bij het beantwoorden van kernvragen in het menselijke hematopoëtische veld, omdat het mogelijk maakt om verschillende componenten van het beenmerg te reproduceren en in vivo te beeldvormen met een resolutie op enkelcelniveau. De veelzijdigheid van dit systeem is een van de belangrijkste voordelen, aangezien het de implantatie van verschillende nichecomponenten één voor één of in combinatie mogelijk maakt.Deze methodologie zou potentieel toegepast kunnen worden op andere onderzoeksgebieden, zoals tumormetastase of studies naar drugscreening. Begin met het snijden van een gesteriliseerde gelatinespons in 24 stukken van vergelijkbare grootte, waarbij de juiste steriele techniek wordt gehanteerd. Reconstitueer de gelatinescaffolds door onderdompeling in ethanol en vervolgens in PBS.Dep vervolgens elk scaffold voorzichtig af op een steriel tissue om overtollige vloeistof te verwijderen en breng de scaffolds over naar individuele wells van een 24-wells plaat met ultra-lage hechting. Injecteer met een insulinespuit voorzichtig 1 x 10⁵ tot 1 x 10⁶ stromale cellen in 50 µL kweekmedium in elk scaffold en plaats de plaat in een celkweekincubator. Let er bij het injecteren van de cellen in het scaffold op dat er geen lekkage uit het scaffold optreedt.Vul na één uur elke put bij met drie milliliters vers celcultuurmedium en plaats de scaffolds terug in de incubator. Injecteer na 24 uur 1 × 10⁵ hematopoëtische cellen in de scaffolds, gevolgd door incubatie en verdere toevoeging van medium, en een incubatie van 24 uur zoals zojuist gedemonstreerd. Voor de generatie van carrier-scaffolds met recombinant humaan botmorfogenetisch proteïne 2, plaats de gereconstitueerde scaffolds in individuele putten van een U-bodem 96-wells plaat en voeg vijf microliters recombinant humaan botmorfogenetisch proteïne 2 toe aan elke scaffold.Bedek de scaffolds vervolgens met 20 µL trombine en 20 µL fibrinogeen. Voor de chirurgische implantatie van de bio-engineered scaffolds wordt eerst het chirurgische gebied op de rug van de experimentele muis geschoren; gebruik daarna een wattenstaafje gedoopt in verdunde chloorhexidine om het blootgelegde huidoppervlak drie keer in elke richting te reinigen. Maak vervolgens met een steriele pincet en een scalpel een incisie van 0,5 tot 0,7 cm in de huid van anterieur naar posterieur, en breng de pincet onder het subcutane weefsel om een pocket te creëren.Plaats het steunmateriaal diep in de pocket en sluit de incisie met chirurgische lijm. Laat de geïmplanteerde steunmaterialen acht tot 24 weken rijpen voordat ze worden geëxplanteerd. Na intraveneuze toediening van fluorescerende stoffen en euthanasie van de dieren, steriliseert u de huid zoals zojuist gedemonstreerd en maakt u een longitudinale huidincisie op de rug van het dier, nabij de oorspronkelijke implantatieplaats.Scheid de huid voorzichtig van de subcutane pocket waar de scaffold is geïmplanteerd, gebruik vervolgens een pincet om de scaffold voorzichtig vast te pakken en snijd het resterende membraan en de weefsels rondom de scaffold zorgvuldig door om de structuur te bergen. Gebruik snelhardende lijm om de scaffold te bevestigen aan een Petri-schaal van 35 bij 10 milliliter. Voor scaffolds met bone morphogenetic protein two dient men, voordat de plaat met PBS wordt gevuld, een chirurgische microbeur onder een microsurgical microscoop te gebruiken om het botoppervlak dunner te maken, zodat de fluorforen zichtbaar worden en beelden met een hoge resolutie kunnen worden vastgelegd.Wees bijzonder voorzichtig tijdens het boren, omdat de dikte van het bot doorgaans varieert tussen de scaffolds en het belangrijk is om het oppervlak niet te breken. Vul het schaaltje met PBS op kamertemperatuur. Voor 2-foton microscopie-imaging van de bio-engineered scaffolds plaatst u de scaffold op de tafel van de confocale microscoop en selecteert u de 20 keer 1.0 NA waterimmersielens.Select vervolgens in de acquisitiemodus van de imagingsoftware het selectievakje 'handmatige tools tonen'. Schakel in het laser-menu de 2-fotonenlaser in en laat de laser opwarmen en stabiliseren. Wanneer de laser gereed is, activeert u in het menu voor de imaging-instellingen de kanaalmodus en de optie 'elk frame track wisselen'.Selecteer in het menu voor het lichtpad 'non descanned' en de hoofdstraalsplitser 'MBS 760 plus'. Activeer de vier non-descanned detectoren en stel de configuratie in zoals weergegeven in het schema. Stel in het kanalenmenu de lasergolflengte in op 890 nanometer en het vermogen op 50%. Stel de gain master in op 500 tot 600, de digitale offset op nul en de digitale gain op 15 voor elk kanaal.Stel in de acquisitiemodus de juiste parameters in om beelden met een hoge resolutie te verkrijgen zonder het weefsel te beschadigen of de fluorforen te bleken. Stel vervolgens de zoom in op één voor de initiële scan van het beeld. Wanneer alle parameters zijn ingesteld, wordt de lens verlaagd tot deze de zoutoplossing raakt, waarna de focus van de lens handmatig wordt ingesteld met een lamp als lichtbron.Activeer nu het Z-stack-menu en selecteer de functie first last. Stel het gewenste interval tussen twee opeenvolgende coupes in en selecteer live om een live scan van het monster te maken, waarbij de digitale gain en digitale offset naar behoefte worden aangepast voor een optimale belichting. Selecteer de split-functie om meerdere kanalen tegelijkertijd te visualiseren.Scan in de live-modus via het menu van de objecttafel het beeld en markeer de regio's van belang, zoals de locatie van botcaviteiten. Zodra de scan van het monster is voltooid, gaat u naar de eerste regio van belang en gebruikt u de functies 'set first' en 'set last' in de live-modus om de boven- en onderkant van de 3D Z-stack rondom het gebied van belang in te stellen. Stel vervolgens het centrum, C, in en klik op de knop 'start experiment' om de Z-stack beeldacquisitie van de regio van belang te starten.Wanneer de acquisitie is voltooid, slaat u de beelden op in de daarvoor bestemde map en scant u het volgende interessegebied. In deze representatieve beelden kan de grove morfologie van verschillende scaffolds worden waargenomen die acht weken na implantatie zijn teruggewonnen uit immuundeficiënte NSG-muizen. Co-seeding met menselijke endotheelcellen verhoogt de vascularisatie van de scaffold, terwijl de toevoeging van recombinant menselijk botmorfogenetisch proteïne twee botvorming induceert.Deze steigers, gevisualiseerd met live 2-fotonenmicroscopie, onthullen de aanwezigheid van bloedvaten in de steigers en de langdurige ingroei van menselijke hematopoëtische cellen in het parenchym van de steiger. Steigers gezaaid met menselijke endotheliale en mesenchymale stromale cellen illustreren de deelname van de menselijke endotheliale cellen aan de vorming van vaten binnen de steiger, wat resulteert in een muis-mens chimerische vasculatuur. De vorming van botweefsel kan worden gevisualiseerd met 2-fotonenmicroscopie, evenals de vorming van holtes in de gehumaniseerde vasculatuur in het endostale weefsel, dat sterk lijkt op endostaal beenmergweefsel.Verder vertoont de morfologie van het weefsel binnen de dragers met recombinant menselijk botvormend eiwit twee gelijkenis met volgroeid beenmerg met vetweefsel, wat suggereert dat de menselijke mesenchymale stromale cellen ook bijdragen aan de vorming van vetweefsel. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van alle bio-engineering en de belangrijkste muisscaffolds. Denk eraan om altijd een aseptische omgeving te handhaven en wees extra voorzichtig bij het hanteren van de scaffolds.Houd rekening met de beperkingen die verbonden zijn aan deze methode, zoals mens-muis-chimeren van de weefsels. Onthoud dat monsters na beeldvorming kunnen worden gebruikt voor verdere studies, aangezien de scaffolds kunnen worden afgebroken en levende cellen er derhalve uit kunnen worden teruggewonnen.

bioengineering-humanized-bone-marrow-microenvironments-mouse-their

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Ontwikkelingsbiologie

Hier beschrijven we een methode om menselijk navelstrengbloed afgeleide endotheel kolonie-vormende cellen (ECFCs) en beenmerg-afgeleide mesenchymale stamcellen (MSC's), ingebed in een collageen / fibronectine gel, subcutaan in immunodeficiënte muizen. Te leveren Deze cel / gel combinatie genereert een humane vasculaire netwerk dat verbindt met de muis vaatstelsel.

Bioengineering Human Microvasculaire Netwerken in immunodeficiënte muizen

We beschrijven een werkwijze voor beeldvorming respons op...

Leef Imaging van de Drug antwoorden in de tumor micro-omgeving in muismodellen van Kanker van de Borst

Combinatorische 5 fluorescerende eiwitten markering van hematopoietische stamcellen en voorlopercellen maakt in vivo klonale volgen via confocale en twee-foton microscopie, het verstrekken van inzicht in het beenmerg hematopoietische architectuur tijdens de regeneratie. Deze methode maakt het mogelijk niet-invasieve lot in kaart brengen van spectraal-gecodeerde HSPCs-afgeleide cellen in intacte weefsels voor langere perioden na de transplantatie.

In vivo Klonale Tracking van hematopoietische stamcellen en progenitorcellen Gekenmerkt door Five fluorescerende eiwitten met behulp van confocale microscopie en Multiphoton

De aard van de interactie tussen hematopoietische stamcellen en progenitorcellen (HSPCs) en beenmerg nissen wordt slecht begrepen. Aangepaste hardware wijzigingen en een meerstaps overname protocol maken het gebruik van twee-foton en confocale microscopie beeld ex vivo gemerkte HSPCs geadopteerd in beenmerg gebieden volgen interacties en beweging.

In Vivo 4-dimensionale Tracking van hematopoietische stamcellen en progenitorcellen in volwassen muis calvarial Bone Marrow

Monocyten zijn belangrijke regulatoren van aangeboren immuniteit en spelen een cruciale rol bij de vernieuwing van het perifere mononucleaire fagocytische systeem en in geval van ontsteking. Dit manuscript beschrijft de procedure van realtime beeldvorming van het muiscalvaria beenmerg om het mechanisme van monocytmobilisatie te bestuderen.

Tracking muisbeenmerg Monocyten<em&gt; In Vivo</em

Het protocol beschrijft een nieuw model voor een muis dijbeenraamkamer dat kan worden gebruikt om de beweging van cellen in het beenmerg in vivo te volgen. Intravitale multifotonfluorescentiemicroscopie wordt gebruikt om drie componenten van het dijbeenmerg (vaatstelsel, collageenmatrix en neutrofielen) in de tijd te beeldvormen.

Dijbeen Window Chamber Model voor<em&gt; In Vivo</em&gt; Cell Tracking in het Muizen Bone Marrow

Intravital fluorescentie microscopie (IVFM) van de calvarium wordt toegepast in combinatie met genetische diermodellen om de homing en engraftment van hematopoietische cellen in het beenmerg (BM) niches te studeren.

Intravital Fluorescent microscopie (IVFM) te combineren met genetische modellen om te studeren van Engraftment dynamiek van hematopoietische cellen aan het beenmerg Niches

We beschrijven hier de methode voor het afbeelden van megakaryocyten en proplatelets in het merg van het schedelbot van levende muizen met behulp van twee-fotonenmicroscopie.

In vivo Twee-foton Beeldvorming van Megakaryocyten en Proplatelets in de Muis Schedel Beenmerg

Dit protocol beschrijft de intrafemorale injectie van enkele hematopoëtische of leukemische stamcellen, waaronder gen-bewerkte cellen, in muizenxenotransplantaatmodellen, die niet alleen de snelle en veilige transplantatie van cellen mogelijk maken, maar ook seriële analyses van het beenmerg.

Vereenvoudigde intrafemorale injecties met levende muizen maken continue beenmerganalyse mogelijk

Intravitale microscopie maakt het mogelijk om dynamische biologische processen zoals weefselregeneratie en tumorontwikkeling te bestuderen. Het calvariale beenmerg, een zeer dynamisch weefsel, biedt inzicht in hematopoëse en vasculaire functie. Het gebruik van een biocompatibel 3D-geprint hoofdfixatie-implantaat maakt repetitieve longitudinale beeldvorming mogelijk, waardoor ons begrip van weefseldynamiek en de micro-omgeving van de tumor wordt verbeterd.

Intravitale longitudinale beeldvorming van vasculaire dynamiek in het calvariale beenmerg

Leer hoe je menselijke beenmergniches bioengineert in muizen met behulp van gelatinescaffolds en levende celimaging. Deze methode maakt real-time observatie van hematopoëtische celdynamiek op enkelcelresolutie mogelijk.

Bioengineering van Humanized Botmarg Microenvironments in Mouse en hun visualisatie door Live Imaging

Meer video's verkennen