IR-TEx: een open source data-integratie tool voor Big Data transcriptomics ontworpen voor de malaria vector Anopheles gambiae

Dit protocol is belangrijk, omdat het de eerste keer is dat transcriptomische gegevens in Anopheles Gambiae muggen vrij en gemakkelijk toegankelijk zijn gemaakt op één plaats. Deze techniek stelt alle onderzoekers, zelfs mensen zonder achtergronden in de bioinformatica in staat om vrij en gemakkelijk toegang te krijgen tot expressiegegevens over hun favoriete genen en insecticide-resistente muggen. Volg om te beginnen de link onder aan de LSTM IR-TEx-projectpagina om de IR-Tex-webtoepassing in een webbrowser uit te voeren.

Zodra de webpagina is geïnitialiseerd, klikt u op de knop Toepassing boven aan de pagina, waarin de toepassing en de bijbehorende uitvoer worden weergegeven. Lees elke uitvoer met betrekking tot de standaardvermelding in het vak transcript-id. Selecteer voorwaarden en Anopheles Coluzzii-gegevenssets die worden blootgesteld aan Pyrethroïde insecticiden, of niet worden blootgesteld aan insecticiden en bijbehorende transcripties met een correlatiecoëfficiënt van meer dan 0,98.

Als u de expressie van een transcriptie van belang wilt verkennen, selecteert u eerst het transcript. Voer vervolgens de transcript-ID in in het vak id-transcript en onthoudt dat de transcripties eindigen in RX, afhankelijk van het isoform van belang. Selecteer de gegevenssets die u moet ondervragen door de relevante vakken voor landen in te nemen, waaronder de blootstellingsstatus, de soorten van belang en de insecticideklasse van belang.

Zorg ervoor dat deze criteria resulteren in meer dan één opgenomen gegevensset. Klik op Weergave bijwerken onder aan het selectiemenu of druk op Retour en negeer de absolute correlatiewaarde voor nu. Geef de toepassing de tijd om bij te werken.

Of het nu de eerste grafiek heeft de Log2 Fold Change tussen een resistente populatie, en een lab gevoelige mug populatie van de transcriptie van belang, over elke dataset die voldoet aan de geselecteerde criteria. Lees de informatie onder de grafiek als de Fold Veranderingen tussen de resistente en gevoelige muggen voor elke relevante gegevensset, in aanvulling op de bijbehorende gecorrigeerde P-waarden. Elke rij vertegenwoordigt afzonderlijke sondes op de microarray.

Lees de aanvullende tabel hieronder, als het aantal experimenten waarin de transcriptie van belang is significant, evenals het totale aantal experimenten die voldoen aan de geselecteerde criteria. Als u de gegevens in de door tabbladen gescheiden indeling wilt downloaden, klikt u op de knop Downloaden onder de twee tabellen. Hierdoor kan de gebruiker op een eenvoudigere manier gegevens verkennen met behulp van een programma zoals Excel.

Elk punt op de kaart vertegenwoordigt de geschatte verzameling sites van resistente muggen in elke gegevensset, waarin het transcript van belang wordt differentieel uitgedrukt. De kleuren volgen een stoplichtsysteem dat in de app wordt uitgelegd. Sla de grafische uitvoer op door met de rechtermuisknop te klikken, op Afbeelding opslaan als te klikken en een geschikte map te kiezen.

In het geval van een uitvoerfout door de toepassing, is het waarschijnlijk dat er geen gegevenssets overeenkomen met de ingevoerde criteria. Correlaties van de expressiepatronen van transcripties in meerdere gegevenssets kunnen worden gebruikt om de transcriptiefunctie te voorspellen en mogelijk co-geregelde transcripties van hetzelfde traject op te helderen. Voordat u op Updateweergave klikt, verplaatst u de schuifregelaar voor de absolute correlatiewaarde naar 0,85 en klikt u op Weergave bijwerken of drukt u op Return.

Bestudeer de correlatietabel om de meerdere transcripties te vinden die nu worden weergegeven en die zijn gecorreleerd met de ingevoerde en transcriptie. Lees de tabel onder de grafische uitvoer, die de correlatiewaarde voor elke transcript bevat. Als u de gegevens in een door tabbladen gescheiden indeling wilt downloaden, klikt u op de knop Downloaden.

Manipuleer de absolute correlatiewaardeschuifregelaar en observeer eventuele wijzigingen in de onderste grafiek en tabel. Een lagere stringentie van de correlatiewaarde toont meer transcripties, maar zal meer ruis introduceren. Zodra de IR-TEx is geïnstalleerd, opent U RStudio Supplemental Coding File1 en voert u elke regel uit om het systeem voor IR-TEx in te stellen.

Zodra alle pakketten zijn geïnstalleerd en bijgewerkt naar behoefte, gaat u naar Bestand openen. Zoek IR_TEx. r, markeren en openen.

Dit moet nu zichtbaar zijn in het bovenste venster van RStudio. Als u de app wilt uitvoeren, drukt u op de knop App uitvoeren in de rechterbovenhoek van het venster. Er verschijnt een tweede venster waarin de app wordt geladen.

Zodra het laden is voltooid, klikt u voor volledige functionaliteit op Openen in browser, rechtsboven in het geladen venster. De gebruiker kan nieuwe weerstandsgegevenssets toevoegen aan IR-TEx gegenereerd met behulp van Anopheles Gambiae 15k Agilent array, zoals beschreven in het TEx-protocol. Open Extra bestand2.txt.

Dit RNA-zoekbestand vertegenwoordigt de sjabloon waarin nieuwe gegevens moeten worden gebaseerd. Kolom A is id, kolom B is onbewerkte Vouwwissel en kolom C is aangepast P-waarde. Voer de R-code uit om id's te matchen in één door tabbladen afgebakend bestand op verschillende platforms en organiseer en normaliseer de gegevens.

Instructies zijn opgenomen in het bestand. Elk bestandspad wordt gescheiden door een slash voor Mac OS of een dubbele slash voor Windows. Maak een back-up van het oorspronkelijke bestand.

Uitvoer het bestand dat aan het einde van supplementaire coatingbestand2 is geproduceerd naar een locatie naar keuze voor gebruik in de volgende stap. Aanvullende codering File2 zal de output van een nieuwe Fold_Changes. txt-bestand.

Voer de code uit in het aanvullende coderingsbestand3. Zoek het uitvoerbestand met de naam FC_DistribPlot. png in de map die is opgegeven als bestandspad.

Controleer de distributies van Log2 Fold Change om te controleren of de Log2 Fold Change-distributies vrijwel identiek zijn voor alle gegevenssets. Hier is de mRNA expressie van GS TMS1 en AGAP 009110 RA in twee multi-resistente Anopheles Coluzzii populaties uit Ivoorkust, en Burkina Faso, respectievelijk. Vergelijking met het lab vatbare Anopheles Coluzzii N-Guzo bleek dat deze transcripties zijn aanzienlijk up-geregeld in twee afzonderlijke multi-resistente populaties.

RNA-I geïnduceerde knock down werd uitgevoerd op muggen uit het LSTM laboratorium T-Oscillae kolonie. Deze kolonie is afkomstig uit Ivoorkust en is bestand tegen alle belangrijke klassen insecticide die in de volksgezondheid worden gebruikt. Demping van de expressie van GS TMS1 resulteerde in een aanzienlijke toename van de mortaliteit, na blootstelling van Delta Matheran, in vergelijking met GFP geïnjecteerde controles, waaruit het belang van dit transcript in Pyrethroïde weerstand.

Omgekeerd heeft agap 009110 RA-neerslag geen significante verandering in de sterfte na blootstelling teweeggekomen. GST MS1 was aanzienlijk meer dan uitgedrukt in 20 van de 21 micro-array datasets beschikbaar voor deze soorten. Op elke locatie was de Fold Change aanzienlijk hoger in het resistente, in vergelijking met de gevoelige populaties.

Alle gegevenssets zijn afkomstig uit verschillende experimenten over vele jaren, en zijn niet ontworpen voor een schone microanalyse-gebaseerde aanpak, dus het kan nodig zijn om de normale P-waarde stringentie te verlagen. Verdere Phenotypic knock down beoordeling kan worden uitgevoerd met andere insecticiden, en levensgeschiedenis eigenschappen. Als er resultaten zien er goed genoeg uit, downstream parasitisatie kan de rol van eiwit te bepalen.

Deze techniek is de eerste toepassing om transcriptomische gegevens over insecticideresistentie van het Anopheles Gambiae soortencomplex te integreren en beschikbaar te maken voor alle onderzoekers op dit gebied.