Presynaptycznie ciche synapsy badane za pomocą mikroskopii świetlnej

Niektóre zakończenia presynaptyczne w ośrodkowym układzie nerwowym wydają się niefunkcjonalne lub ciche. W tym miejscu przedstawiamy protokół identyfikacji cichych końców presynaptycznych. Protokół ten można zastosować do identyfikacji zabiegów i manipulacji, które podejrzewa się o wyciszenie lub przebudzenie terminali.

Protokół łączy znakowanie pęcherzyków synaptycznych barwnikiem podczas depolaryzacji neuronów z późniejszym znakowaniem utrwalonych komórek przeciwciałem, które znakuje wszystkie zakończenia presynaptyczne, zarówno ciche, jak i aktywne. Synapsa. Co znakowane barwnikiem i przeciwciałem są aktywne. Synapsy znakowane tylko przeciwciałami milczą.

Cześć, nazywam się Amanda Taylor i pracuję w laboratorium dr Steve'a Minicka na Wydziale Psychiatrii w Washington University School of Medicine. Nazywam się Shahin i pochodzę z Manic Lab. Dzisiaj chcielibyśmy pokazać Twoją procedurę wizualizacji cichych zakończeń presynaptycznych za pomocą hodowanych neuronów hipokampa.

Używamy tej procedury w naszym laboratorium, aby zbadać, w jaki sposób aktywność elektryczna i inne pojedyncze szlaki nolingowe modulują uwalnianie neuroprzekaźników. Więc zacznijmy. W sterylnym kapturze z przepływem laminarnym użyj HIPA, którego nie można kupić od zera do trzech dni po porodzie od trzech szczurów lub myszy w celu przygotowania zdysocjowanych kultur komórkowych.

Zgodnie z opublikowanym przez nas protokołem, nasze hodowle są mieszanymi kulturami glejowymi Pochodzącymi z tych samych komórek preparacyjnych należy posiać w sterylnych 35-milimetrowych naczyniach. Każdy z nich zawierał szkiełko nakrywkowe o numerze zero, które zostało pokryte pięcioma miligramami na mililitr płytki kolagenowej. Neurony o przybliżonej gęstości 500 komórek na centymetr kwadratowy.

12 szczeniąt szczurów zazwyczaj daje 30 35-milimetrowych szalek. Pozwól kulturom rosnąć w inkubatorze przez 10 do 14 dni. W celu rozwoju i dojrzewania synaps dodaj antymitotyczny C A, aby zatrzymać wzrost gleju w czwartym dniu in vitro.

Również w piątym dniu in vitro należy przeprowadzić wymianę połowy pożywki z pożywką neuro base plus suplementem B 27, aby zwiększyć przeżywalność neuronów w tym okresie dojrzewania. Wprowadź zabiegi, które zmieniają liczbę presynaptycznie cichych synaps. Odkryliśmy, że jednym z wygodnych sposobów na wyciszenie dużego odsetka synaps glutaminianu jest czterogodzinna kuracja 30-milimolowym potasem.

Kiedy kultury są dojrzałe, neurony powinny mieć stosunkowo niską gęstość z dobrze oddzielonymi i rozległymi procesami nerwicowymi. Wyjmij kultury z inkubatora i przenieś je na ławkę. Zastąp pożywkę hodowlaną buforowanym roztworem soli fizjologicznej zawierającym 45 milimolowy chlorek potasu i 10 mikromolową matrycę FM 1 43 FX.

To rozwiązanie powinno również zawierać NBQX i A PV, aby zapobiec powtarzającej się sygnalizacji. Ważne jest, aby roztwór podstawowy FM 1 43 FX i eksperymenty były przechowywane w ciemności, aby zapobiec fotowybielaniu. Dlatego przykryj naczynia hodowlane folią na wszystkie kolejne etapy inkubacji.

Inkubować dokładnie dwie minuty w temperaturze pokojowej. Usuń roztwór barwnika i myj tylko przez trzy do pięciu sekund w stertach buforowanej soli fizjologicznej z 500 mikromolowymi substancjami. Siedem. Aby usunąć niespecyficzny barwnik, czas na tym etapie ma kluczowe znaczenie.

Ponieważ długotrwałe narażenie na adv niekorzystne F seven usunie wszystkie oznaczenia FM 43 FX. Następnie umyj komórki i ułóż zbuforowaną sól fizjologiczną bez niekorzystnego wpływu. Siedem na pięć dwuminutowych odstępów w dygestoriach chemicznych.

Utrwal kultury w 4% paraldehydzie i 0,2% aldehydzie glutarowym w PBS przez 10 minut. Umyj komórki krótko PBS. Ogniwa można teraz wyjąć z dygestorium.

Dodaj roztwór blokujący zawierający 4% normalnej surowicy koziej i 0,04% tritton X, aby zredukować tło i przeniknąć do komórek w celu barwienia immunologicznego. Inkubować przez 15 minut. Wybarwić komórki przeciwciałem vlu T one rozcieńczonym do jednego do 2000 w roztworze blokującym.

Inkubuj kultury w przeciwciałie, delikatnie kołysząc przez trzy godziny. Umyj komórki czterokrotnie PBS. Inkubuj komórki za pomocą Alexy.

6 47 sprzężone przeciwciało przeciwko śwince morskiej rozcieńczone do 1 do 500 w roztworze blokującym. Utrzymuj kultury w przeciwciałie drugorzędowym, delikatnie kołysząc przez 30 minut. Umyj komórki jeszcze cztery razy PBS.

Umieść niewielką kroplę podłogi na czystym szkiełku za pomocą kleszczy. Podnieś szkiełko nakrywkowe i delikatnie opuść je na spadek komórek podłogi skierowanych w stronę szkiełka. Pozostaw szkiełko do wyschnięcia na noc.

Przygotuj obiektyw olejowy 60 x w konfokalnym laserowym mikroskopie skaningowym. Umieść slajd na stole montażowym tak, aby szkiełko nakrywkowe było skierowane w stronę celu. Znajdź pole neurytów, które nie jest zbyt gęste i które znajduje się z dala od somy, która może zatrzymać resztki barwnika.

Powiększ do rozmiaru pola 51 na 51 mikronów. Korzystanie z oprogramowania do akwizycji obrazu. Uzyskaj stos ZS o głębokości 7,8 mikrona w 27 krokach po 0,3 mikrona na każdym kroku.

Najpierw zeskanuj w poszukiwaniu przeciwciała VLU T one, aby zidentyfikować wszystkie synapsy glutaminergiczne w terenie. Następnie ponownie zeskanuj w poszukiwaniu fluorescencji FM 1 43 FX, aby przeanalizować obrazy po akwizycji. Użyj oprogramowania analitycznego, aby przekonwertować przyczepność Z na złożony obraz jednopłaszczyznowy w oparciu o maksymalny odczyt intensywności z dowolnej płaszczyzny przy każdym progu ustawionym pikselu.

Aby zmniejszyć tło, zidentyfikuj zaciski VG glu T one bez odniesienia do plamy efektów FM 1 43. I oznacz te puncta jako obszary zainteresowania. Zazwyczaj wybieramy 10 PUNTA na pole.

Powtórz wybór progów i puncta na obrazie efektów FM 1 43 i nałóż obrazy, aby zidentyfikować ciche synapsy. Kryterium bezwzględnej liczby pikseli lub kryterium procentowej liczby pikseli można użyć do odróżnienia aktywnych dodatnich synaps FM 1 43 od nieaktywnych ujemnych FM 1 43. W naszych kulturach stwierdzamy, że 70 do 80% synaps glutaminianu zdefiniowanych przez barwienie V przesyt jeden wykazuje wykrywalne barwienie FM 1 43 na nałożonych obrazach zielonej fluorescencji FM 1 43 i czerwonego barwienia V przesyt jeden.

Jest to widoczne jako obfitość żółtych synaps puncta z kolokalizowanymi markerami. Są one oznaczone strzałkami. Około 20 do 30% czerwonej przesytu V jedna dodatnia punktacja nie będzie miała zielonej fluorescencji FM 1 43 powyżej linii podstawowej.

Są to nieaktywne zakończenia presynaptyczne, a przykład jest wskazywany przez grot strzałki. Zaobserwowana zostanie również trzecia populacja synaps. Są one dodatnie dla zielonej fluorescencji FM 1 43, ale pozbawione czerwonego zabarwienia B przesyt jeden.

Są to aktywne synapsy GABA-ergiczne, a przykład jest oznaczony gwiazdką. Są one wykluczone z większości naszych analiz, ale można je wyraźnie zbadać za pomocą pęcherzykowego przeciwciała transportującego GABA. Zamiast przeciwciała VLU T one, właśnie pokazaliśmy, jak wizualizować presynaptycznie ciche synapsy za pomocą barwienia immunologicznego FM 1 43 i VLU one.

Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać, że FM 1 43 FX jest wrażliwy zarówno na czas w adver sub seven wash, jak i na stężenie zabiegu X 100 zawartego w roztworze blokującym. Więc to wszystko. Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w eksperymentach.