Presynaptycznie ciche synapsy badane za pomocą mikroskopii świetlnej
4 stycznia 2010
Synapsy glutaminergiczne mogą przełączać się z trybu aktywnego na tryb cichy. Wykazujemy, że stan aktywności presynaptycznej w zdysocjowanej hodowli neuronów gryzoni jest wizualizowany za pomocą utrwalanej formy barwnika FM1-43 do wizualizacji aktywnych synaps i barwienia immunologicznego przeciwciałem vGluT-1 w celu wizualizacji wszystkich synaps glutaminianu.
Niektóre zakończenia presynaptyczne w ośrodkowym układzie nerwowym wydają się niefunkcjonalne lub ciche. W tym miejscu przedstawiamy protokół identyfikacji cichych końców presynaptycznych. Protokół ten można zastosować do identyfikacji zabiegów i manipulacji, które podejrzewa się o wyciszenie lub przebudzenie terminali.
Protokół łączy znakowanie pęcherzyków synaptycznych barwnikiem podczas depolaryzacji neuronów z późniejszym znakowaniem utrwalonych komórek przeciwciałem, które znakuje wszystkie zakończenia presynaptyczne, zarówno ciche, jak i aktywne. Synapsa. Co znakowane barwnikiem i przeciwciałem są aktywne. Synapsy znakowane tylko przeciwciałami milczą.
Cześć, nazywam się Amanda Taylor i pracuję w laboratorium dr Steve'a Minicka na Wydziale Psychiatrii w Washington University School of Medicine. Nazywam się Shahin i pochodzę z Manic Lab. Dzisiaj chcielibyśmy pokazać Twoją procedurę wizualizacji cichych zakończeń presynaptycznych za pomocą hodowanych neuronów hipokampa.
Używamy tej procedury w naszym laboratorium, aby zbadać, w jaki sposób aktywność elektryczna i inne pojedyncze szlaki nolingowe modulują uwalnianie neuroprzekaźników. Więc zacznijmy. W sterylnym kapturze z przepływem laminarnym użyj HIPA, którego nie można kupić od zera do trzech dni po porodzie od trzech szczurów lub myszy w celu przygotowania zdysocjowanych kultur komórkowych.
Zgodnie z opublikowanym przez nas protokołem, nasze hodowle są mieszanymi kulturami glejowymi Pochodzącymi z tych samych komórek preparacyjnych należy posiać w sterylnych 35-milimetrowych naczyniach. Każdy z nich zawierał szkiełko nakrywkowe o numerze zero, które zostało pokryte pięcioma miligramami na mililitr płytki kolagenowej. Neurony o przybliżonej gęstości 500 komórek na centymetr kwadratowy.
12 szczeniąt szczurów zazwyczaj daje 30 35-milimetrowych szalek. Pozwól kulturom rosnąć w inkubatorze przez 10 do 14 dni. W celu rozwoju i dojrzewania synaps dodaj antymitotyczny C A, aby zatrzymać wzrost gleju w czwartym dniu in vitro.
Również w piątym dniu in vitro należy przeprowadzić wymianę połowy pożywki z pożywką neuro base plus suplementem B 27, aby zwiększyć przeżywalność neuronów w tym okresie dojrzewania. Wprowadź zabiegi, które zmieniają liczbę presynaptycznie cichych synaps. Odkryliśmy, że jednym z wygodnych sposobów na wyciszenie dużego odsetka synaps glutaminianu jest czterogodzinna kuracja 30-milimolowym potasem.
Kiedy kultury są dojrzałe, neurony powinny mieć stosunkowo niską gęstość z dobrze oddzielonymi i rozległymi procesami nerwicowymi. Wyjmij kultury z inkubatora i przenieś je na ławkę. Zastąp pożywkę hodowlaną buforowanym roztworem soli fizjologicznej zawierającym 45 milimolowy chlorek potasu i 10 mikromolową matrycę FM 1 43 FX.
To rozwiązanie powinno również zawierać NBQX i A PV, aby zapobiec powtarzającej się sygnalizacji. Ważne jest, aby roztwór podstawowy FM 1 43 FX i eksperymenty były przechowywane w ciemności, aby zapobiec fotowybielaniu. Dlatego przykryj naczynia hodowlane folią na wszystkie kolejne etapy inkubacji.
Inkubować dokładnie dwie minuty w temperaturze pokojowej. Usuń roztwór barwnika i myj tylko przez trzy do pięciu sekund w stertach buforowanej soli fizjologicznej z 500 mikromolowymi substancjami. Siedem. Aby usunąć niespecyficzny barwnik, czas na tym etapie ma kluczowe znaczenie.
Ponieważ długotrwałe narażenie na adv niekorzystne F seven usunie wszystkie oznaczenia FM 43 FX. Następnie umyj komórki i ułóż zbuforowaną sól fizjologiczną bez niekorzystnego wpływu. Siedem na pięć dwuminutowych odstępów w dygestoriach chemicznych.
Utrwal kultury w 4% paraldehydzie i 0,2% aldehydzie glutarowym w PBS przez 10 minut. Umyj komórki krótko PBS. Ogniwa można teraz wyjąć z dygestorium.
Dodaj roztwór blokujący zawierający 4% normalnej surowicy koziej i 0,04% tritton X, aby zredukować tło i przeniknąć do komórek w celu barwienia immunologicznego. Inkubować przez 15 minut. Wybarwić komórki przeciwciałem vlu T one rozcieńczonym do jednego do 2000 w roztworze blokującym.
Inkubuj kultury w przeciwciałie, delikatnie kołysząc przez trzy godziny. Umyj komórki czterokrotnie PBS. Inkubuj komórki za pomocą Alexy.
6 47 sprzężone przeciwciało przeciwko śwince morskiej rozcieńczone do 1 do 500 w roztworze blokującym. Utrzymuj kultury w przeciwciałie drugorzędowym, delikatnie kołysząc przez 30 minut. Umyj komórki jeszcze cztery razy PBS.
Umieść niewielką kroplę podłogi na czystym szkiełku za pomocą kleszczy. Podnieś szkiełko nakrywkowe i delikatnie opuść je na spadek komórek podłogi skierowanych w stronę szkiełka. Pozostaw szkiełko do wyschnięcia na noc.
Przygotuj obiektyw olejowy 60 x w konfokalnym laserowym mikroskopie skaningowym. Umieść slajd na stole montażowym tak, aby szkiełko nakrywkowe było skierowane w stronę celu. Znajdź pole neurytów, które nie jest zbyt gęste i które znajduje się z dala od somy, która może zatrzymać resztki barwnika.
Powiększ do rozmiaru pola 51 na 51 mikronów. Korzystanie z oprogramowania do akwizycji obrazu. Uzyskaj stos ZS o głębokości 7,8 mikrona w 27 krokach po 0,3 mikrona na każdym kroku.
Najpierw zeskanuj w poszukiwaniu przeciwciała VLU T one, aby zidentyfikować wszystkie synapsy glutaminergiczne w terenie. Następnie ponownie zeskanuj w poszukiwaniu fluorescencji FM 1 43 FX, aby przeanalizować obrazy po akwizycji. Użyj oprogramowania analitycznego, aby przekonwertować przyczepność Z na złożony obraz jednopłaszczyznowy w oparciu o maksymalny odczyt intensywności z dowolnej płaszczyzny przy każdym progu ustawionym pikselu.
Aby zmniejszyć tło, zidentyfikuj zaciski VG glu T one bez odniesienia do plamy efektów FM 1 43. I oznacz te puncta jako obszary zainteresowania. Zazwyczaj wybieramy 10 PUNTA na pole.
Powtórz wybór progów i puncta na obrazie efektów FM 1 43 i nałóż obrazy, aby zidentyfikować ciche synapsy. Kryterium bezwzględnej liczby pikseli lub kryterium procentowej liczby pikseli można użyć do odróżnienia aktywnych dodatnich synaps FM 1 43 od nieaktywnych ujemnych FM 1 43. W naszych kulturach stwierdzamy, że 70 do 80% synaps glutaminianu zdefiniowanych przez barwienie V przesyt jeden wykazuje wykrywalne barwienie FM 1 43 na nałożonych obrazach zielonej fluorescencji FM 1 43 i czerwonego barwienia V przesyt jeden.
Jest to widoczne jako obfitość żółtych synaps puncta z kolokalizowanymi markerami. Są one oznaczone strzałkami. Około 20 do 30% czerwonej przesytu V jedna dodatnia punktacja nie będzie miała zielonej fluorescencji FM 1 43 powyżej linii podstawowej.
Są to nieaktywne zakończenia presynaptyczne, a przykład jest wskazywany przez grot strzałki. Zaobserwowana zostanie również trzecia populacja synaps. Są one dodatnie dla zielonej fluorescencji FM 1 43, ale pozbawione czerwonego zabarwienia B przesyt jeden.
Są to aktywne synapsy GABA-ergiczne, a przykład jest oznaczony gwiazdką. Są one wykluczone z większości naszych analiz, ale można je wyraźnie zbadać za pomocą pęcherzykowego przeciwciała transportującego GABA. Zamiast przeciwciała VLU T one, właśnie pokazaliśmy, jak wizualizować presynaptycznie ciche synapsy za pomocą barwienia immunologicznego FM 1 43 i VLU one.
Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać, że FM 1 43 FX jest wrażliwy zarówno na czas w adver sub seven wash, jak i na stężenie zabiegu X 100 zawartego w roztworze blokującym. Więc to wszystko. Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w eksperymentach.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejsze badanie przedstawia protokół identyfikacji cichych zakończeń presynaptycznych w ośrodkowym układzie nerwowym. Dzięki połączeniu znakowania barwnikami witalnymi z immunobarwieniem badacze mogą rozróżnić synapsy aktywne od cichych.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Biologia komórki
- Funkcja synaptyczna
Wstęp
- Niektóre zakończenia presynaptyczne są niefunkcjonalne lub ciche.
- Zrozumienie aktywności synaptycznej jest kluczowe dla badań z zakresu neuronauki.
- Identyfikacja cichych zakończeń może pomóc w badaniu różnych metod leczenia.
- Wizualizacja aktywności synaptycznej może dostarczyć informacji na temat komunikacji neuronalnej.
Cel badania
- Opracowanie wiarygodnej metody identyfikacji niemych zakończeń presynaptycznych.
- Zbadanie wpływu różnych zabiegów na aktywność synaptyczną.
- Pogłębienie zrozumienia dynamiki synaptycznej w sieciach neuronalnych.
Zastosowane metody
- Znakowanie pęcherzyków synaptycznych barwnikiem witalnym podczas depolaryzacji neuronów.
- Immunobarwienie przeciwciałem znakującym wszystkie terminale presynaptyczne.
- Techniki podwójnego znakowania w celu rozróżnienia synaps aktywnych i cichych.
- Wykorzystanie barwnika FM1-43 do wizualizacji aktywnych synaps.
Główne wyniki
- Aktywne synapsy można zwizualizować za pomocą barwnika FM1-43.
- Immunobarwienie ujawnia wszystkie terminale presynaptyczne, w tym te nieme.
- Protokół skutecznie rozróżnia synapsy aktywne od niemych.
- Wyniki przyczyniają się do zrozumienia plastyczności i funkcji synaptycznej.
Wnioski
- Opracowany protokół jest cennym narzędziem w badaniach nad neuronauką.
- Identyfikacja terminali cichych może pomóc w opracowaniu strategii terapeutycznych.
- Metoda ta pozwala na lepsze zrozumienie zachowania synaptycznego.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Identyfikacja synaps nieaktywnych presynaptycznie umożliwia mechanistyczną redukcję ryzyka w walidacji celów terapeutycznych poprzez ujawnienie heterogeniczności funkcjonalnej sieci neuronalnych. Metoda ta zwiększa pewność prognostyczną w testach przesiewowych, odróżniając aktywne od nieaktywnych miejsc uwalniania glutaminianu. Pomaga ona w selekcji projektów badawczych poprzez powiązanie mechanizmów plastyczności synaptycznej z systemami istotnymi dla danej choroby w modelach przedklinicznych.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Weryfikuje hipotezy terapeutyczne poprzez ilościowe określanie stanów wyciszenia lub aktywacji presynaptycznej.
- Wartość operacyjna: Umożliwia biologiczną redukcję ryzyka dzięki bezpośredniej wizualizacji zdolności do uwalniania pęcherzyków.
- Wartość prognostyczna: Zwiększa pewność co do wyboru celu poprzez korelację sygnałów cAMP lub wyciszenia elektrycznego z efektami funkcjonalnymi.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Gotowość do analizy: Przygotowuje zwalidowane systemy biologiczne do oceny związków, wykorzystując kolokalizację sygnałów FM1-43 FX i vGluT-1.
- Wynik ilościowy: Umożliwia standaryzowany pomiar procentu aktywnych synaps za pomocą analizy obrazu opartej na progu odcięcia.
- Powtarzalność: Wspiera ponowne wykorzystanie platformy dzięki standaryzowanym protokołom fiksacji, barwienia i obrazowania.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Znaczenie dla choroby: Łączy plastyczność presynaptyczną ze ścieżkami uczenia się i pamięci zależnymi od hipokampa.
- Ciągłość translacyjna: Łączy odkrycia z walidacją przedkliniczną poprzez monitorowanie adaptacji synaptycznej do stosowanych terapii.
- Postęp z uwzględnieniem ryzyka: Wspiera decyzje o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) poprzez kwantyfikację populacji synaps cichych w warunkach bazowych i modulowanych.
Integracja potoków i przepływów pracy
Metoda ta integruje się z wczesnymi etapami procesów odkrywania leków, zapewniając funkcjonalny odczyt aktywności zakończeń presynaptycznych przed identyfikacją związku wiodącego.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez dotyczących zabiegów zmieniających wyciszenie presynaptyczne poprzez depolaryzację potasową lub aktywację cAMP.
- Przesiewanie: Zapewnia gotową do analizy, powtarzalną kwantyfikację zdolności do uwalniania glutaminianu w dysocjowanych kulturach hipokampa.
- Analityka: Generuje ilościowe pomiary zmiennych zależnych (np. % punktów FM1-43+/vGluT-1+), umożliwiając porównanie poszczególnych warunków.
- Badania translacyjne: Łączy się z ciągłością przedkliniczną poprzez modelowanie adaptacji synaptycznej istotnej dla mechanizmów zaburzeń neuropsychiatrycznych.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Ustanawia powtarzalną możliwość przesiewania modulatorów funkcji presynaptycznych w różnych modelach neuronalnych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwowy
- Wartość naukowa: Pewność prognostyczna w walidacji celu poprzez bezpośrednią ocenę prawdopodobieństwa uwalniania pęcherzyków.
- Wartość operacyjna: Standaryzacja i powtarzalność dzięki protokołowi obrazowania utrwalonych komórek i współbarwienia.
- Wartość strategiczna: Lepsze decyzje typu go/no-go dzięki zmniejszeniu niejednoznaczności mechanistycznej w odniesieniu do efektów działania leków synaptycznych.
- Wpływ na portfolio: Priorytetyzacja skorygowana o ryzyko w oparciu o dane dotyczące funkcjonalnej modulacji synaptycznej.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w hodowli neuronów, mikroskopii konfokalnej oraz analizie obrazów fluorescencyjnych.
- Wymagane jest instrumentarium obejmujące skaningowy mikroskop laserowy z obiektywem olejowym 60x i możliwością akwizycji stosu Z (Z-stack).
- Wymagana jest standaryzacja międzyzespołowa w zakresie czasu barwienia, stężenia barwnika i rygorystyczności przemywania.
- Wymaga rozważenia adaptacji metody dla neuronów pozahippokampalnych lub alternatywnych transporterów pęcherzykowych.
- Obejmuje ograniczenia praktyczne, takie jak wrażliwość FM1-43 FX na czas przemywania kwasem askorbinowym oraz skład roztworu blokującego.
