Name: Presynaptycznie ciche synapsy badane za pomocą mikroskopii świetlnej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-01-04T17:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 2 s
Description: Poznaj metodę identyfikacji presynaptycznie cichych synaps w układzie nerwowym przy użyciu barwienia żywym barwnikiem FM1-43 i immunobarwienia przeciwciałem VGLUT1. Protokół ten pozwala odróżnić aktywne i ciche zakończenia synaptyczne w hodowlach neuronów hipokampalnych szczurów i myszy.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Niniejsza praca była finansowana z grantów NIH DA018109 i MH78823 oraz grantu NIH Neuroscience Blueprint Core Grant P30NS057105 przyznanego Washington University.

Przygotowanie hodowli
<ol>
	<li>Przygotować dysocjowane kultury komórek hipokampa szczura lub myszy pochodzące od zwierząt w wieku od 0 do 3 dni po urodzeniu1. Nasze neurony przylegają do znajdującej się pod nimi monowarstwy astrocytów, która z kolei przylega do warstwy kolagenu naniesionej na szkiełko nakrywkowe o grubości nr 0. Wysiać neurony z gęstością około 500 komórek na centymetr kwadratowy.</li>
	<li>Kultury inkubować przez 10-14 dni, aby umożliwić rozwój i dojrzewanie synaps. W 4. dniu in vitro potraktować kultury lekiem antymitotycznym AraC w celu zahamowania dalszego wzrostu gleju. W 5. dniu in vitro dokonać połowicznej wymiany pożywki na pożywkę Neurobasal z dodatkiem suplementu B27, aby zwiększyć przeżywalność neuronów.</li>
	<li>W okresie hodowli zastosować zabiegi mające na celu zmianę liczby funkcjonalnie wyciszonych synaps. Stwierdziliśmy, że wygodnym sposobem na wyciszenie dużej części (~80%) synaps glutaminergicznych jest 4-godzinna inkubacja z 30 mM potasu. Dłuższa inkubacja ze słabszymi bodźcami depolaryzującymi indukuje podobne wyciszenie2. W celu aktywacji populacji cichych zakończeń w stanie bazowym można zastosować 4-godzinną stymulację 50 μM forskoliną, która jest aktywatorem cyklaz adenylowych3.</li>
</ol>
Wizualizacja synaps cichych
<ol>
	<li>Komórki w 10–14 dniu in vitro powinny mieć stosunkowo niską gęstość i dobrze rozdzielone wypustki neurytowe, aby ułatwić wizualizację poszczególnych terminali synaptycznych za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej.</li>
	<li>Przygotować roztwór zapasowy FM1-43FX o stężeniu 5 mM w wodzie destylowanej. Roztwór zapasowy należy przechowywać w ciemności w temperaturze 4°C. Wszystkie eksperymenty z użyciem FM1-43FX powinny być również przeprowadzane w ciemności.</li>
	<li>Kultury poddać stymulacji przez 2 minuty chlorkiem potasu 45 mM w roztworze soli fizjologicznej buforowanej HEPES, zawierającym 100 mM chlorku sodu, 2 mM chlorku wapnia, 1 mM chlorku magnezu, 10 mM glukozy i 10 μM FM1-43FX. Roztwór ten powinien zawierać również 1 μM NBQX i 25 μM D-APV w celu zablokowania receptorów postsynaptycznych i zapobiegania sygnalizacji zwrotnej. Stymulacja ta spowoduje oznakowanie terminali synaptycznych zdolnych do egzocytozy i endocytozy. Czas i siła stymulacji są tak dobrane, aby wywołać co najmniej jedną rundę egzocytozy wszystkich dostępnych pęcherzyków w puli recyklingowej4. Stymulacja ta nie jest jednak wystarczająca, aby spowodować dodatkowe wyciszenie terminali.</li>
	<li>Przemyć kulturę tylko przez 3 do 5 sekund, używając tej samej soli fizjologicznej buforowanej HEPES bez chlorku potasu, ale z dodatkiem 500 μM Advasep-7 w celu usunięcia niespecyficznego barwnika5. Należy pamiętać, że czas trwania tego etapu jest krytyczny, ponieważ przedłużone stosowanie Advasep-7 doprowadzi do utraty całego oznakowania FM1-43FX. Następnie przemyć w soli fizjologicznej buforowanej HEPES bez Advasep-7 w pięciu 2-minutowych odstępach.</li>
	<li>Utrwalić komórki w 4% paraformaldehydzie i 0,2% glutaraldehydzie w PBS o pH 7,4 przez 10 minut. Przemyć komórki raz, krótko, w PBS, a następnie inkubować przez 15 minut w roztworze blokującym zawierającym 4% normalnej surowicy koziej i 0,04% Triton X-100 w PBS. Należy pamiętać, że FM1-43FX jest również bardzo wrażliwy na ilość użytego tutaj i w późniejszych etapach Triton X-100. Ogólnie rzecz biorąc, oznakowanie FM1-43FX jest najlepsze w przypadku braku Triton X-100, ale pewna ilość detergentu jest niezbędna do permeabilizacji komórek przed kolejnym immunobarwieniem. Doświadczalnie ustaliliśmy, że stężenie 0,04% Triton X-100 jest optymalne do badania synaps wyciszonych presynaptycznie.</li>
	<li>Rozcieńczyć przeciwciało pierwotne anty-vGluT-1 w roztworie blokującym w stosunku 1:2500. Inkubować komórki w rozcieńczonym przeciwciałku anty-vGluT-1 przez 3 godziny w temperaturze pokojowej przy delikatnym wstrząsaniu/rotacji. Należy pamiętać o przykryciu naczyń z kulturą folią, aby zapobiec blaknięciu barwnika FM1-43FX.</li>
	<li>Przemyć komórki dwukrotnie w PBS, a następnie inkubować je z przeciwciałem anty-guineapeg sprzężonym z fluoroforem o innych charakterystykach widmowych niż FM1-43FX, aby rozróżnić oba barwienia. W naszym eksperymencie zastosujemy przeciwciało anty-guineapeg sprzężone z Alexa 555 w rozcieńczeniu 1:500 w roztworze blokującym. Inkubować komórki z przeciwciałem wtórnym przez 30 minut w temperaturze pokojowej przy wstrząsaniu.</li>
	<li>Przemyć komórki jeszcze cztery razy w PBS, a następnie przymocować szkiełko podstawowe do lamali za pomocą małej kropli Fluoromount-G. Należy upewnić się, że lamela jest zorientowana tak, aby komórki były skierowane w stronę szkiełka. Pozostawić preparaty do wyschnięcia przez noc.</li>
	<li>Jesteśmy teraz gotowi do pozyskania obrazów synaps aktywnych i nieaktywnych. Przygotować obiektyw olejowy 60x z aperturą numeryczną 1,4 w konfokalnym skaningowym mikroskopie laserowym. Umieścić preparat na stoliku, upewniając się, że strona z lamelą jest skierowana w stronę obiektywu. Po ustawieniu ostrości znaleźć pole neurytów, które nie jest zbyt gęste. Zaleca się również unikanie obrazowania w pobliżu somy komórkowej, ponieważ mogą tam pozostać resztki barwnika FM1-43FX nawet po intensywnym płukaniu. W naszych obrazach eksperymentalnych zazwyczaj powiększamy obraz do pola o rozmiarze 51 x 51 mikronów.</li>
	<li>Pozyskać stos z-stack danego pola obejmujący głębokość 7,8 mikrona w 27 krokach po 0,3 mikrona. Zakres ten jest wystarczający, aby pokryć grubość neurytów w naszej kulturze. Dla każdego kroku w stosie z-stack najpierw skanować światłem lasera wzbudzającym immunofluorescencję przeciwciała anty-vGluT-1, aby zidentyfikować wszystkie synapsy glutaminergiczne w polu widzenia mikroskopu. To samo pole jest ponownie skanowane w każdym kroku pod kątem fluorescencji FM1-43FX. Ustawić filtry gęstości neutralnej i wzmocnienie fotopowielacza w sposób spójny dla wszystkich lamel w danym eksperymencie, unikając nasycenia sygnału. Zazwyczaj pozyskujemy ≥5 pól na warunek dla każdego eksperymentu.</li>
	<li>Za pomocą oprogramowania analitycznego przekształcić stos z-stack w kompozytowy obraz jednopłaszczyznowy. Proces konwersji, którego używamy, generuje obraz oparty na maksymalnej intensywności z dowolnej płaszczyzny dla każdego piksela. Obraz kompozytowy jest poddawany progowaniu (thresholding), a terminale vGluT-1 są identyfikowane do analizy bez odniesienia do barwienia FM1-43FX. Obszary zabarwione, nazywane punktami (puncta), są oznaczane jako obszary zainteresowania (ROI). Zazwyczaj wybieramy 10 punktów na pole. Następnie poddawany jest progowaniu kanał FM1-43FX i nakładane są obszary zainteresowania. Oprogramowanie analityczne służy do ilościowego określenia intensywności fluorescencji każdego sygnału oraz powierzchni każdego punktu. Aby odróżnić synapsy aktywne od nieaktywnych, można zastosować absolutne kryterium pikselowe lub kryterium procentowe.</li>
</ol>
Reprezentatywne wyniki
<ol>
	<li>W naszych kulturach stwierdzamy, że 70-80% synaps glutaminergicznych, zdefiniowanych za pomocą barwienia vGluT-1, wykazuje wykrywalne barwienie FM1-432, 6-8. Na nałożonych obrazach zielonej fluorescencji FM1-43 i czerwonego barwienia vGluT-1 objawia się to obfitością żółtych punktów: synaps z kolokalizacją markerów. Są one wskazane strzałkami.</li>
	<li>Około 20-30% (czerwonych) punktów dodatnich dla vGluT-1 nie będzie wykazywać (zielonej) fluorescencji FM1-43 powyżej poziomu bazowego. Są to nieaktywne terminale presynaptyczne; przykład wskazano grotem strzałki.</li>
	<li>Zaobserwowana zostanie również trzecia populacja synaps. Są one dodatnie pod kątem (zielonej) fluorescencji FM1-43, ale pozbawione (czerwonego) barwienia vGluT-1. Są to aktywne synapsy GABAergiczne, a przykład wskazano gwiazdką. Są one wykluczone z większości naszych analiz, ale mogą być bezpośrednio badane przy użyciu przeciwciała przeciwko pęcherzykowemu transporterowi GABA zamiast przeciwciała vGluT-1.</li>
</ol>

<ol><li>Mennerick, S., Que, J., Benz, A., Zorumski, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Passive+and+synaptic+properties+of+hippocampal+neurons+grown+in+microcultures+and+in+mass+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Passive and synaptic properties of hippocampal neurons grown in microcultures and in mass cultures.</a> J. Neurophysiol. 73, 320-332 (1995).</li>
<li>Moulder, K. L., Jiang, X., Taylor, A. A., Olney, J. W., Mennerick, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiological+activity+depresses+synaptic+function+through+an+effect+on+vesicle+priming%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Physiological activity depresses synaptic function through an effect on vesicle priming.</a> J. Neurosci. 26, 6618-6626 (2006).</li>
<li>Moulder, K. L., Jiang, X., Chang, C., Taylor, A. A., Benz, A. M., Conti, A. C., Muglia, L. J., Mennerick, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+specific+role+for+Ca2%2B-dependent+adenylyl+cyclases+in+recovery+from+adaptive+presynaptic+silencing%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">A specific role for Ca2+-dependent adenylyl cyclases in recovery from adaptive presynaptic silencing.</a> J. Neurosci. 28, 5159-5168 (2008).</li>
<li>Sara, Y., Mozhayeva, M. G., Liu, X., Kavalali, E. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+vesicle+recycling+supports+neurotransmission+during+sustained+stimulation+at+hippocampal+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Fast vesicle recycling supports neurotransmission during sustained stimulation at hippocampal synapses.</a> J. Neurosci. 22, 1608-1617 (2002).</li>
<li>Kay, A. R., Alfonso, A., Alford, S., Cline, H. T., Holgado, A. M., Sakmann, B., Snitsarev, V. A., Stricker, T. P., Takahashi, M., Wu, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+synaptic+activity+in+intact+brain+and+slices+with+FM1-43+in+C.+elegans%2C+lamprey%2C+and+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Imaging synaptic activity in intact brain and slices with FM1-43 in C. elegans, lamprey, and rat.</a> Neuron. 24, 809-817 (1999).</li>
<li>Rosenmund, C., Sigler, A., Augustin, I., Reim, K., Brose, N., Rhee, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+control+of+vesicle+priming+and+short-term+plasticity+by+Munc13+isoforms%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Differential control of vesicle priming and short-term plasticity by Munc13 isoforms.</a> Neuron. 33, 411-424 (2002).</li>
<li>Altrock, W. D., tom Dieck, S., Sokolov, M., Meyer, A. C., Sigler, A., Brakebusch, C., Fassler, R., Richter, K., Boeckers, T. M., Potschka, H., Brandt, C., Loscher, W., Grimberg, D., Dresbach, T., Hempelmann, A., Hassan, H., Balschun, D., Frey, J. U., Brandstatter, J. H., Garner, C. C., Rosenmund, C., Gundelfinger, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+inactivation+of+a+fraction+of+excitatory+synapses+in+mice+deficient+for+the+active+zone+protein+bassoon%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Functional inactivation of a fraction of excitatory synapses in mice deficient for the active zone protein bassoon.</a> Neuron. 37, 787-800 (2003).</li>
<li>Ting, J. T., Kelley, B. G., Lambert, T. J., Cook, D. G., Sullivan, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amyloid+precursor+protein+overexpression+depresses+excitatory+transmission+through+both+presynaptic+and+postsynaptic+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Amyloid precursor protein overexpression depresses excitatory transmission through both presynaptic and postsynaptic mechanisms.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 104, 353-348 (2007).</li>
</ol>

Znaczenie
<ol>
	<li>Zazwyczaj uważa się, że synapsy działają poprzez uwalnianie transmitera z mierzalnym prawdopodobieństwem. Prace nasze oraz innych badaczy wykazują, że niektóre synapsy są oporne na uwalnianie neurotransmitera, pomimo pełnego zestawu pęcherzykowego transportera neurotransmitera oraz innych kluczowych markerów presynaptycznych2, 6-8. Wykazaliśmy wcześniej, że podstawowa aktywność sieciowa neuronów jest krytyczna dla utrzymania tej populacji nieaktywnych synaps.</li>
</ol>
<p class="jove_t...

<table><tbody><tr><td>FM1-43FX</td><td>Invitrogen</td><td>F-35355</td><td>Dostępny jest również przesunięty w stronę czerwieni FM4-64FX, jednak nie okazał się on tak odpowiedni do analiz wyciszania presynaptycznego.</td></tr><tr><td>Advasep-7</td><td>CyDex</td><td>AR-0A7-001</td><td></td></tr><tr><td>vGluT-1</td><td>EMD Millipore</td><td>AB5905</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-GP sprzężone z Alexa 647</td><td>Invitrogen</td><td>A-21450</td><td></td></tr><tr><td>Fluoromount-G</td><td>SouthernBiotech</td><td>0100-01</td><td></td></tr></tbody></table>

badanie presynaptycznie cichych synaps z wykorzystaniem mikroskopii świetlnej

Presynaptically Silent Synapses Studied with Light Microscopy

Plastyczność synaptyczna prawdopodobnie leży u podstaw zdolności układu nerwowego do uczenia się i zapamiętywania, a także może stanowić mechanizm adaptacyjny zapobiegający przekształceniu się potencjalnie szkodliwych czynników w bodźce neurotoksyczne. Badaliśmy formę plastyczności presynaptycznej, która jest interesująca m.in. ze względu na to, że przejawia się jako cyfrowe przełączanie (włączanie i wyłączanie) zdolności terminala presynaptycznego do uwalniania pęcherzyków zawierających neuroprzekaźnik glutaminian. W niniejszej pracy prezentujemy protokół wizualizacji statusu aktywności terminali presynaptycznych w dysocjowanych kulturach komórkowych przygotowanych z hipokampa gryzoni. Metoda opiera się na wykrywaniu aktywnych synaps poprzez barwienie utrwalalną formą barwnika styrylowego FM1-43, powszechnie stosowanego do znakowania pęcherzyków synaptycznych. Profil tego barwienia jest porównywany z immunobarwieniem tych samych terminali przeciwciałem skierowanym przeciwko pęcherzykowemu transporterowi glutaminianu 1 (vGluT-1), który służy do znakowania wszystkich synaps glutaminergicznych, niezależnie od ich statusu aktywacji. Stwierdziliśmy, że bodźce depolaryzujące indukują wyciszenie presynaptyczne. Populacja synaps, która jest nieaktywna w warunkach bazowych, może zostać aktywowana poprzez długotrwałe elektryczne wyciszenie lub poprzez aktywację szlaków sygnalizacyjnych cAMP.

Synapsy glutaminergiczne mogą przełączać się z trybu aktywnego w tryb cichy. Wykazujemy, że status aktywności presynaptycznej w dysocjowanej kulturze neuronów gryzoni można zwizualizować, wykorzystując utrwalalną formę barwnika FM1-43 do obrazowania synaps aktywnych oraz immunobarwienie przeciwciałami przeciwko vGluT-1 w celu wizualizacji wszystkich synaps glutaminergicznych.

Badanie presynaptycznie cichych synaps z wykorzystaniem mikroskopii świetlnej

Plastyczność synaptyczna prawdopodobnie leży u podstaw zdolności układu nerwowego do uczenia się i zapamiętywania, a także może reprezentować adaptacyjność, która zapobiega w przeciwnym razie ...

Niektóre terminale presynaptyczne w ośrodkowym układzie nerwowym wydają się niefunkcjonalne lub ciche. Przedstawiamy tutaj protokół identyfikacji cichych terminali presynaptycznych. Protokół ten można zastosować do identyfikacji metod leczenia i manipulacji, które w podejrzeniu prowadzą do wyciszenia lub aktywacji terminali.Protokół ten łączy znakowanie pęcherzyków synaptycznych barwnikiem witalnym podczas depolaryzacji neuronów z późniejszym znakowaniem utrwalonych komórek przeciwciałem, które wybarwia wszystkie terminale presynaptyczne, zarówno ciche, jak i aktywne. Synapsy oznakowane jednocześnie barwnikiem i przeciwciałem są aktywne. Synapsy oznakowane wyłącznie przeciwciałem są ciche.Witajcie, nazywam się Amanda Taylor i pochodzę z laboratorium dr. Steve'a Minicka z Katedry Psychiatrii w Washington University School of Medicine. Jestem również Shahin z laboratorium Manica. Dzisiaj chcielibyśmy zaprezentować Państwu procedurę wizualizacji cichych terminali presynaptycznych z wykorzystaniem hodowli neuronów hipokampa.Stosujemy tę procedurę w naszym laboratorium, aby zbadać, w jaki sposób aktywność elektryczna oraz inne szlaki sygnalizacji pojedynczej modulują uwalnianie neurotransmiterów. Przejdźmy zatem do pracy. W sterylnej komorze z laminarnym przepływem powietrza użyj HIPA, aby pobrać materiał od szczurów lub myszy w wieku od 0 do 3 dni po urodzeniu w celu przygotowania dysocjowanych kultur komórkowych.Zgodnie z naszym opublikowanym protokołem, nasze hodowle to mieszane hodowle glejowe pochodzące z tej samej dyssekcji; komórki należy wysiać w sterylnych szalkach 35 mm. Każda z nich powinna zawierać szkiełko przedmiotowe numer zero, pokryte kolagenem w stężeniu 5 mg/mL. Neurony wysiewamy z przybliżoną gęstością 500 komórek/cm².12 szczeniąt szczura zazwyczaj pozwala na przygotowanie 30 szalek o średnicy 35 milimetrów. Pozostaw kultury do wzrostu w inkubatorze przez 10 do 14 dni. W celu rozwoju i dojrzewania synaps, w czwartym dniu in vitro dodaj środek antymitotyczny a C, aby zahamować wzrost gleju.Również w piątym dniu in vitro należy przeprowadzić połowiczną wymianę pożywki na pożywkę neurobasal z dodatkiem suplementu B 27, aby zwiększyć przeżywalność neuronów w tym okresie dojrzewania. Należy wprowadzić zabiegi zmieniające liczbę presynaptycznie cichych synaps. Stwierdzono, że wygodnym sposobem na wyciszenie dużego odsetka synaps glutaminianergicznych jest czterogodzinna inkubacja z 30 mM potasu.Gdy kultury dojrzeją, neurony powinny mieć stosunkowo niską gęstość z dobrze odseparowanymi i rozbudowanymi wypustkami neuronalnymi. Wyjmij kultury z inkubatora i przenieś je na blat laboratoryjny. Zastąp pożywkę hodowlaną buforowanym roztworem soli fizjologicznej zawierającym 45 millimolar potassium chloride oraz 10 micromolar barwnika FM 1 43 FX.Roztwór ten powinien zawierać również NBQX oraz APV, aby zapobiec sygnalizacji powrotnej. Ważne jest, aby roztwór zapasowy FM 1 43 FX oraz prowadzone eksperymenty były przechowywane w ciemności, aby zapobiec fotobleachingowi. Dlatego należy przykryć naczynia hodowlane folią podczas wszystkich kolejnych etapów inkubacji.Inkubować dokładnie przez dwie minuty w temperaturze pokojowej. Usunąć roztwór barwnika i płukać przez zaledwie trzy do pięciu sekund w buforze fosforanowym (PBS) z 500 µM azotu. W celu usunięcia nieswoistego wiązania barwnika, precyzyjny czas trwania tego etapu jest krytyczny.Ponieważ przedłużona ekspozycja na adv adverse F seven spowoduje usunięcie całego znakowania FM 43 FX, należy następnie przemyć komórki w roztworze fosforanu soli buforowanej (PBS) bez adv adverse Seven w pięciu dwuminutowych odstępach czasu w dygestorium chemicznym.Utrwalić hodowle w 4%paraldehydzie i 0,2%glutaraldehydzie w PBS przez 10 minut. Krótko przemyć komórki PBS. Komórki można teraz wyjąć z dygestorium.Dodaj roztwór blokujący zawierający 4% normalnego surowicy koziej oraz 0,04% Triton X, aby zredukować tło i zwiększyć przepuszczalność komórek dla barwienia immunologicznego. Inkubuj przez 15 minut. Obarw komórki przeciwciałem vlu T one rozcieńczonym w roztworze blokującym w stosunku 1:2000.Inkubować hodowle w przeciwciałach przy delikatnym kołysaniu przez trzy godziny. Przemyć komórki czterokrotnie PBS. Inkubować komórki z Alexa.Przeciwciało anty-świnka morska sprzężone z 6 47 rozcieńczone 1:500 w roztworze blokującym. Hodowle inkubować z przeciwciałem wtórnym przez 30 minut przy delikatnym kołysaniu. Komórki przemyć jeszcze cztery razy buforem PBS.Za pomocą pęsety nanieś małą kroplę zawiesiny komórek na czyste szkiełko przedmiotowe. Podnieś szkiełko nakrywkowe i ostrożnie opuść je na kroplę, tak aby komórki przylegały do szkiełka przedmiotowego. Pozostaw preparat do wyschnięcia na noc.Przygotuj obiektyw immersyjny 60x z olejem w konfokalnym skaningowym mikroskopie laserowym. Umieść preparat na stoliku tak, aby szkiełko zakryciowe było skierowane w stronę obiektywu. Znajdź pole z neurytami, które nie jest zbyt gęste i znajduje się z dala od somy, w której może zalegać resztkowy barwnik.Ustaw powiększenie tak, aby pole widzenia wynosiło 51 by 51 mikronów. Korzystając z oprogramowania do akwizycji obrazu, wykonaj stos ZS obejmujący głębokość 7.8 mikronów w 27 krokach o wielkości 0.3 mikronów na każdy krok.Najpierw wykonaj skanowanie pod kątem przeciwciała VLU T one, aby zidentyfikować wszystkie synapsy glutaminergiczne w polu widzenia. Następnie ponownie przeskanuj próbkę pod kątem fluorescencji FM 1 43 FX, aby przeanalizować obrazy po akwizycji. Użyj oprogramowania analitycznego, aby przekształcić stos Z w kompozytowy obraz jednej płaszczyzny na podstawie maksymalnego odczytu intensywności z dowolnej płaszczyzny dla każdego piksela, ustawiając próg.Aby zmniejszyć tło, zidentyfikuj terminale VG glu T one bez odniesienia do barwienia FM 1 43. Następnie oznacz te punkta jako obszary zainteresowania. Zazwyczaj wybieramy 10 PUNTA na pole widzenia.Powtórz proces progowania i wyboru punktów (puncta) na obrazie efektów FM 1 43, a następnie nałóż obrazy na siebie w celu zidentyfikowania synaps cichych. Aby odróżnić aktywne synapsy FM 1 43-dodatnie od nieaktywnych FM 1 43-ujemnych, można zastosować bezwzględne kryterium pikseli lub kryterium procentowe. W naszych kulturach stwierdzono, że 70 do 80% synaps glutaminianergicznych zdefiniowanych przez barwienie V glut one wykazuje wykrywalne barwienie FM 1 43 na nałożonych obrazach zielonej fluorescencji FM 1 43 i czerwonego barwienia V glut one.Jest to widoczne jako obfitość żółtych punktów synaptycznych z kolokalizacją markerów. Są one wskazane strzałkami. Około 20 do 30% czerwonych punktów dodatnich dla Vglut1 nie wykazuje zielonej fluorescencji FM 1-43 powyżej poziomu bazowego.Są to nieaktywne terminale presynaptyczne, a przykład jednego z nich wskazano grotem strzałki. Zaobserwowana zostanie również trzecia populacja synaps. Wykazują one pozytywną zieloną fluorescencję FM 1 43, lecz są pozbawione czerwonego barwienia B glut one.Są to aktywne synapsy GABAergiczne, a przykład jednej z nich zaznaczono gwiazdką. Są one wykluczone z większości naszych analiz, lecz można je badać bezpośrednio, stosując przeciwciało przeciwko pęcherzykowemu transporterowi GABA. Zamiast przeciwciała przeciwko VGLUT1, pokazaliśmy właśnie, jak wizualizować presynaptycznie ciche synapsy, wykorzystując barwienie FM 1-43 oraz immunobarwienie VGLUT1.Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać, że FM 1 43 FX jest wrażliwy zarówno na czas przebywania w roztworze piorącym adver sub seven, jak i na stężenie środka traktującego X 100 zawartego w roztworze blokującym. To wszystko. Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w eksperymentach.

presynaptically-silent-synapses-studied-with-light-microscopy

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Presynaptycznie ciche synapsy badane za pomocą mikroskopii świetlnej

Niniejszy protokół szczegółowo opisuje sposób ilościowego oznaczania liczby synaps zarówno w dysocjowanych kulturach neuronowych, jak i w przekrojach mózgu z wykorzystaniem immunocytochemii. Przy użyciu przeciwciał specyficznych dla poszczególnych przedziałów komórkowych znakujemy terminale presynaptyczne oraz miejsca specjalizacji postsynaptycznej. Synapsy definiujemy jako punkty kolokalizacji sygnałów generowanych przez te markery.

Ilościowe oznaczanie synaps: test oparty na immunocytochemii do ilościowego oznaczania liczby synaps

Niniejszy raport demonstruje technikę mechanicznej izolacji pojedynczych żywych neuronów z zachowaniem przytwierdzonych boutonów presynaptycznych. Neurony poddane wibrodysocjacji charakteryzują się zaletami takimi jak szybki czas przygotowania, doskonała kontrola farmakologiczna oraz usprawniona stabilizacja potencjału błonowego (space-clamp) bez wpływu komórek sąsiednich. Metoda ta może być wykorzystywana do obrazowania elementów synaptycznych oraz rejestracji metodą patch-clamp.

Wibrodysocjacja neuronów z plastrów mózgu gryzoni w celu badania transmisji synaptycznej i obrazowania terminali presynaptycznych

Ten film demonstruje rejestrację wywołanych światłem reakcji postsynaptycznych w dostosowanym do ciemności preparacie tkanki siatkówki myszy. Wycinek siatkówki umieszcza się w komorze rejestrującej, a pipeta rejestrująca służy do ustalenia ciągłości elektrycznej z komórką zwojową siatkówki. Impulsy świetlne są stosowane do generowania pobudzających potencjałów postsynaptycznych w komórkach zwojowych, które są rejestrowane przez pipetę.

Wywołane światłem reakcje postsynaptyczne w neuronach wycinków siatkówki myszy

Opisujemy użycie styrylowych barwników FM do obrazowania recyklingu pęcherzyków synaptycznych w funkcjonalnych zakończeniach nerwowych. Protokół ten może być stosowany nie tylko do wywołanych, ale także spontanicznych i miniaturowych aktywności synaptycznych. Protokół rozszerza różnorodność zdarzeń synaptycznych, które można skutecznie ocenić.<br...

Badanie recyklingu pęcherzyków synaptycznych za pomocą barwników FM podczas wywołanych, spontanicznych i miniaturowych aktywności synaptycznych

Pokażemy, jak przygotować wycinki siatkówki z oka myszy i rejestrować reakcje świetlne w neuronach siatkówki. Cała procedura przeprowadzana jest w warunkach przystosowanych do ciemności.

Rejestrowanie wywołanych światłem odpowiedzi postsynaptycznych w neuronach w adaptowanych do ciemności, mysich preparatach siatkówki przy użyciu technik patch clamp

Ten film pokazuje procedurę kraniotomii, która umożliwia przewlekłe obrazowanie neuronów w korze zaśledziony myszy za pomocą mikroskopii dwufotonowej in vivo w linii transgenicznej Thy1-GFP. Podejście to łączy się z wstrzyknięciem do grzbietowego hipokampa wirusa związanego z ekspresją mCherry. Techniki te pozwalają na długoterminowe monitorowanie plastyczności strukturalnej zależnej od doświadczenia w RSC.

Jednoczesne dwufotonowe obrazowanie in vivo wejść synaptycznych i celów postsynaptycznych w korze zaśledzinowej myszy

Tutaj pokazujemy, jak określić ilościowo liczbę i rozkład przestrzenny aktywnych stref synaptycznych w fotoreceptorach Drosophila melanogaster, wyróżnionych genetycznie zakodowanym markerem molekularnym, oraz ich modulację po długotrwałej ekspozycji na światło.

Analiza modulacji synaptycznej fotoreceptorów Drosophila melanogaster po ekspozycji na przedłużone światło

Ten protokół pokazuje, jak wykorzystać mikroskopię superrozdzielczą do badania kolokalizacji białek w pierwotnych kulturach neuronalnych.

Obrazowanie superrozdzielcze w celu zbadania kolokalizacji białek i markerów synaptycznych w neuronach pierwotnych

Opisano dwie powiązane metody wizualizacji zdarzeń subkomórkowych wymaganych do transmisji synaptycznej. Protokoły te umożliwiają monitorowanie w czasie rzeczywistym dynamiki napływu presynaptycznego wapnia i fuzji błony pęcherzyków synaptycznych przy użyciu obrazowania żywych komórek neuronów hodowanych in vitro.

Fluorescencyjny pomiar funkcji synaptycznych w czasie rzeczywistym w modelach stwardnienia zanikowego bocznego

DetectSyn to bezstronny, szybki test fluorescencyjny, który mierzy zmiany we względnej liczbie synaps (zaangażowanie pre- i postsynaptyczne) w różnych terapiach lub stanach chorobowych. Technika ta wykorzystuje technikę ligacji zbliżeniowej, która może być stosowana zarówno w hodowanych neuronach, jak i w tkance stałej.

DetectSyn: szybka, bezstronna metoda fluorescencyjna do wykrywania zmian w gęstości synaps

Prezentowany protokół opisuje zastosowanie transmisyjnej mikroskopii elektronowej (TEM) do ilościowego określania zmian okołodobowych w korze myszy, koncentrując się głównie na liczbie synaps i morfologii kolców dendrytycznych.

Transmisyjna mikroskopia elektronowa jako technika wizualizacji do analizy okołodobowej plastyczności synaptycznej w korze mięśniowej myszy

Poznaj metodę identyfikacji presynaptycznie cichych synaps w układzie nerwowym przy użyciu barwienia żywym barwnikiem FM1-43 i immunobarwienia przeciwciałem VGLUT1. Protokół ten pozwala odróżnić aktywne i ciche zakończenia synaptyczne w hodowlach neuronów hipokampalnych szczurów i myszy.

Badanie presynaptycznie cichych synaps z wykorzystaniem mikroskopii świetlnej

Przeglądaj więcej filmów