Presynaptycznie ciche synapsy badane za pomocą mikroskopii świetlnej
January 4th, 2010
Synapsy glutaminergiczne mogą przełączać się z trybu aktywnego na tryb cichy. Wykazujemy, że stan aktywności presynaptycznej w zdysocjowanej hodowli neuronów gryzoni jest wizualizowany za pomocą utrwalanej formy barwnika FM1-43 do wizualizacji aktywnych synaps i barwienia immunologicznego przeciwciałem vGluT-1 w celu wizualizacji wszystkich synaps glutaminianu.
Niektóre zakończenia presynaptyczne w ośrodkowym układzie nerwowym wydają się niefunkcjonalne lub ciche. W tym miejscu przedstawiamy protokół identyfikacji cichych końców presynaptycznych. Protokół ten można zastosować do identyfikacji zabiegów i manipulacji, które podejrzewa się o wyciszenie lub przebudzenie terminali.
Protokół łączy znakowanie pęcherzyków synaptycznych barwnikiem podczas depolaryzacji neuronów z późniejszym znakowaniem utrwalonych komórek przeciwciałem, które znakuje wszystkie zakończenia presynaptyczne, zarówno ciche, jak i aktywne. Synapsa. Co znakowane barwnikiem i przeciwciałem są aktywne. Synapsy znakowane tylko przeciwciałami milczą.
Cześć, nazywam się Amanda Taylor i pracuję w laboratorium dr Steve'a Minicka na Wydziale Psychiatrii w Washington University School of Medicine. Nazywam się Shahin i pochodzę z Manic Lab. Dzisiaj chcielibyśmy pokazać Twoją procedurę wizualizacji cichych zakończeń presynaptycznych za pomocą hodowanych neuronów hipokampa.
Używamy tej procedury w naszym laboratorium, aby zbadać, w jaki sposób aktywność elektryczna i inne pojedyncze szlaki nolingowe modulują uwalnianie neuroprzekaźników. Więc zacznijmy. W sterylnym kapturze z przepływem laminarnym użyj HIPA, którego nie można kupić od zera do trzech dni po porodzie od trzech szczurów lub myszy w celu przygotowania zdysocjowanych kultur komórkowych.
Zgodnie z opublikowanym przez nas protokołem, nasze hodowle są mieszanymi kulturami glejowymi Pochodzącymi z tych samych komórek preparacyjnych należy posiać w sterylnych 35-milimetrowych naczyniach. Każdy z nich zawierał szkiełko nakrywkowe o numerze zero, które zostało pokryte pięcioma miligramami na mililitr płytki kolagenowej. Neurony o przybliżonej gęstości 500 komórek na centymetr kwadratowy.
12 szczeniąt szczurów zazwyczaj daje 30 35-milimetrowych szalek. Pozwól kulturom rosnąć w inkubatorze przez 10 do 14 dni. W celu rozwoju i dojrzewania synaps dodaj antymitotyczny C A, aby zatrzymać wzrost gleju w czwartym dniu in vitro.
Również w piątym dniu in vitro należy przeprowadzić wymianę połowy pożywki z pożywką neuro base plus suplementem B 27, aby zwiększyć przeżywalność neuronów w tym okresie dojrzewania. Wprowadź zabiegi, które zmieniają liczbę presynaptycznie cichych synaps. Odkryliśmy, że jednym z wygodnych sposobów na wyciszenie dużego odsetka synaps glutaminianu jest czterogodzinna kuracja 30-milimolowym potasem.
Kiedy kultury są dojrzałe, neurony powinny mieć stosunkowo niską gęstość z dobrze oddzielonymi i rozległymi procesami nerwicowymi. Wyjmij kultury z inkubatora i przenieś je na ławkę. Zastąp pożywkę hodowlaną buforowanym roztworem soli fizjologicznej zawierającym 45 milimolowy chlorek potasu i 10 mikromolową matrycę FM 1 43 FX.
To rozwiązanie powinno również zawierać NBQX i A PV, aby zapobiec powtarzającej się sygnalizacji. Ważne jest, aby roztwór podstawowy FM 1 43 FX i eksperymenty były przechowywane w ciemności, aby zapobiec fotowybielaniu. Dlatego przykryj naczynia hodowlane folią na wszystkie kolejne etapy inkubacji.
Inkubować dokładnie dwie minuty w temperaturze pokojowej. Usuń roztwór barwnika i myj tylko przez trzy do pięciu sekund w stertach buforowanej soli fizjologicznej z 500 mikromolowymi substancjami. Siedem. Aby usunąć niespecyficzny barwnik, czas na tym etapie ma kluczowe znaczenie.
Ponieważ długotrwałe narażenie na adv niekorzystne F seven usunie wszystkie oznaczenia FM 43 FX. Następnie umyj komórki i ułóż zbuforowaną sól fizjologiczną bez niekorzystnego wpływu. Siedem na pięć dwuminutowych odstępów w dygestoriach chemicznych.
Utrwal kultury w 4% paraldehydzie i 0,2% aldehydzie glutarowym w PBS przez 10 minut. Umyj komórki krótko PBS. Ogniwa można teraz wyjąć z dygestorium.
Dodaj roztwór blokujący zawierający 4% normalnej surowicy koziej i 0,04% tritton X, aby zredukować tło i przeniknąć do komórek w celu barwienia immunologicznego. Inkubować przez 15 minut. Wybarwić komórki przeciwciałem vlu T one rozcieńczonym do jednego do 2000 w roztworze blokującym.
Inkubuj kultury w przeciwciałie, delikatnie kołysząc przez trzy godziny. Umyj komórki czterokrotnie PBS. Inkubuj komórki za pomocą Alexy.
6 47 sprzężone przeciwciało przeciwko śwince morskiej rozcieńczone do 1 do 500 w roztworze blokującym. Utrzymuj kultury w przeciwciałie drugorzędowym, delikatnie kołysząc przez 30 minut. Umyj komórki jeszcze cztery razy PBS.
Umieść niewielką kroplę podłogi na czystym szkiełku za pomocą kleszczy. Podnieś szkiełko nakrywkowe i delikatnie opuść je na spadek komórek podłogi skierowanych w stronę szkiełka. Pozostaw szkiełko do wyschnięcia na noc.
Przygotuj obiektyw olejowy 60 x w konfokalnym laserowym mikroskopie skaningowym. Umieść slajd na stole montażowym tak, aby szkiełko nakrywkowe było skierowane w stronę celu. Znajdź pole neurytów, które nie jest zbyt gęste i które znajduje się z dala od somy, która może zatrzymać resztki barwnika.
Powiększ do rozmiaru pola 51 na 51 mikronów. Korzystanie z oprogramowania do akwizycji obrazu. Uzyskaj stos ZS o głębokości 7,8 mikrona w 27 krokach po 0,3 mikrona na każdym kroku.
Najpierw zeskanuj w poszukiwaniu przeciwciała VLU T one, aby zidentyfikować wszystkie synapsy glutaminergiczne w terenie. Następnie ponownie zeskanuj w poszukiwaniu fluorescencji FM 1 43 FX, aby przeanalizować obrazy po akwizycji. Użyj oprogramowania analitycznego, aby przekonwertować przyczepność Z na złożony obraz jednopłaszczyznowy w oparciu o maksymalny odczyt intensywności z dowolnej płaszczyzny przy każdym progu ustawionym pikselu.
Aby zmniejszyć tło, zidentyfikuj zaciski VG glu T one bez odniesienia do plamy efektów FM 1 43. I oznacz te puncta jako obszary zainteresowania. Zazwyczaj wybieramy 10 PUNTA na pole.
Powtórz wybór progów i puncta na obrazie efektów FM 1 43 i nałóż obrazy, aby zidentyfikować ciche synapsy. Kryterium bezwzględnej liczby pikseli lub kryterium procentowej liczby pikseli można użyć do odróżnienia aktywnych dodatnich synaps FM 1 43 od nieaktywnych ujemnych FM 1 43. W naszych kulturach stwierdzamy, że 70 do 80% synaps glutaminianu zdefiniowanych przez barwienie V przesyt jeden wykazuje wykrywalne barwienie FM 1 43 na nałożonych obrazach zielonej fluorescencji FM 1 43 i czerwonego barwienia V przesyt jeden.
Jest to widoczne jako obfitość żółtych synaps puncta z kolokalizowanymi markerami. Są one oznaczone strzałkami. Około 20 do 30% czerwonej przesytu V jedna dodatnia punktacja nie będzie miała zielonej fluorescencji FM 1 43 powyżej linii podstawowej.
Są to nieaktywne zakończenia presynaptyczne, a przykład jest wskazywany przez grot strzałki. Zaobserwowana zostanie również trzecia populacja synaps. Są one dodatnie dla zielonej fluorescencji FM 1 43, ale pozbawione czerwonego zabarwienia B przesyt jeden.
Są to aktywne synapsy GABA-ergiczne, a przykład jest oznaczony gwiazdką. Są one wykluczone z większości naszych analiz, ale można je wyraźnie zbadać za pomocą pęcherzykowego przeciwciała transportującego GABA. Zamiast przeciwciała VLU T one, właśnie pokazaliśmy, jak wizualizować presynaptycznie ciche synapsy za pomocą barwienia immunologicznego FM 1 43 i VLU one.
Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać, że FM 1 43 FX jest wrażliwy zarówno na czas w adver sub seven wash, jak i na stężenie zabiegu X 100 zawartego w roztworze blokującym. Więc to wszystko. Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w eksperymentach.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Przegląd
Niniejsze badanie przedstawia protokół identyfikacji cichych terminali presynaptycznych w centralnym układzie nerwowym. Łączenie oznaczania barwnikami żywymi z immunobarwieniem umożliwia badaczom rozróżnienie aktywnych i cichych synaps.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Biologia komórki
- Funkcja synaptyczna
Tło
- Niektóre terminale presynaptyczne są niefunkcjonalne lub ciché.
- Rozumienie aktywności synaptycznej jest kluczowe dla badań neuronauki.
- Identyfikowanie cichych terminali może pomóc w badaniu różnych terapii.
- Wizualizacja aktywności synaptycznej może dostarczyć wglądu w komunikację neuronową.
Cel badania
- Opracowanie niezawodnej metody identyfikacji cichych terminali presynaptycznych.
- Zbadanie wpływu terapii na aktywność synaptyczną.
- Zgłębienie zrozumienia dynamiki synaptycznej w sieciach neuronowych.
Zastosowane metody
- Oznaczanie barwnikami żywymi pęcherzyków synaptycznych podczas depolaryzacji neuronów.
- Immunobarwienie przeciwciałem, które oznacza wszystkie terminale presynaptyczne.
- Techniki współoznaczania w celu rozróżnienia aktywnych i cichych synaps.
- Zastosowanie barwnika FM1-43 do wizualizacji aktywnych synaps.
Główne wyniki
- Aktywne synapsy można wizualizować za pomocą barwnika FM1-43.
- Immunobarwienie ujawnia wszystkie terminale presynaptyczne, w tym ciché.
- Protokół skutecznie rozróżnia aktywne i ciché synapsy.
- Wyniki przyczyniają się do zrozumienia plastyczności i funkcji synaptycznej.
Wnioski
- Opracowany protokół jest cennym narzędziem dla badań neuronauki.
- Identyfikowanie cichych terminali może pomóc w opracowaniu strategii leczenia.
- Ta metoda zwiększa zrozumienie zachowania synaptycznego.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Identifying presynaptically silent synapses enables mechanistic de-risking in target validation by revealing functional heterogeneity in neuronal networks. This method supports predictive confidence in screening assays by distinguishing active from inactive glutamate release sites. It informs portfolio triage by linking synaptic plasticity mechanisms to disease-relevant systems in preclinical models.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by quantifying presynaptic silencing or activation states.
- Operational Value: Enables biological de-risking through direct visualization of vesicle release competence.
- Predictive Value: Supports target confidence by correlating cAMP signaling or electrical silencing with functional outcomes.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Prepares validated biological systems for compound evaluation using co-localization of FM1-43 FX and vGluT-1 signals.
- Quantitative Output: Enables standardized measurement of active synapse percentage via threshold-based image analysis.
- Reproducibility: Supports platform reuse through standardized fixation, staining, and imaging protocols.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Connects presynaptic plasticity to hippocampal-dependent learning and memory pathways.
- Translational Continuity: Bridges discovery through preclinical validation by monitoring synaptic adaptation to treatments.
- Risk-Adjusted Advancement: Informs go/no-go decisions by quantifying silent synapse populations under baseline and modulated conditions.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into early discovery workflows by providing a functional readout of presynaptic terminal activity prior to lead identification.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of treatments that alter presynaptic silencing via potassium depolarization or cAMP activation.
- Screening: Delivers assay-ready, reproducible quantification of glutamate release competence in dissociated hippocampal cultures.
- Analytics: Generates quantitative dependent variable measurements (e.g., % FM1-43+/vGluT-1+ puncta) enabling condition comparison.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by modeling synaptic adaptation relevant to neuropsychiatric disorder mechanisms.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable capability for screening modulators of presynaptic function across neuronal models.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation through direct assessment of vesicle release probability.
- Operational Value: Standardization and reproducibility via fixed-cell imaging and co-staining protocol.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions by reducing mechanistic ambiguity in synaptic drug effects.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization based on functional synaptic modulation data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in neuronal culture, confocal microscopy, and fluorescence image analysis.
- Needs instrumentation including laser scanning microscope with 60x oil objective and Z-stack acquisition.
- Demands cross-team standardization of staining timing, dye concentration, and wash stringency.
- Involves adaptation considerations for non-hippocampal neuronal systems or alternative vesicle transporters.
- Includes practical limitations such as FM1-43 FX sensitivity to ascorbic acid wash duration and blocking solution composition.
