Name: Bezpośrednie ponowne uruchomienie widełka replikacyjnego zatrzymanego przez czołową polimerazę RNA (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-04-29T17:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 27 s
Description: Poznaj mechanizm bezpośredniego ponownego uruchomienia widełka replikacyjnego po kolizji z polimerazą RNA. Metoda wykorzystuje kompleksy elongacji RNAP i analizę elektroforetyczną DNA.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Jesteśmy szczególnie wdzięczni Sethowi Darstowi za udostępnienie białek RNAP i Mfd oraz wektorów ekspresyjnych. Dziękujemy również Sergiejowi Boruchovowi za udostępnienie GreB oraz Danowi Zhangowi za wsparcie techniczne. Praca ta była finansowana z grantu National Institutes of Health (M.O.D.) oraz stypendium Marie-Josee and Henry Kravis Fellowship na Uniwersytecie Rockefeller (R.T.P.).

Metoda ta została wykorzystana w badaniach opisanych w pracy <a href="http://www.sciencemag.org/cgi/content-nw/full/327/5965/590/F3">Pomerantz and O'Donnell, Science 327, 590-592 (2010)</a>.
1. Zespół elongacyjny RNAP w stanie zatrzymania został zmontowany w następujący sposób:
Końcowe stężenie 500 nM RNAP σ70 HE z E. coli zmieszano z końcowym stężeniem 5 nM biotynilowanej matrycy DNA o długości 3,6 kb zawierającej promotor T7A1 w 100 μl buforu A (20 mM Tris-Cl (pH 7,5), 8 mM MgCl2, 0,5 mM EDTA, 5 mM DTT, 10% glicerolu) przez 10 min w temperaturze 37 °C. Następnie dodano 100 μM ApU oraz po 40 μM GTP, ATP i CTP i inkubowano przez kolejne 10 min w temperaturze 37 °C.
2. Immobilizację zatrzymanego kompleksu elongacyjnego RNAP na kuleczkach z streptawidyną przeprowadzono w następujący sposób:
Do powyższej reakcji dodano 200 μl kulek magnetycznych powlekanych streptawidyną (Invitrogen) na 10 min w temperaturze pokojowej.
3. Oczyszczanie unieruchomionego, zatrzymanego kompleksu elongacyjnego RNAP przeprowadzono w następujący sposób:
Kuleczki (opisane powyżej) przemyto 5 razy 0,9 ml buforu A zawierającego 0,75 M NaCl, 200 μg/ml heparyny oraz 20 μg/ml ssDNA (po każdym etapie płukania nadmiar cieczy usuwano za pomocą separacji magnetycznej). Następnie kuleczki przemyto 2 razy 0,9 ml buforu A.
4. Formowanie widełek replikacyjnych poniżej polimerazy RNA (RNAP) w konfiguracji czołowej przeprowadzono w następujący sposób:
Kuleczki (opisane powyżej) resuspendowano w 100 μl buforu 4 firmy New England Biolabs, a następnie dodano 10 jednostek enzymu Sap I (New England Biolabs) i inkubowano przez 10 min w 37 °C. Kuleczki przemyto 3 razy 0,9 ml buforu A, a następnie ponownie suspendowano w 50 μl buforu do reakcji Quick T4 Ligation (New England Biolabs). Dodano 2 μl ligazy Quick T4 (New England Biolabs) oraz uprzednio wygrzane forkowane DNA (RP10, RP22, RP25) do końcowego stężenia 6 nM i inkubowano przez 10 min w temperaturze pokojowej. Kuleczki przemyto 3 razy 0,9 ml buforu A.
5. Montaż replisomu i inicjację syntezy nici prowadzącej w widełkach replikacyjnych przeprowadzono w następujący sposób:
448 pmol DnaB (w formie heksameru) inkubowano z kuleczkami i 150 μl buforu A (20 mM Tris-Cl (pH 7.5), 8 mM MgCl2, 0.5 mM EDTA, 5 mM DTT, 10% glicerolu) przez 30 s w temperaturze 23 °C. Następnie dodano 4,9 pmol Pol III* (Pol III HE minus β), 15 pmol β, 2 mM ATP oraz po 60 μM dGTP i dATP, do uzyskania objętości 200 μl, i inkubowano przez kolejne 5 min w temperaturze 37 °C. Replikację zainicjowano poprzez dodanie 10 μg SSB oraz po 24 μM dATP i dTTP wraz z [α-32P]dTTP i [α-32P]dCTP (aktywność właściwa 3 000-5 000 cpm/pmol) do końcowej objętości 250 μL. Reakcje przerwano po 10 min poprzez dodanie 12 μl 500 mM EDTA.
6. Oczyszczanie i zagęszczanie radioznakowanych produktów DNA przeprowadzono w następujący sposób:
Kuleczki (opisane powyżej) poddano gotowaniu po zakończeniu reakcji w celu usunięcia DNA z kuleczek. Wszelkie pozostałości DNA przytwierdzone do kuleczek usunięto poprzez inkubację kuleczek z proteinazą K w objętości 10 ul przez 30 min w temperaturze 50 °C. Następnie kuleczki zagotowano, a nadsącz usunięto za pomocą separacji magnetycznej. Połączony nadsącz zawierający DNA oczyszczono przy użyciu zestawu Qiagen PCR Cleanup kit. Oczyszczone znakowane radioaktywnie produkty DNA poddano następnie analizie w alkalicznym żelu agarozy.
*Replikację wykonano w nieobecności zatrzymanego kompleksu elongacyjnego RNAP w zderzeniu czołowym zgodnie z powyższym opisem, z pominięciem σ70.
Reprezentatywne wyniki:
Kolizja replisomu z RNAP w orientacji czołowej zazwyczaj prowadzi do powstania dwóch produktów o długości 2,5 kb i 3,6 kb. Produkt 2,5 kb odpowiada długości DNA od widelca do zatrzymanej RNAP i wynika z zahamowania replisomu po kolizji z RNAP. Produkt 3,6 kb reprezentuje DNA o pełnej długości i wynika albo z niepełnego zajęcia promotora przez RNAP, albo z częściowego przebicia replisomu przez RNAP w orientacji czołowej. Prawidłowy lub dokładny wynik wykazuje produkcję około 50% DNA o pełnej długości. Jednak w niektórych przypadkach występuje mniejsza zajętość promotora przez RNAP, co skutkuje obserwowaniem wyższego odsetka DNA o pełnej długości, ponieważ większa populacja replisomów nie napotyka RNAP w orientacji czołowej. Replikacja w przypadku braku zatrzymanej RNAP prowadzi do powstania wyłącznie DNA o pełnej długości (3,6 kb).
<img src="/files/ftp_upload/1919/1919fig1.jpg" alt="Proces replikacji DNA; schemat z blokadą RNAP, zatrzymaniem replisomu oraz pełnowymiarową replikacją DNA." data-altupdatedat="1761735611000" data-alt="Rycina 1"> Rycina 1. Replisom zostaje zablokowany przez RNAP w kolizji czołowej. (A) Układ eksperymentalny. Kompleks zatrzymanej elongacji RNAP E. coli został złożony na biotynilowanym DNA zawierającym promotor T7A1 zgodnie z wcześniejszym opisem (9). W skrócie, kompleks zatrzymanej elongacji utworzono 20 bps w dół od promotora poprzez inkubację holoenzymu RNAP z biotynilowanym DNA przez 10 min, a następnie dodanie ApU, GTP, ATP i CTP przez kolejne 10 min. Dodano kuleczki z streptawidyną na kolejne 10 min, a następnie kuleczki przemyto pięciokrotnie 0,9 ml buforu zawierającego 0,75M NaCl, 200 mg/ml heparyny oraz 100 nM jednoniciowego DNA w celu usunięcia niestabilnych kompleksów RNAP-DNA i nadmiaru NTP. Następnie DNA poddano trawieniu enzymem SapI, przemyto i poddano ligacji do wcześniej wyżarowanego DNA o strukturze widelca. Kuleczki przemyto ponownie przed złożeniem replisomu. Promotor znajduje się 2,5 kb od widelca i jest zorientowany tak, aby kierować transkrypcję w stronę widelca. (B) Dodano DnaB, następnie złożono replisom i zainicjowano replikację w obecności (ścieżka 2) lub w przypadku braku (ścieżka 1) RNAP w kolizji czołowej.

<ol><li>Rudolph, C. J., Dhillon, P., Moore, T., Lloyd, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Avoiding+and+resolving+conflicts+between+DNA+replication+and+transcription%5BTitle%5D)+AND+%22DNA+Repair+%28Amst%29%22%5BJournal%5D)">Avoiding and resolving conflicts between DNA replication and transcription.</a> DNA Repair (Amst). 6, 981-98 (2007).</li>
<li>Vilette, D., Ehrlich, S. D., Michel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcription-induced+deletions+in+plasmid+vectors%3A+M13+DNA+replication+as+a+source+of+instability%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Gen+Genet%22%5BJournal%5D)">Transcription-induced deletions in plasmid vectors: M13 DNA replication as a source of instability.</a> Mol Gen Genet. 252, 398-398 (1996).</li>
<li>Trautinger, B. W., Jaktaji, R. P., Rusakova, E., Lloyd, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+polymerase+modulators+and+DNA+repair+activities+resolve+conflicts+between+DNA+replication+and+transcription%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">RNA polymerase modulators and DNA repair activities resolve conflicts between DNA replication and transcription.</a> Mol Cell. 19, 247-247 (2005).</li>
<li>McGlynn, P., Lloyd, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+RNA+Polymerase+by+%28p%29ppGpp+Reveals+a+RecG-Dependent+Mechanism+for+Replication+Fork+Progression%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Modulation of RNA Polymerase by (p)ppGpp Reveals a RecG-Dependent Mechanism for Replication Fork Progression.</a> Cell. 101, 35-35 (2000).</li>
<li>McGlynn, P., Guy, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replication+forks+blocked+by+protein-DNA+complexes+have+limited+stability+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Replication forks blocked by protein-DNA complexes have limited stability in vitro.</a> J Mol Biol. 381, 249-249 (2008).</li>
<li>Labib, K., Hodgson, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replication+fork+barriers%3A+pausing+for+a+break+or+stalling+for+time%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Rep%22%5BJournal%5D)">Replication fork barriers: pausing for a break or stalling for time.</a> EMBO Rep. 8, 346-346 (2007).</li>
<li>Bidnenko, V., Ehrlich, S. D., Michel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replication+fork+collapse+at+replication+terminator+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22Embo+J%22%5BJournal%5D)">Replication fork collapse at replication terminator sequences.</a> Embo J. 21, 3898-3898 (2002).</li>
<li>Pomerantz, R. T., O'Donnell, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replisome+mechanics%3A+insights+into+a+twin+DNA+polymerase+machine%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Replisome mechanics: insights into a twin DNA polymerase machine.</a> Trends Microbiol. 15, 156-156 (2007).</li>
<li>Pomerantz, R. T., O'Donnell, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+replisome+uses+mRNA+as+a+primer+after+colliding+with+RNA+polymerase%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The replisome uses mRNA as a primer after colliding with RNA polymerase.</a> Nature. 456, 762-762 (2008).</li>
<li>Heller, R. C., Marians, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replication+fork+reactivation+downstream+of+a+blocked+nascent+leading+strand%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Replication fork reactivation downstream of a blocked nascent leading strand.</a> Nature. 439, 557-557 (2006).</li>
<li>Yuzhakov, A., Turner, J., O'Donnell, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replication+fork+reactivation+downstream+of+a+blocked+nascent+leading+strand%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Replication fork reactivation downstream of a blocked nascent leading strand.</a> Cell. 86, 557-557 (1996).</li>
<li>Hinkle, D. C., Ring, J., Chamberlin, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replisome+assembly+reveals+the+basis+for+asymmetric+function+in+leading+and+lagging+strand+replication%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Replisome assembly reveals the basis for asymmetric function in leading and lagging strand replication.</a> J Mol Biol. 70, 197-197 (1972).</li>
<li>Kaplan, D. L., O'Donnell, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studies+of+the+binding+of+Escherichia+coli+RNA+polymerase+to+DNA.+V.+T7+RNA+chain+initiation+by+enzyme-DNA+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Studies of the binding of Escherichia coli RNA polymerase to DNA. V. T7 RNA chain initiation by enzyme-DNA complexes.</a> Mol Cell. 15, 453-453 (2004).</li>
<li>Park, J. S., Marr, M. T., Roberts, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Twin+DNA+pumps+of+a+hexameric+helicase+provide+power+to+simultaneously+melt+two+duplexes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Twin DNA pumps of a hexameric helicase provide power to simultaneously melt two duplexes.</a> Cell. 109, 757-757 (2002).</li>
<li>Hanawalt, P. C., Spivak, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((coli+Transcription+repair+coupling+factor+%28Mfd+protein%29+rescues+arrested+complexes+by+promoting+forward+translocation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">coli Transcription repair coupling factor (Mfd protein) rescues arrested complexes by promoting forward translocation.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 9, 958-958 (2008).</li>
<li>Hanawalt, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcription-coupled+DNA+repair%3A+two+decades+of+progress+and+surprises%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Transcription-coupled DNA repair: two decades of progress and surprises.</a> Science. 266, 1957-1957 (1994).</li>
<li>Selby, C. P., Sancar, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcription-coupled+repair+and+human+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Transcription-coupled repair and human disease.</a> J Biol Chem. 270, 4882-4882 (1995).</li>
<li>Liu, B., Alberts, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+function+of+transcription-repair+coupling+factor.+I.+Structural+domains+and+binding+properties.+Head-on+collision+between+a+DNA+replication+apparatus+and+RNA+polymerase+transcription+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Structure and function of transcription-repair coupling factor. I. Structural domains and binding properties. Head-on collision between a DNA replication apparatus and RNA polymerase transcription complex.</a> Science. 267, 1131-1131 (1995).</li>
<li>George, D. L., Witkin, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Slow+excision+repair+in+an+mfd+mutant+of+Escherichia+coli+B%2Fr%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Gen+Genet%22%5BJournal%5D)">Slow excision repair in an mfd mutant of Escherichia coli B/r.</a> Mol Gen Genet. 133, 283-283 (1974).</li>
</ol>

Przemywanie kompleksu zatrzymanej elongacji związanego z kuleczkami roztworem o wysokim stężeniu soli jest kluczowe w celu usunięcia wszelkich niestabilnych lub nieswoiście związanych cząsteczek RNAP. RNAP wykazuje niezwykle wysokie powinowactwo do struktur DNA typu primer-matryca. Dlatego też konieczne jest usunięcie takich nieswoistych kompleksów RNAP-DNA, aby możliwe było przeprowadzenie replikacji z primera i matrycy. Koncentrowanie znakowanych promieniotwórczo produktów DNA przy użyciu zestawu do oczyszczania PCR firmy Qiagen jest również istotne dla uzyskania wystarczająco silnego sygnału radiacyjnego, który byłby widoczny w żelu.

<table><tbody><tr><td>Dynabeads M-270</td><td>Invitrogen</td><td>653.05</td><td></td></tr><tr><td>SapI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0569S</td><td></td></tr><tr><td>T4 Quick Ligase</td><td>New England Biolabs</td><td>M2200S</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do oczyszczania PCR</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td></td></tr></tbody></table>

bezpośrednie wznowienie ruchu widelca replikacyjnego zablokowanego przez polimerazę rna w kolizji czołowej

Direct Restart of a Replication Fork Stalled by a Head-On RNA Polymerase

In vivobadania sugerują, że widelce replikacyjne zostają zatrzymane w wyniku napotkania kompleksów transkrypcyjnych w kolizji czołowej. Jednakże los replisomu i polimerazy RNA (RNAP) po takiej kolizji czołowej pozostaje nieznany. W niniejszej pracy wykazujemy, żeE. colireplisom ulega zatrzymaniu w wyniku kolizji z czołowym kompleksem transkrypcyjnym, lecz zamiast ulec rozpadowi, widełki replikacyjne pozostają wysoce stabilne i ostatecznie wznawiają elongację po usunięciu RNAP z DNA. Stwierdziliśmy również, że czynnik sprzęgający transkrypcję z naprawą, Mfd, wspomaga bezpośredni restart widełek po kolizji, ułatwiając wypieranie RNAP. Wyniki te wykazują wewnętrzną stabilność aparatu replikacyjnego oraz nową rolę szlaku naprawy sprzężonej z transkrypcją w promowaniu replikacji poza blokadą utworzoną przez RNAP.

Los replisomu po zderzeniu z polimerazą RNA (RNAP) w układzie czołowym pozostaje nieznany. Wykazaliśmy, że replisom zatrzymuje się po zderzeniu z RNAP w układzie czołowym, lecz wznawia elongację po usunięciu RNAP z DNA. Białko Mfd wspomaga restart replikacji, ułatwiając przemieszczenie RNAP po kolizji.

Bezpośrednie wznowienie ruchu widelca replikacyjnego zablokowanego przez polimerazę RNA w kolizji czołowej

Badania in vivo sugerują, że widełki replikacyjne ulegają zatrzymaniu w wyniku kolizji z kompleksami transkrypcyjnymi poruszającymi się w kierunku przeciwnym. Niemniej jednak los replisomu oraz RNA...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest obserwacja losów strefy replikacji (Repli zone) oraz polimerazy RNA (RNAP) po kolizji czołowej. Osiąga się to najpierw poprzez zmontowanie kompleksu transkrypcyjnego na biotynilowanym DNA i unieruchomienie go na tabletkach i kuleczkach Stripp, co skutkuje powstaniem zatrzymanego kompleksu elongacyjnego RNAP. Drugim krokiem procedury jest ligacja odpowiednio przygotowanego rozwidlonego DNA do kompleksu elongacyjnego RNAP w celu utworzenia widełek replikacyjnych poniżej (downstream) RNAP uczestniczącej w kolizji czołowej.Trzecim krokiem procedury jest przygotowanie strefy replikacji i zainicjowanie syntezy nici prowadzącej w widelcu replikacyjnym. Ostatnim krokiem procedury jest izolacja DNA z kulek magnetycznych i oczyszczenie DNA za pomocą kolumny do oczyszczania produktów PCR. W rezultacie, poprzez elektroforezę w żelu alkalicznym oczyszczonych, znakowanych promieniotwórczo produktów DNA, można uzyskać wyniki wykazujące, że roso zatrzymuje się w momencie kolizji z czołowo skierowanym kompleksem transkrypcyjnym.Witajcie, jestem Richard Pomerance z laboratorium Mike'a O'Donnella na Uniwersytecie Rockefeller. Dzisiaj zaprezentuję procedurę wywoływania kolizji rybosomu z polimerazą RNA w fazie stałej. Stosuję tę procedurę w naszym laboratorium, aby badać, w jaki sposób proces replikacji jest wpływany przez kompleksy transkrypcyjne wzdłuż DNA.Zacznijmy zatem. Aby rozpocząć ten protokół, zmieszaj holoenzym RNAP z biotynilowaną matrycą DNA o długości 3,6 KB zawierającą promotor T7 A1 w 100 µL buforu A; inkubuj mieszaninę przez 10 minut w temperaturze 37 °C. Po 10-minutowej inkubacji dodaj rybonukleotydy: adenozyno-trifosforan, cytydylo-fosforan oraz urydylo-fosforan, co ograniczy syntezę RNA do 20 nukleotydów.Inkubuj roztwór przez dodatkowe 10 minut w temperaturze 37 °C, aby unieruchomić zatrzymany kompleks elongacyjny RN ape na kuleczkach. Dodaj roztwór do magnetycznych kuleczek pokrytych streptawidyną. Pozostaw mieszaninę do inkubacji na 10 minut w temperaturze pokojowej.Oczyść unieruchomiony kompleks zatrzymanej elongacji RNAP, przemywając kulki 0,9 mililitrami buforu wysokosolnego. Aby usunąć niespecyficzne kompleksy R-N-A-P-D-N-A po każdym przemyciu, usuń supernatant za pomocą separacji magnetycznej. Czynność przemywania należy powtórzyć pięciokrotnie.Następnie kuleczki należy przemyć dwukrotnie 0,9 ml buforu A. Po końcowym przemyciu można złożyć widelce replikacyjne w kierunku downstream w odniesieniu do zatrzymanej polimerazy RNA (RNAP). Kuleczki magnetyczne przyłączone do zatrzymanego kompleksu elongacyjnego RNAP resuspendowano w 100 µl buforu 4 firmy New England Biolabs. Następnie należy dodać 10 jednostek krewetkowej fosfatazy alkalicznej (SAP) i inkubować próbkę przez 10 minut w temperaturze 37 °C. Kuleczki należy przemyć trzykrotnie 0,9 ml buforu A. Następnie kuleczki resuspendowano w 50 µl buforu do szybkiej reakcji ligacji T4.Dodaj 2 µL ligazy T4 oraz przygotowane rozwidlone DNA, a następnie inkubuj roztwór przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Na koniec przemyj kuleczki jeszcze trzykrotnie 0,9 ml buforu A. Wymieszaj heksamer, helikazę DNA z magnetyczną streptawidyną i kuleczkami, które są przyłączone do zatrzymanego kompleksu elongacyjnego RNAP oraz znajdującego się poniżej rozwidlenia replikacyjnego. Przygotuj roztwór w 150 µL buforu A i inkubuj go przez 30 sekund w temperaturze 23 °C.Po krótkiej 32-minutowej inkubacji w temperaturze 23°C dodaj do polimerazy trzech beta-zacisku ATP, DGTP, dATP, znakowany α-P³² DGTP oraz znakowany α-P³² dATP do uzyskania objętości 200 µL. Inkubuj próbkę przez pięć minut w temperaturze 37°C.Rozpocząć replikację, dodając białko wiążące jednoniciowe DNA, DCTP i DTTP. Dodać również znakowany $\alpha$ P 32 DTTP i DCTP do końcowej objętości 250 µL. Po 10 minutach przerwać reakcje, dodając 12 µL 0,5 M EDTA.Następnie zagotuj kuleczki strp din, aby uwolnić z nich DNA. Usuń resztkowe DNA, traktując kuleczki proteinazą K przez 30 minut w temperaturze 50 °C. Ponownie zagotuj kuleczki i usuń nadsącz za pomocą separacji magnetycznej.Oczyść połączony nadsącz zawierający DNA przy użyciu zestawu do oczyszczania PCR firmy Kyogen. Następnie przeanalizuj oczyszczone, znakowane radioaktywnie produkty DNA w alkalicznym żelu agarozowym. Kolizja strefy z RNAP zazwyczaj prowadzi do powstania dwóch produktów o długości 2,5 KB i 3,6 KB. Produkt o długości 2,5 KB odpowiada długości DNA od widelca do zatrzymanej RNAP.Jest to wynik zatrzymania replisomu po kolizji z RNAP. Produkt o wielkości 3,6 KB reprezentuje pełnowymiarowy DNA i wynika albo z niepełnego zajęcia promotora przez RNAP, albo z częściowego odczytu replisomu przez RNAP w kolizji czołowej. Dobry wynik wykazuje, że powstaje około 50% pełnowymiarowego DNA.Jednak w niektórych przypadkach występuje mniejsze stopień obsadzenia promotora przez RNAP i obserwuje się wyższy odsetek pełnowymiarowego DNA. Dzieje się tak, ponieważ większa populacja stref replikacji nie napotyka RNAP w układzie czołowym; replikacja w obecności zatrzymanego RNAP prowadzi jedynie do powstania pełnowymiarowego DNA. Przedstawiliśmy właśnie sposób przeprowadzenia replikacji w fazie stałej w obecności zatrzymanego kompleksu elongacyjnego polimerazy RNA związanego z DNA. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest przemycie zatrzymanego kompleksu transkrypcyjnego roztworem o wysokim zasoleniu w celu usunięcia nadmiaru polimerazy RNA, która wiąże się niespecyficznie z DNA i hamuje replikację.To wszystko. Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w prowadzeniu eksperymentów.

direct-restart-replication-fork-stalled-head-on-rna

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Bezpośrednie ponowne uruchomienie widełka replikacyjnego zatrzymanego przez czołową polimerazę RNA

DT40, modelowy system genetyczny kręgowców, stanowi potężne narzędzie do analizy funkcji białek. Opisujemy tutaj prostą metodę umożliwiającą jakościową analizę parametrów wpływających na syntezę DNA podczas fazy S w komórkach DT40 na poziomie pojedynczych cząsteczek.

Wizualizacja replikacji DNA w kręgowym systemie modelowym DT40 z wykorzystaniem techniki włókien DNA

Opisujemy tutaj system wykorzystujący specyficzny dla miejsca, odwracalny blok białkowy in vivo do zatrzymywania i zwijania widełek replikacyjnych u Escherichia coli. Ustanowienie bloku replikacji ocenia się za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej, a do wizualizacji produktów pośrednich replikacji stosuje się neutralno-neutralną 2-wymiarową elektroforezę w żelu agarozowym.

Indukowanie specyficznej dla miejsca blokady replikacji u E. coli przy użyciu systemu operatora represora fluorescencyjnego

Tutaj przedstawiamy procedurę analizy przebiegu replikacji poprzez patogenne, podatne na struktury powtórzenia za pomocą dwuwymiarowej elektroforezy żelowej.

Analiza elektroforetyczna replikacji przez podatne na strukturę powtórzenia DNA w ludzkim episomie opartym na SV40

Niniejsza technika przedstawia efektywny sposób przygotowania defekcyjnych replikacyjnie zapasów retrowirusów kodujących ludzki onkogen, które następnie wykorzystano do indukowania choroby mieloproliferacyjnej w modelu mysim.

Produkcja retrowirusa z defektem replikacyjnym poprzez przejściową transfekcję komórek 293T

Niniejszy protokół demonstruje prostą technikę mikroskopii fluorescencyjnej pojedynczych cząsteczek służącą do wizualizacji replikacji DNA przez poszczególne replisomy w czasie rzeczywistym.

Wizualizacja replikacji pojedynczych cząsteczek DNA za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej

Opisujemy metodę obserwacji replikacji pojedynczych cząsteczek DNA w czasie rzeczywistym, pośredniczonej przez białka systemu replikacyjnego bakteriofaga.

Bezpośrednia obserwacja enzymów replikujących DNA z wykorzystaniem testu rozciągania pojedynczej cząsteczki DNA

Wizualizacja transportu RNA in vivo jest realizowana poprzez mikroiniekcję fluorescencyjnie znakowanych transkryptów RNA do oocytów Xenopus, a następnie za pomocą mikroskopii konfokalnej.

Wizualizacja lokalizacji RNA w oocytach Xenopus

Opracowano metodę bezpośredniego dostarczania morfolino do otocysty ryby zebrafish w 24hpf. Dzięki zastosowaniu mikroiniekcji morfolino do światła pęcherzyka słuchowego oraz elektroporacji w celu umożliwienia penetracji, udało się ominąć wpływ morfolino na mózg i uzyskać efekty specyficzne dla ucha wewnętrznego.

Bezpośrednie dostarczenie morfolin MIF do otocysty rybki danio poprzez wstrzyknięcie i elektroporację wpływa na rozwój ucha wewnętrznego

Niniejsza metoda opisuje wysokowydajną syntezę in vitro zarówno zmodyfikowanego (z czapeczką), jak i niezmodyfikowanego (bez czapeczki) mRNA z liniowego plazmidu zawierającego gen lucyferazy Gaussia (GLuc). RNA zostaje poddane oczyszczaniu, a następnie część mRNA bez czapeczki zostaje enzymatycznie zmodyfikowana z wykorzystaniem enzymu czapeczkującego wirusa Vaccinia. W ostatnim kroku mRNA jest transfekowane do komórek HeLa, a następnie analizowana jest aktywność lucyferazy w supernatantach...

Transkrypcja in vitro i capping mRNA lucyferazy Gaussia z następującą transfekcją komórek HeLa

Łącząc metody hybrydyzacji in situ i histologii całego RNA, ekspresja genów może być powiązana z decyzjami dotyczącymi losu komórki w rozwijającym się zarodku.  Metody te zostały dostosowane do morskich zwierząt spodoustych i ułatwiają wykorzystanie tych zwierząt jako organizmów modelowych do badań biomedycznych, toksykologicznych i porównawczych.

Hybrydyzacja RNA in situ w całych zarodkach Mount i histologia komórek dostosowana do morskich spodoustych

Poznaj mechanizm bezpośredniego ponownego uruchomienia widełka replikacyjnego po kolizji z polimerazą RNA. Metoda wykorzystuje kompleksy elongacji RNAP i analizę elektroforetyczną DNA.

Bezpośrednie wznowienie ruchu widelca replikacyjnego zablokowanego przez polimerazę RNA w kolizji czołowej

Przeglądaj więcej filmów