Bezpośrednie ponowne uruchomienie widełka replikacyjnego zatrzymanego przez czołową polimerazę RNA

Nieznany jest los replikosmu po zderzeniu z czołową polimerazą RNA (RNAP). Odkryliśmy, że replikomy zatrzymuje się po zderzeniu czołowym z RNAP, ale wznawia wydłużenie po przemieszczeniu RNAP z DNA. Mfd wspomaga ponowne uruchomienie replikacji, ułatwiając przemieszczenie RNAP po zderzeniu.

Ogólnym celem tej procedury jest obserwacja losów strefy Repli i polimerazy RNA lub RNAP po zderzeniu czołowym. Osiąga się to poprzez najpierw złożenie kompleksu transkrypcyjnego na biotynylowanym DNA i unieruchomienie go na tabletce Stripp i kulkach, co spowoduje zatrzymanie kompleksu wydłużającego RNAP. Drugim krokiem procedury jest podwiązanie rozwidlonego DNA do kompleksu elongacyjnego RNAP w celu utworzenia widełek replikacyjnych za czołowym RNAP.

Trzecim krokiem procedury jest złożenie strefy repli i zainicjowanie syntezy nici wiodącej na widełkach replikacyjnych. Ostatnim etapem procedury jest wyizolowanie DNA z kulek magnetycznych i oczyszczenie DNA za pomocą kolumny czyszczącej PCR. Ostatecznie można uzyskać wyniki, które pokazują, że roso zatrzymuje się po zderzeniu z czołowym kompleksem transkrypcyjnym za pomocą alkalicznego agrożelu z oczyszczonych produktów DNA znakowanych radiowo.

Cześć, nazywam się Richard Pomerance i pracuję w laboratorium Mike'a O'Donnella na Uniwersytecie Rockefellera. Dzisiaj pokażę Ci procedurę, jak wykonać zderzenie rybosomu z głową na polimerazie RNA w fazie stałej. Stosuję tę procedurę w naszym laboratorium, aby zbadać, w jaki sposób na proces replikacji wpływają kompleksy transkrypcyjne wzdłuż DNA.

Więc zacznijmy. Aby rozpocząć tę mieszankę protokołu, holoenzym RNAP z biotynylowaną matrycą DNA o pojemności 3,6 KB zawierającą T siedem A jeden promotor w 100 mikrolitrach buforu inkubuje mieszaninę przez 10 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Po 10-minutowej inkubacji dodaj rybonukleotydy adenozynę, trifosforan, fosforan cytydyny i allel adenu urydynę, co ograniczy syntezę RNA do 20 nukleotydów.

Inkubuj roztwór przez dodatkowe 10 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza, aby unieruchomić zatrzymany kompleks wydłużania małpy RN na kulkach. Dodaj roztwór do kulek magnetycznych pokrytych streptawidyną. Pozostaw mieszaninę do inkubacji przez 10 minut w temperaturze pokojowej.

Oczyść unieruchomiony, zatrzymany kompleks wydłużający RNAP, przemłukując kulki 0,9 mililitra buforu o wysokiej zawartości soli. Aby usunąć niespecyficzne kompleksy R-N-A-P-D-N-A po każdym przemyciu, należy usunąć supernatant przez separację magnetyczną. To pranie należy powtórzyć pięć razy.

Następnie kulki należy umyć jeszcze dwukrotnie 0,9 mililitra buforu A. Po ostatnim płukaniu dalszy widelec replikacyjny można zmontować, tworząc widelec replikacyjny za głowicą RNAP Resus, zawiesić pasek magnetyczny do widocznych kulek przyczepionych do zatrzymanego kompleksu wydłużającego RNAP w 100 mikrolitrach czwartego buforu New England Biolabs. Następnie dodaj 10 jednostek fosfatazy alkalicznej krewetek lub SAP i inkubuj próbkę przez 10 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Umyj kulki trzykrotnie 0,9 mililitra buforu A. Następnie ponownie zawieś kulki w 50 mikrolitrach szybkiego buforu reakcyjnego T four ligation.

Dodaj dwa mikrolitry szybkiej ligazy T four i wstępnie rozwidlone DNA, inkubuj roztwór przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Na koniec umyj kulki jeszcze trzy razy 0,9 mililitra heksameru buforowego A, helikazy DNAB z paciorkowcem magnetycznym A i kulkami, które są przyłączone do zatrzymanego kompleksu wydłużającego RNAP i dalszych widełek replikacyjnych. Przygotuj roztwór w 150 mikrolitrach buforu A i inkubuj go przez 30 sekund w temperaturze 23 stopni Celsjusza.

Po krótkiej 32. inkubacji w temperaturze 23 stopni Celsjusza. Przy klamrze polimerazy trzy beta, A-T-P-D-G-T-P-D-A-T-P alfa P 32 znakowana DGTP i alfa P 32 znakowana DATP do objętości 200 mikrolitrów. Inkubować próbkę przez pięć minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Zainicjuj replikację, dodając jednoniciowe białko wiążące DNA DCTP i DTTP. Dodaj również alpha P 32, oznaczone DTTP i DCTP do końcowej objętości 250 mikrolitrów. Po 10 minutach zakończ reakcje, dodając 12 mikrolitrów 0,5 molowego EDTA.

Następnie zagotuj koraliki z paska, aby uwolnić DNA z koralików. Usuń wszelkie pozostałości DNA, traktując kulki proteinazą K przez 30 minut w temperaturze 50 stopni Celsjusza. Ponownie zagotuj kulki i usuń supernatant przez separację magnetyczną.

Oczyść połączony supernatant zawierający DNA za pomocą zestawu do oczyszczania Kyogen PCR. Na koniec przeanalizuj oczyszczone produkty DNA z etykietą radiową w alkalicznym żelu aros Zderzenie strefy z głową na RNAP zwykle skutkuje dwoma produktami o długości 2,5 KB i 3,6 KB. Iloczyn 2,5 KB reprezentuje długość DNA od widelca do zatrzymanego RNAP.

Wynika to z zablokowania odpowiedzi po zderzeniu z RNAP. Produkt o wielkości 3,6 KB reprezentuje DNA na całej długości i wynika albo z niepełnego zajęcia promotora przez RNAP, albo z częściowego odczytu RNAP na wierzch. Dobry wynik pokazuje, że wytwarzane jest około 50% DNA na całej długości.

Jednak w niektórych przypadkach występuje mniejsze zajęcie promotora przez RNAP i obserwuje się wyższy odsetek DNA na całej długości. Dzieje się tak, ponieważ większa populacja stref repli nie napotyka głowy na replikację RNAP w przypadku braku zatrzymanego RNAP powoduje tylko DNA na pełnej długości, właśnie pokazaliśmy, jak przeprowadzić replikację i fazę stałą w obecności zatrzymanego kompleksu wydłużającego polimerazę RNA związanego z DNA. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby przemyć zatrzymany kompleks transkrypcyjny wysoką solą, aby usunąć nadmiar polimerazy RNA, która niespecyficznie wiąże się z DNA i hamuje replikację.

Więc to wszystko. Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w eksperymentach.