Żniwa subpopulacji białaczkowej: metoda przestrzennego oddzielania subpopulacji komórek białaczkowych od kokultury 2D

- Kiedy komórki białaczkowe są hodowane wspólnie z mezenchymalnymi komórkami zrębu, oddziałują z komórkami zrębu i tworzą trzy subpopulacje. Swobodnie unoszące się zawieszone komórki, jasne fazowo komórki przylegające do powierzchni monowarstwy mezenchymalnej i komórki przyciemnione fazowo poniżej monowarstwy mezenchymalnej. Aby oddzielić każdą subpopulację, weź płytkę do hodowli tkankowej z monowarstwą mezenchymalnych komórek zrębu

Nasiona komórek białaczkowych obecnych w pożywkach hodowlanych specyficznych dla nowotworu na monowarstwę i inkubować płytkę przez pożądany czas. Następnie zbierz komórki nowotworowe w zawiesinie, pipetując swobodnie unoszące się komórki do osobnej probówki. Teraz dodaj świeżą pożywkę do płytki i energicznie pipetuj, aby usunąć jasne fazowo komórki nowotworowe z powierzchni mezenchymalnej monowarstwy.

Zebrać te komórki, pipetując je do osobnej probówki. Dodaj trypsynę do płytki, aby usunąć przylegające komórki mezenchymalne. Dodaj płodową surowicę bydlęcą lub FBS, aby zatrzymać działanie trypsyny i rozbić agregaty komórkowe. Teraz zbierz komórki przyciemnione fazowo w probówce. Odwirować wszystkie trzy probówki zawierające różne subpopulacje komórek pojedynczo i ponownie zawiesić osad w świeżych pożywkach do dalszej analizy. W poniższym protokole wyizolujemy zawiesinowe, jasne fazowo i przyciemnione fazowo komórki białaczkowe z kohodowli 2D.

- Aby zebrać zawieszoną subpopulację guza, należy odessać pożywkę z płytki do wspólnej hodowli komórek białaczkowych i użyć tej samej pożywki do delikatnego przepłukania płytki jeden raz. Następnie przenieś subpopulację komórek białaczkowych z pływającą zawiesiną do stożkowej rurki o pojemności 15 mililitrów. Aby zebrać subpopulację guza z jasną fazą, dodaj 10 mililitrów świeżej pożywki z powrotem na płytkę kokultury

i spłukać około pięć razy wystarczająco energicznie, aby usunąć przylegające komórki białaczkowe bez usuwania przylegającej monowarstwy komórek. Następnie przenieś subpopulację jasną fazowo do własnej stożkowej rurki o pojemności 15 mililitrów. Aby zebrać subpopulację guza z fazą dim, usuń pozostałą pożywkę za pomocą jednomililitrowego płukania PBS i odłącz komórki trzema mililitrami trypsyny w temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Po pięciu minutach delikatnie postukaj w boki płytki, aby usunąć przylegające komórki, a następnie dodaj jeden mililitr FBS, aby zatrzymać reakcję enzymatyczną. Następnie przepłucz surowicę trzy do pięciu razy, aby rozbić wszelkie duże agregaty komórkowe i przenieść nieoczyszczoną subpopulację fazową do nowej stożkowej probówki o pojemności 15 mililitrów. Po zebraniu wszystkich subpopulacji należy odwirować komórki i ponownie zawiesić każdą z granulek w jednym mililitrze wstępnie podgrzanego podłoża.