Analiza ekspresji genów bakteryjnych za pomocą mikromacierzy

Cześć, mam na imię Ena i rutynowo zajmujemy się profilowaniem ekspresji genów w laboratorium. Używamy tej techniki do monitorowania różnic regulowanych genów między metamfetaminą a typem dzikim. A dzisiaj mam próbki RNA typu dzikiego i metamfetaminy i wszyscy najpierw robimy C.

Stosujemy metody etykietowania pośredniego, a zaletą tej techniki jest zapobieganie stronniczości oczu, która może wystąpić w przypadku etykietowania bezpośredniego. Aby to zrobić, mamy próbki RNA i decydujemy się na uzyskanie trzech mikrogramów RNA w 13 mikrolitrach całkowitej objętości. I dodajemy 2,5 mikro losowego he w naszych parkach.

Będziemy inkubować próbkę w temperaturze siedmiu pięciu stopni, aby przez osiem minut poznać naturę RNA. A teraz dodamy, dodamy koktajl z odwrotną transkrypcją, który zawiera ciągłą mieszankę AM L-D-L-D-U-T-P, bufor odwrotnej transkryptazy, a także ET TT Duży to w dół I inkubuj próbkę w temperaturze 42 stopni przez cztery godziny. Więc po czterech godzinach po prostu wyjmujemy próbki.

A teraz w probówce mamy mieszankę CDNA i RNA. A to, co chcemy zrobić, to zrobić hydrox RNA, dodając wodorotlenek sodu i EDTA, a końcowe stężenie wodorotlenku sodu powinno wynosić sto molowców. A końcowe stężenie dla e BT powinno wynosić pięć molowych.

A teraz będziemy inkubować próbki w łaźni wodnej o temperaturze 65 stopni przez 10 minut. Tak więc inkubacja jest zakończona i wykorzystamy próbki, dodając pH siedem hałd jednej wody do końcowego stężenia 500 molowych. W tym momencie możesz przechowywać próbki w temperaturze minus 20 lub kontynuować czyszczenie.

Do oczyszczenia CDNA używamy zestawu do oczyszczania KaiGen PCR. Ponieważ jednak bufor Busha i bufor jonowy zawierają uwalnianie, nie robimy tego, przygotowujemy nasz własny bufor buszu losu i bufor jonów losu, a ty dodasz 300 litrów PPI i powoli spuścimy ten staw do ciebie, przeniesiemy mieszaninę do kolumn I będziesz wirować przez minutę z najwyższą prędkością I będziesz obserwować, bufor, który przygotowaliśmy. Bufor do płukania fosforanów, dodasz 750 mikrolitrów i tak dalej, a następnie dodasz kolejny dla jednego.

Więc zakręcimy jeszcze raz, żeby upewnić się, że mamy już wszystkie łóżka. I przeniesiemy te rurki do pustych probówek dla przestępców. Dodam 30 markerów buforu fosforanu E, czyli czterech czteromolowych fosforanów potasu o pH 8,5.

A tutaj musisz tylko upewnić się, że dodasz wszystko do środka kolumny i będziesz inkubować w temperaturze pokojowej przez minutę. Więc znowu będzie się kręcił przez minutę, a ja dodam kolejny bufor 30 mikro zero, który inkubuję lub sypialnię. Więc usuwam kolumnę i mamy całkowitą objętość 60 mikros lub CDA.

Kiedy już oczyścimy CDNA, możesz, możesz przechowywać go w temperaturze minus 20 stopni na zewnątrz, a także możemy go wysuszyć, a następnie przechowywać, abyśmy mogli wysuszyć CDNA w sprzężeniu zwrotnym. Więc teraz w tubie mamy suche CDA, które jest zmodyfikowane. A to, co zrobimy, to zawiesię suchą próbkę.

Zawiesię próbkę w 10 turze wodorowęglanu 15 LAR o pH dziewięć. Na tym etapie będę się poruszał w górę i w dół, bardzo ważne jest, aby zregenerować cDNA. Cóż, w przypadku kupowania reakcji korporacji na działanie, reakcja ta powinna odbywać się w ciemnym pokoju, ponieważ etykiety fluorescencyjne są wrażliwe na matryce.

Jednak decydując się na te z nauk przyrodniczych i są one dostępne w indywidualnych pakietach. S five ma fioletową czapkę, a strona trzecia ma pomarańczową czapkę, a także S five pojawia się jako Sion, gdy jest zawieszony, a Cary wydaje się magenta. Więc to, co zrobię w ciemnym pokoju, to przeniosę te próbki do tubek z barwnikiem, ponownie zawiesię barwnik i przeniosę je z powrotem do probówki, którą mam.

A potem będę inkubować w ciemności przez dwie godziny, po dwóch godzinach inkubacji te zatrzymują reakcję, dodając 35 re stumilimolowego octanu sodu o pH 5,2. A potem posprzątaliśmy za pomocą podobnej procedury czyszczenia. Jednak tym razem używamy dostarczonego przez Cajun buforu płuczącego i buforu elucyjnego.

Możesz opisać miejsca, w których umieściłeś próbkę i które powinny oczyścić instrument. Więc możesz teraz swoją próbkę lub swoją mieszankę I To, Więc to jest moja próbka oznaczona scifi, a tutaj to, co widzimy, to OD dwa 60, które pokazuje zawartość CDA i OD sześć 50, co pokazuje włączenie D dla scifi. A oto próbka mojej trzeciej strony etykiety.

Ponownie, przekręć sześć koncentracji i pięć 50 miar miejsca trzeciego włączenia. Ponieważ moja korporacja D działa wydajnie, połączę próbki teraz, proszę pani, pokrótce za tym tęsknić. A teraz ponownie napiszemy próbkę, korzystając z informacji zwrotnych.

Okej, więc jeśli chodzi o zjeżdżalnię, nawodnimy się, umieszczając zjeżdżalnię na wodzie, co sprawi, że plamy będą większe. A potem, aby to zabezpieczyć, po prostu suszymy w stu stopniach Celsjusza, a następnie hybrydyzujemy UV lub sieciujemy UV plamy na szkiełku, a następnie inkubujemy w buforze przed wysokim, który mamy. Kładę więc zjeżdżalnię zadrukowaną do dołu, ale jeszcze nie dotyka wody.

I będziemy tak czekać przez pięć minut. Ja, więc to pudełko wygląda na większe, powinny być bardziej błyszczące niż przed umieszczeniem, a ty po prostu wyschniesz, kładąc szkiełko na stu stopniach i będziesz obserwować kondensację. I będziemy się z tobą łączyć.

Więc dla nawodnienia po prostu zanurzę zjeżdżalnię w przedwojennej wodzie. A to powinno być naprawdę szybkie, ponieważ celem jest pozbycie się wszystkich plam lub wszystkich oligonukleotydów w miejscu, które nie jest połączone. A jeśli będziesz działać wolno w tym procesie, po prostu dostaniesz ogony com na swoich miejscach.

Więc po prostu upewnij się, że naprawdę robisz to szybko i upewnij się, że nie wylecisz z wody i nie zrobisz tego przez 30 sekund i po prostu natychmiast fut w temperaturze pokojowej przez pięć minut i 700 minut powietrza na minutę Weź to, wpasujemy ten slajd do przedwojennego bufora stacji rurowej, który mieliśmy I powoli wpychamy suwak do słoika, a my będziemy inkubować to pod kątem 42 stopni przez co najmniej co najmniej 45 minut. Więc tutaj mamy naszą wysuszoną próbkę do hybrydyzacji. Więc najpierw zawiesimy Resus w wodzie.

Na tym etapie po prostu zawieszamy resus, robiąc to w górę iw dół i ewentualnie nie wystawiaj próbki zbyt białej, białej. A potem dodasz czyjeś DNA plemnika 1,5 i stężenie wynosi 10 miligramów na promil. A do tego dodasz 1,2 marketera TRNA.

Stężenie wynosi 12,5 miligrama na plemniki, dodajemy tRNA i DNA plemników, aby zablokować niespecyficzne hydro. I dodajemy 5,35 markera zero trzy XSSC, co daje końcowe stężenie trzy x. I na koniec dodajemy 3,5 mikrolitra 1%SDS.

Teraz będziemy gotować miksturę przez pięć minut i będziemy wirować na najwyższych obrotach przez pięć minut i będzie na to gotowa. Minęła godzina odkąd inkubujemy naszą zjeżdżalnię, a teraz mam wodę i izopropanol. Więc najpierw zamieszam szkiełko w wodzie, aby pozbyć się SDS, a następnie umyję twój dza propanol i bezpośrednio włożę do standardowego miernika.

A tutaj po prostu uważaj, aby nie wystawiać zbyt dużo światła na działanie powietrza, aby zapobiec wysuszeniu. Idę więc prosto z bufora stacji harm do wody I myjemy zjeżdżalnię. Kilka minut po prostu upewnij się, że ruch jest tylko w górę iw dół, a nie na boki.

A także upewnij się, że zjeżdżalnia nie znajduje się nad wodą i natychmiast przeniesiemy ją do izopropanolu. I po prostu zostań tu przez kilka minut. I czy Twoja strona mogłaby odpowiedzieć na swoją stronę w temperaturze pokojowej przez pięć minut?

700 R.Chłodny. Tak więc nasza zjeżdżalnia jest również gotowa do hybrydyzacji i lepiej, jeśli trzymasz ją w pudełku na slajdy, aby chronić ją przed autobusem. Tak więc w przypadku stacji żniwnej użyjemy windy lub poślizgu.

Na szkiełku nakrywkowym znajdują się białe paski, które zapewnią pewną siłę nośną i zapewnią trochę miejsca dla naszej próbki, aby wejść między szkiełko nakrywkowe a szkiełko. I czyszczę go etanolem, a następnie kładę drut I po prostu upewniam się, że nie ma cząsteczki testowej. Więc najpierw weźmiemy nasz szablon slajdu, który mamy zaznaczony obszar drukowania, a na nim umieścimy przygotowany przez nas slajd i upewnimy się, że są idealnie wyrównane.

Upewnij się, że są idealnie wyrównane. I musisz upewnić się, że paski są z boku, że zamierzamy się z nim zmierzyć. Więc naprawdę trudno to zobaczyć, ale upewnij się, że to widzisz.

A paski powinny znajdować się po bokach zjeżdżalni. A my załadujemy naszą próbkę z boków. Biorę małe ilości próbki, więc najpierw biorę 15 mikrolitrów i zaczynam ładować od rogu szkiełka nakrywkowego.

I powoli wciągałem go i po prostu przesuwałem się wzdłuż krawędzi, aby pokryć cały obszar. Na tym etapie bardzo ważne jest, aby nie wprowadzać żadnych pęcherzyków i biorę kolejny migrator 15 i nakładam go na boki szkiełek, aby zapobiec wyschnięciu. Tak więc nasza próbka jest gotowa, a Ty będziesz inkubować nasze szkiełka i komory priorytetyzacyjne, które mają mikrokanały do nawilżania szkiełka podczas hybrydyzacji.

I dodamy 10 marketerów z trzech XSSC w sześciu rogach slajdu. Było sześć miejsc na, na komorze, przepraszam, na każdym rogu I, i z każdej strony, Upewnij się, że przesuwasz szkiełko naprawdę delikatnie, aby szkiełko nakrywkowe się nie wyślizgnęło. A kiedy położysz suwak prawą stroną do góry, zobaczysz, że będzie się układał, przyklei się do wody, którą położysz i założysz pokrywę I upewnij się, że są dokręcone.

Komnatę konwersacyjną będziemy inkubować w worku z wodą o temperaturze 65 stopni, ale nie chcemy umieszczać jej bezpośrednio na dnie. Więc po prostu umieściliśmy jakąś plastikową barierę, aby zapobiec nadmiernemu przenoszeniu ciepła. Delikatnie umieszczamy naszą komorę izacyjną i aby zapobiec przemieszczeniu, możesz również obciążyć ją jakimś ciężarem.

A ta inkubacja trwa przez noc, zwykle od 10 do 12 godzin. Tak więc do mycia plastrów używamy jednego XSSC z 0,05 procentową zawartością SDS. Będzie to służyło do usuwania szkiełka nakrywkowego.

A to będzie pierwszy krok do mycia. I zrobimy jeszcze dwa kroki tylko z 0,06%six XSC przez wszystkie SDS, które mamy. Więc wszyscy kręcimy rozmowę, bierzemy slajdy i wkładamy je do pojemnika na torebki zakrytą do dołu.

I po prostu potrząśniemy nim z boku na bok i zobaczymy, że szkiełko nakrywkowe delikatnie odpadnie. W porządku, i, A my po prostu przeniesiemy się do innego bufora myjącego, który zawiera XES. Jedziesz przez minutę.

Przejdź do sześciu XSSC. Aby upewnić się, że pozbyliśmy się wszystkich FDS, powtórzymy to jeszcze raz. Wirówka do wyschnięcia znajdowała się w temperaturze pokojowej przez pięć minut w temperaturze 700 RP. Trzymasz ten slajd w pudełku na slajdy, ponieważ jest wrażliwy na światło.

Więc to jest skaner slajdów i umieścisz slajd tutaj, trochę miejsca tutaj, połóż slajd stroną do dołu, oznaczony w kierunku i, A na drugim slajdzie po prostu zdefiniujesz obszar, który chcesz zeskanować. I po prostu zajmiesz się tym obszarem na naszych slajdach. Mamy, używamy 16 pinów do drukowania naszych slajdów.

Tak więc każdy blok odpowiada jednemu pinowi, a nasze slajdy zawierają ponad 8 000 miejsc. Dwukrotnie reprezentujemy genom o kolorze vi, ponieważ składa się on z około 4000 genów. Mamy więc dwie plamki na każdy oligo, którego używamy.

A jeśli te się powiększą, zobaczycie w tym konkretnym eksperymencie, porównujemy mutanty regulatora transkrypcji z dzikim typem, a mutant byłby oznaczony scifi, co daje czerwony kolor. A dzikim typem było miejsce trzecie, które daje zielony kolor. Tak więc wszystko, co wydaje się czerwone, jak te plamy, wskazuje, że obfitość transkryptów u mutanta była wyższa niż u dzikiego typu.

Wydają się więc czerwone lub w odcieniach czerwieni, a wszystko, co wydaje się zielone, wskazuje, że obfitość transkryptu była wyższa u dzikiego typu w porównaniu ze zmutowanym. A każda plamka, która wydaje się żółta, wskazuje, że ten transkrypt był jednakowo obecny zarówno u mutanta, jak i dzikiego typu. Więc kiedy nakładają się na siebie, wydają się żółte, jak te ale.