Name: Ocena rozkładu przestrzennego γH2AX po promieniowaniu jonizującym (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-08-07T17:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 28 s
Description: Poznaj metodę oceny rozkładu przestrzennego γH2AX po promieniowaniu jonizującym w jądrze komórkowym. Technika ta umożliwia wizualizację uszkodzeń DNA i modyfikacji chromatyny.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Podziękowania kierujemy do Australian Institute of Nuclear Science and Engineering za udzielone wsparcie. TCK był laureatem nagród AINSE. Epigenomic Medicine Lab jest wspierany przez National Health and Medical Research Council of Australia (566559). Praca ta jest finansowana przez CRC for Biomedical Imaging Development Ltd, utworzone i wspierane w ramach programu Cooperative Research Centres (CRC) Rządu Australii. LM otrzymuje wsparcie z Melbourne Research (University of Melbourne) oraz dodatkowych stypendiów Biomedical Imaging CRC. Niezliczone wsparcie dla tej pracy zapewnił Monash Micro Imaging (dr Stephen Cody i dr Iśka Carmichael).

Przygotowanie komórek
<ol>
<li>Ludzkie komórki erytroleukemiczne K562 hoduje się w pożywce RPMI-1640 uzupełnionej o 10% (v/v) płodowej surowicy bydlęcej oraz 20 mg/ml gentamyciny, w wilgotnym środowisku z 5% CO2 w temperaturze 37°C.</li>
<li>Około 18 godzin przed barwieniem komórki w fazie wzrostu wykładniczego (optymalnie 5 x 105 komórek/ml) należy przemyć solą fizjologiczną z buforem fosforanowym (PBS), resuspender w świeżej pożywce i przenieść z powrotem do inkubatora w temperaturze 37°C i 5% CO2.</li>
<li>Komórki należy przemyć dwukrotnie PBS-em poprzez wirowanie przy prędkości około 150 obr./min przez 5 minut, a następnie resuspender w świeżej pożywce.</li>
<li>Należy policzyć komórki i dostosować ich gęstość do wartości około 5 x 105 komórek/ml.</li>
</ol>
Komórki można liczyć metodą zautomatyzowaną (np. za pomocą liczników Sysmex lub Coulter z filtrem o rozmiarze od 5 do 20 mikronów) lub stosując metodę wykluczania błękitu trypanowego i komorę countingową (haemocytometr). 
Zbyt duża liczba komórek (&gt;80 cells/cm2) może prowadzić do niejednorodnego barwienia.

Naświetlanie i barwienie immunofluorescencyjne
<ol>
<li>Przygotuj klipy do wirówki cytospin, karty filtracyjne oraz szkiełka z odpowiednimi etykietami.</li>
</ol>
Podczas montażu aparatury do cytospinowania należy upewnić się, że otwór w karcie filtracyjnej pokrywa się z lejkiem.
<ol start="2">
<li>Poddać komórki działaniu promieniowania γ lub promieni rentgenowskich (w tym przykładzie 2Gy).</li>
</ol>
Aby zapobiec powstawaniu ognisk podczas naświetlania, należy trzymać komórki w lodzie od 5 do 10 minut przed oraz w trakcie naświetlania.
Po napromieniowaniu inkubuj komórki w temperaturze 37°C, przy 5% CO2 przez wymagany czas (aby uzyskać szczytowe poziomy γH2AX: od 30 minut do 1 godziny; w tym przykładzie 1 godzina).
<ol start="3">
<li>Przemyć komórki dwukrotnie zimnym PBS poprzez wirowanie, a następnie zawiesić je ponownie w świeżym PBS.</li>
<li>Nanieść od 100 do 150 μL zawiesiny komórkowej do każdego lejka cytocentryfugi i wirować przy 500 rpm przez 5 minut.</li>
<li>Wyjąć preparaty z cytocentryfugi i pozostawić komórki do umiarkowanego wysuszenia na powietrzu przez około 15 minut.</li>
</ol>
Nie dopuścić do całkowitego wyschnięcia komórek, ponieważ może dojść do rozpadu morfologii komórkowej.
<ol start="6">
<li>	Obrysować komórki okręgiem za pomocą hydrodynamicznego pisaka.</li>
<li>	Utrwalić komórki w 4% paraformaldehydzie przez 5 minut w temperaturze pokojowej (RT).</li>
</ol>
W naszym doświadczeniu utrwalanie paraformaldehydem jest skuteczniejsze niż utrwalanie etanolem lub metanolem.
Komórki w zawiesinie wymagają utrwalania przez 5 minut w RT, natomiast w przypadku komórek adherentnych do optymalnego utrwalenia wymagany jest dłuższy czas (od 15 do 20 minut).
Stwierdzono, że barwienie bezpośrednio po utrwaleniu daje lepsze wyniki niż przechowywanie utrwalonych preparatów w temperaturze -20°C, co zazwyczaj skutkuje wysoką fluorescencją tła.
<ol start="8">
<li>Przemyć komórki dwukrotnie buforem PBS, po 5 minut każdego płukania.</li>
<li>Przeprowadzić permeabilizację komórek przy użyciu 0,1% Triton-X 10 w temperaturze pokojowej przez 5 minut.</li>
</ol>
W porównaniu z Tween-80 zazwyczaj obserwujemy silniejsze sygnały w komórkach permeabilizowanych za pomocą Triton-X 100. W zależności od typu komórek może być konieczna zmiana czasu permeabilizacji. Na przykład w komórkach K562 permeabilizacja przez 5 minut w RT jest wystarczająca, podczas gdy w komórkach adherentnych wymagana jest 15-minutowa permeabilizacja.
<ol start="10">
<li>	Przemyć komórki trzy razy PBS, każdorazowo przez 5 minut.</li>
<li>	Zablokować komórki w 1% BSA przez 30 minut (3 x 10 minut) w temperaturze pokojowej.</li>
</ol>
Porównaliśmy wydajność blokowania z użyciem surowicy (pochodzącej z tego samego gatunku co przeciwciała wtórne) oraz albuminy surowicy bydlęcej (BSA) w PBS. BSA okazała się bardziej wydajna w minimalizowaniu niespecyficznego wiązania przeciwciał wtórnych w porównaniu z surowicą. Porównaliśmy różne czasy blokowania: blokowanie przez noc w temperaturze 4°C w zestawieniu z blokowaniem w trzech 10-minutowych oraz trzech 20-minutowych krokach w temperaturze pokojowej, i ustaliliśmy, że optymalnym rozwiązaniem było blokowanie w trzech 10-minutowych krokach.
<ol start="12">
<li>	Nanieść 50 μL przeciwciała pierwszorzędowego (rozcieńczonego 1:50 w 1% BSA) na każdy preparat.</li>
</ol>
Inkubacja z przeciwciałem pierwszorzędowym w temperaturze pokojowej przez 60 minut pozwala na zmniejszenie tła barwienia w porównaniu do inkubacji przez noc w temperaturze 4°C.
<ol start="13">
<li>	Aby jednocześnie barwić różne markery, należy użyć przeciwciał wytworzonych w różnych gatunkach (np. mysich anty-γH2AX i króliczych anty-metylowanych H3K4 w tym przykładzie).</li>
<li>	Inkubować z przeciwciałami pierwszorzędowymi przez 90 minut w temperaturze pokojowej na platformie kołyszącej przy 250 rpm.</li>
</ol>
Wszystkie inkubacje przeprowadzane są w nawilżonej kuwecie do barwienia.
<ol start="15">
<li>	Przemyj komórki trzy razy buforem PBS, po 5 minut każdego płukania.</li>
<li>	Dodaj 50 μL przeciwciała wtórnego (rozcieńczonego 1:10 w 1% BSA) na każdy preparat.</li>
</ol>
Aby barwić różne markery na tym samym preparacie, należy zastosować przeciwciała wtórne o różnej specyficzności gatunkowej (zgodnie z przeciwciałem pierwotnym) i różnej długości fali emisji fluorescencji (np. anty-mysi Alexa 48 (zielony) i anty-króliczy Alexa-546 (czerwony) w tym przykładzie).
<ol start="17">
<li>Inkubować komórki przez 60 minut w temperaturze pokojowej (RT) na platformie kołyszącej przy 250 rpm.</li>
</ol>
Zaleca się inkubację komórek w ciemnej, wilgotnej komorze, aby zapobiec blaknięciu i wysychaniu przeciwciała wtórnego.
<ol start="18">
<li>Przemyć komórki trzykrotnie PBS, każdorazowo przez 5 minut.</li>
<li>Do każdego preparatu dodać 50 μL TOPRO-3 (rozcieńczonego w PBS w stosunku 1:50).</li>
<li>Przemyć preparaty PBS trzykrotnie przez 5 minut.</li>
<li>Usunąć nadmiar wilgoci z preparatów i dodać roztwór przeciwpłowieniowy (anti-fade).</li>
</ol>
Zaleca się, aby nie wysuszać komórek całkowicie przed dodaniem roztworu przeciwblaknącego.
<ol start="22">
<li>	Przykryć szkiełkiem przedmiotowym, uszczelnić lakierem do paznokci i pozostawić preparaty na noc w ciemności w temperaturze pokojowej.</li>
</ol>
Zaleca się stosowanie specjalistycznych szkiełek nakrywkowych do mikroskopii konfokalnej nr 1,5 (o grubości 0,16-19 mikronów) oraz bezbarwnego lakieru do paznokci.
Podczas nakładania szkiełka nakrywkowego na preparat należy zachować ostrożność, aby uniknąć powstania pęcherzyków powietrza.

Akwizycja obrazu
<ol>
<li>Do obrazowania wykorzystano konfokalny mikroskop Zeiss LSM510 Meta z zastosowaniem standardowych laserów GFP (zielony, 48 nm), PI (czerwony, 543 nm) oraz dalekiej czerwieni (niebieski, 63 nm).</li>
</ol>
Obrazy uzyskane za pomocą mikroskopu konfokalnego wykazują lepszą rozdzielczość przestrzenną.
Ponieważ rozmiar ognisk γH2AX może być mniejszy niż 0,5 μm, zaleca się wykonywanie obrazowania z krokiem wzdłuż osi Z wynoszącym co najmniej 0,5 μm.
Zaleca się stosowanie obiektywu imersyjnego 63x zamiast większych lub mniejszych powiększeń.
W przypadku obrazowania wielu komórek w celu zliczania ognisk (foci) preferowane jest zastosowanie prędkości skanowania 8 oraz rozmiaru obrazu 1024 x 1024 piksele. Aby zilustrować relacje przestrzenne między różnymi białkami jądrowymi, zaleca się zastosowanie prędkości skanowania 6 przy rozmiarze obrazu 2048 x 2048 piksele.
Przy obrazowaniu z wielu kanałów zaleca się stosowanie akwizycji skanowania liniowego zamiast skanowania klatkowego. Pozwala to uniknąć blaknięcia i uzyskać lepszą rozdzielczość. Skanowanie sekwencyjne jest stosowane w celu zapobiegania przenikaniu sygnału między kanałami.

Liczenie ognisk
Analizę obrazów i liczenie ognisk można przeprowadzić przy użyciu różnych pakietów oprogramowania (w tym Metamorph, Image-J i Imaris). Poniżej opisano procedurę liczenia ognisk z wykorzystaniem programu Metamorph.
<ol>
<li>Otwórz stosy obrazów γH2AX bezpośrednio z menu plików lub korzystając z opcji budowania stosów numerowanych (build number stacks).</li>
<li>Przejdź do menu Process i wybierz Stack Arithmetic.</li>
<li>Wybierz Maximum projection, zaznacz płaszczyzny, które mają zostać uwzględnione, i kliknij OK.</li>
<li>Zapisz otrzymany obraz jako plik γH2AX Tiff. i otwórz obraz TOPRO-3 (niebieski).</li>
<li>Przejdź do sekcji Regions, wybierz narzędzie do rysowania obszarów i obrysuj jądra komórkowe.</li>
<li>Kliknij obraz γH2AX Tiff, przejdź do menu Process i wybierz Morphological Filters.</li>
<li>Wybierz Top-Hat i wskaż obraz γH2AX jako obraz źródłowy.</li>
<li>Zastosuj filtr Top-Hat; otrzymany obraz będzie obrazem binarnym z mniejszą ilością szumów i zredukowaną zmiennością intensywności ognisk (foci).</li>
</ol>
Należy zachować ostrożność podczas wyboru wartości Top-Hat. Optymalne wartości można uzyskać poprzez wizualne porównanie obrazów przed i po zastosowaniu filtrów.
<ol start="9">
<li>Przejdź do menu procesów (process menu) i wybierz progowanie obrazu (threshold image).</li>
<li>Wybierz progowanie inkluzywne (inclusive threshold) i określ wartości dolnego oraz górnego progu.</li>
</ol>
Zazwyczaj to wartości progowe wpływają na liczbę ognisk. Dlatego podczas wyboru wartości progowych należy zachować szczególną ostrożność. Najlepiej można to osiągnąć, licząc liczbę ognisk przy użyciu różnych wartości progowych w komórkach poddanych promieniowaniu γ poniżej 2 Gy, a następnie porównując otrzymane wyniki z liczeniem ręcznym (wizualnym). Optymalna wartość progowa to taka, która minimalizuje uwzględnienie tła i maksymalizuje wykrywalność ognisk.
<ol start="11">
<li>	Wybierz obraz TOPRO-3, przejdź do menu regionów i wybierz opcję przenoszenia regionów (transfer regions). Jako obraz źródłowy wybierz TOPRO-3, jako obraz docelowy wybierz Top-Hat, a następnie kliknij OK.</li>
<li>	Po przeniesieniu obszarów jąder na obraz Top-Hat należy przejść do menu pomiarów (measure menu) i wybrać Zintegrowaną Analizę Morfometryczną (Integrated Morphometry Analysis).</li>
<li>	 W oknie wyskakującym wybierz obraz źródłowy – Top-Hat i pomiar według powierzchni.</li>
<li>	Wybierz opcję „measure all regions” (pomierz wszystkie obszary) i kliknij „measure” (pomierz), aby uzyskać liczbę ognisk we wszystkich odpowiadających im jądrach na obrazie Top-Hat.</li>
<li>	Liczba ognisk z każdego regionu może zostać wyeksportowana do pliku MS-Excel przy użyciu opcji log-data.</li>
</ol>

Rekonstrukcja 3D obrazów
Aby stworzyć obraz 3D ze stosu zdjęć za pomocą programu Metamorph:
<ol>
<li>Przejdź do menu stosu (stack menu) i wybierz rekonstrukcję 3D.</li>
<li>Wybierz kąt obrotu (np. 160°, 320°).</li>
<li>Wybierz typ rekonstrukcji 3D – maksimum (maximum).</li>
<li>Wybierz płaszczyznę obrotu (poziomą lub pionową).</li>
<li>Wybierz odległość kalibracji osi Z.</li>
</ol>
Zaleca się stosowanie określonej przez użytkownika odległości Z (optymalna wartość to 0,5 μicrons).
<ol start="6">
<li>Wybierz OK, aby utworzyć rekonstrukcję 3D.</li>
</ol>

Analiza skanowania liniowego
W przypadku analizy skanowania liniowego przy użyciu programu Metamorph:
<ol>
<li>Otwórz obraz z jednej płaszczyzny lub plik typu stack.</li>
<li>Przejdź do paska narzędzi pomiarowych i wybierz opcję analizy skanowania liniowego (line scan analysis).</li>
<li>Narysuj linię przecinającą komórkę, co automatycznie wyświetli intensywność fluorescencji oraz odległość każdego markera wzdłuż przebiegu linii.</li>
</ol>
Aby wyjaśnić zależności przestrzenne między różnymi markerami chromatyny, na przykład ogniskami γH2AX a metylacją histonów, zaleca się wyznaczenie linii przechodzących przez obszary zarówno o dużym, jak i niskim zagęszczeniu tych markerów.

Reprezentatywne dane
Na potrzeby niniejszej demonstracji wykorzystano przeciwciała przeciwko ogniskom γH2AX oraz H3K4me, aby ocenić rozmieszczenie przestrzenne DSB względem epigenetycznego wyznacznika aktywnie transkrybowanej euchromatyny. Jak pokazano na rysunku 1, po napromieniowaniu dawką 2Gy, ogniska γH2AX tworzyły się głównie w obszarach słabo barwionych zarówno dla H3K4me, jak i dla barwnika DNA TOPRO-3 (intensywnie zabarwione obszary DNA wskazują na obecność heterochromatyny).
 <img src="/files/ftp_upload/2203/2203fig1.jpg" alt="Mikroskopia fluorescencyjna przedstawiająca rozkład białek komórkowych, widma emisji oraz wykres analizy." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1. Ogniska γH2AX tworzą się przede wszystkim w euchromatynie w odpowiedzi na promieniowanie jonizujące. (A) Wizualizacja immunofluorescencyjna ognisk γH2AX (zielone) w ludzkich komórkach erytroleukemicznych K562, 1 godzinę po naświetlaniu promieniami γ (2 Gy). Ogniska γH2AX przedstawiono w relacji do H3K4me, reprezentującego aktywnie transkrybowaną euchromatynę (czerwone). DNAa znakowano TOPRO-3 (niebieskie). Nałożony obraz (niebieski, czerwony i zielony) wykazuje brak ognisk γH2AX w obszarach heterochromatycznych. Analiza skanu liniowego (intensywność fluorescencji względem odległości) wskazuje względny rozkład markerów w jednej płaszczyźnie. (B) Przekroje w różnych płaszczyznach z rekonstrukcji 3D opisanego powyżej nałożonego obrazu.

<ol><li>Rogakou, E. P., Boon, C., Redon, C., Bonner, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Megabase+chromatin+domains+involved+in+DNA+double-strand+breaks+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Megabase chromatin domains involved in DNA double-strand breaks in vivo.</a> J Cell Biol. 146 (5), 905-916 (1999).</li>
<li>Rogakou, E. P., Pilch, D. R., Orr, A. H., Ivanova, V. S., Bonner, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+double-stranded+breaks+induce+histone+H2AX+phosphorylation+on+serine+139%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">DNA double-stranded breaks induce histone H2AX phosphorylation on serine 139.</a> J Biol Chem. 273 (10), 5858-5868 (1998).</li>
<li>Bonner, W. M. Nat Rev Cancer. 8 (12), 957-967 (2008).</li>
<li>Dickey, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((H2AX%3A+functional+roles+and+potential+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Chromosoma%22%5BJournal%5D)">H2AX: functional roles and potential applications.</a> Chromosoma. 118 (6), 683-692 (2009).</li>
<li>Kim, J. A., Kruhlak, M., Dotiwala, F., Nussenzweig, A., Haber, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterochromatin+is+refractory+to+gamma-H2AX+modification+in+yeast+and+mammals%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Heterochromatin is refractory to gamma-H2AX modification in yeast and mammals.</a> J Cell Biol. 178 (2), 209-218 (2007).</li>
<li>Cowell, I. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((gammaH2AX+foci+form+preferentially+in+euchromatin+after+ionising-radiation%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">gammaH2AX foci form preferentially in euchromatin after ionising-radiation.</a> PLoS One. 2 (10), e1057-e1057 (2007).</li>
<li>Kinner, A., Wu, W., Staudt, C., &amp, I. liakis, G, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gamma-H2AX+in+recognition+and+signaling+of+DNA+double-strand+breaks+in+the+context+of+chromatin%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Gamma-H2AX in recognition and signaling of DNA double-strand breaks in the context of chromatin.</a> Nucleic Acids Res. 36 (17), 5678-5694 (2008).</li>
<li>Vasireddy, R. S., Karagiannis, T. C., El-Osta, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((gamma-radiation-induced+gammaH2AX+formation+occurs+preferentially+in+actively+transcribing+euchromatic+loci%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">gamma-radiation-induced gammaH2AX formation occurs preferentially in actively transcribing euchromatic loci.</a> Cell Mol Life Sci. 67 (2), 291-294 (2010).</li>
<li>Goodarzi, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ATM+signaling+facilitates+repair+of+DNA+double-strand+breaks+associated+with+heterochromatin%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">ATM signaling facilitates repair of DNA double-strand breaks associated with heterochromatin.</a> Mol Cell. 31 (2), 167-177 (2008).</li>
</ol>

Nie zgłoszono żadnych konfliktów interesów.

<table><tbody><tr><td>Roswell Park Memorial Institute -1640 (RPMI-1640)</td><td>Pożywka wzrostowa</td><td>Invitrogen</td><td>22400071</td><td>pożywka RPMI-1640, pH 7,4 uzupełniona o 10% (v/v) płodowej surowicy bydlęcej, 2 mM L-glutaminy, 20&amp;#x03BC;g/ml gentamycyny, 20mM (HEPES) N-2-hydroksyetylopiperazyna-N&amp;rsquo;Kwas 2-etanosulfonowy</td></tr><tr><td>płodowa surowica bydlęca (FBS)</td><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F2442</td><td></td></tr><tr><td>Albumin surowicy bydlęcej (BSA)</td><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7906</td><td>BSA (1%) stosuje się w celu zablokowania nieswoistego wiązania przeciwciał. Przeciwciała pierwotne i wtórne rozcieńcza się w BSA.</td></tr><tr><td>PBS (bez Ca2+)&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt; oraz Mg&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;)</td><td></td><td>Invitrogen</td><td>17-517Q</td><td></td></tr><tr><td>Błękit trypanowy</td><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6146</td><td>Stosowane do rozróżnienia komórek żywych i martwych.</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Odczynnik</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td>Triton X-100 (0,1%) stosowany do permeabilizacji komórek.</td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Odczynnik</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>158127</td><td>Paraformaldehyd (4%) stosowany do utrwalania komórek.</td></tr><tr><td>Mysia monoklonalna przeciwciało anty-fosfo histone-H2AX</td><td>Przeciwciało pierwotne</td><td>EMD Millipore</td><td>16193</td><td>Rozcieńczenie przeciwciała pierwszorzędowego (1:500) w 1% BSA.</td></tr><tr><td>Histona H3 (monometylok4) </td><td>Przeciwciało pierwszorzędowe</td><td>Abcam</td><td>AB8895</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 kozie przeciwciało przeciwko mysiemu IgG (H+L)</td><td>Przeciwciało wtórne</td><td>Invitrogen</td><td>11029</td><td>Rozcieńczenie przeciwciała wtórnego (1:500) w 1% BSA.</td></tr><tr><td>przeciwciało kozie anty-królicze IgG (H+L) znakowane Alexa Fluor 546</td><td>Przeciwciało wtórne</td><td>Invitrogen</td><td>11035</td><td></td></tr><tr><td>TOPRO3</td><td>Barwienie DNA</td><td>Invitrogen</td><td>T3605</td><td>TOPRO3 jest barwnikiem do DNA o maksymalnych długościach fali absorpcji i emisji (Abs/Em) wynoszących odpowiednio 642 i 661 nm. W przypadku, gdy mikroskop konfokalny jest wyposażony w laser o długości fali 405 nm, można zastosować DAPI. </td></tr><tr><td>ProLong Gold </td><td>Roztwór przeciwwyblakaniowy</td><td>Invitrogen</td><td>P36930</td><td>Tego medium montażowego na bazie glicerolu należy używać z obiektywem imersyjnym olejowym o dopasowanym współczynniku załamania światła.</td></tr><tr><td>Lamelki pokryte polilizyną</td><td></td><td>Menzel-Glaser</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kryszalki (22x50 mm)</td><td>Szkiełka nakrywki</td><td>Menzel-Glaser</td><td>CS2250100</td><td></td></tr><tr><td>Kolba do hodowli tkankowych, z nakrętką z filtrem</td><td>Kolba hodowlana</td><td>BD Biosciences</td><td>353112</td><td></td></tr><tr><td>Shandon Cytospin 4</td><td></td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cytolejki</td><td></td><td>Shandon, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Karty filtrujące </td><td></td><td>Shandon, Inc.</td><td>353025</td><td></td></tr><tr><td>naczynie Coplin, szklane</td><td></td><td>Grale Scientific P/L</td><td>1771-OG</td><td></td></tr><tr><td>Kuweta do barwienia</td><td></td><td>Grale Scientific P/L</td><td>V1991.99</td><td></td></tr><tr><td>pisak PAP</td><td></td><td>Zymed Laboratories, Inc.</td><td>008877</td><td></td></tr><tr><td>Naświetlacz Gammacell 1000 Elite</td><td>Naświetlacz gamma</td><td>Nordion International Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Konfokalny mikroskop Zeiss LSM 510 Meta</td><td>Mikroskop konfokalny</td><td></td><td></td><td>Wyposażony w 3 lasery: 488 nm, 543 nm i 633 nm.</td></tr><tr><td>Metamorfaza</td><td>Oprogramowanie do analizy obrazowania</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

ocena rozkładu przestrzennego $\gamma$h2ax po napromieniowaniu jonizującym

Evaluation of the Spatial Distribution of &gamma;H2AX following Ionizing Radiation

Wczesną odpowiedzią molekularną na pęknięcia obu nici DNA (DSBs) jest fosforylacja reszty Ser-139 w terminalnym motywie SQEY histony H2AX1,2. Fosforylacja H2AX jest pośredniczona przez białka z rodziny kinaz fosfatydyloinozytolo-3-fosfatazy (PI3K), kinazę ATM (ataxia telangiectasia mutated), katalityczną podjednostkę kinazy DNA-PK oraz kinazę ATR (ATM and RAD3-related)3. Fosforylowana forma H2AX, określana jako γH2AX, rozprzestrzenia się z miejsca pęknięcia DSB na sąsiednie regiony chromatyny, tworząc dyskretne ogniska, które można łatwo zwizualizować za pomocą mikroskopii immunofluorescencyjnej3. Analiza i kwantyfikacja ognisk γH2AX jest szeroko stosowana do oceny powstawania i naprawy DSB, szczególnie w odpowiedzi na promieniowanie jonizujące oraz do oceny skuteczności różnych związków modyfikujących działanie promieniowania i związków cytotoksycznych4.
Biorąc pod uwagę wyjątkową specyficzność i czułość tego nowego markera DSB, dostarczył on nowych informacji na temat procesów uszkadzania i naprawy DNA w kontekście chromatyny. Na przykład w radiobiologii głównym paradygmatem jest przekonanie, że jądrowe DNA stanowi krytyczny cel w odniesieniu do wrażliwości na promieniowanie. Rzeczywiście, powszechny konsensus w tej dziedzinie w dużej mierze postrzegał chromatynę jako jednorodną matrycę dla uszkodzeń i naprawy DNA. Jednakże, przy użyciu γH2AX jako markera molekularnego DSB, zaobserwowano różnice w tworzeniu ognisk γH2AX indukowanych promieniowaniem gamma w euchromatynie i heterochromatynie5-7. Niedawno wykorzystaliśmy panel przeciwciał przeciwko mono-, di- lub tri-metylowanej histonie H3 przy lizynie 9 (H3K9me1, H3K9me2, H3K9me3), które są epigenetycznymi odciskami konstytutywnej heterochromatyny i wyciszania transkrypcyjnego, oraz lizynie 4 (H3K4me1, H3K4me2, H3K4me3), które ściśle korelują z aktywnie transkrybowanymi regionami euchromatycznymi, aby zbadać przestrzenną dystrybucję γH2AX po promieniowaniu jonizującym8. Zgodnie z obowiązującymi koncepcjami dotyczącymi biologii chromatyny, nasze wyniki wykazały ścisłą korelację między formowaniem się γH2AX a aktywną transkrypcją9. W niniejszej pracy prezentujemy naszą metodę immunofluorescencji do wykrywania i ilościowego oznaczania ognisk γH2AX w komórkach nieprzytwierdzających, ze szczególnym uwzględnieniem kolokalizacji z innymi markerami epigenetycznymi, analizy obrazu i modelowania 3D.

Analiza mikroskopowa ognisk γH2AX, które tworzą się po fosforylacji H2AX w Ser-139 w odpowiedzi na pęknięcia dwuniciowe DNA, stała się nieocenionym narzędziem w radiobiologii. W niniejszej pracy wykorzystaliśmy przeciwciało przeciwko monometylowanej histonie H3 w lizynie 4 jako marker epigenetyczny aktywnie transkrybowanej euchromatyny, aby ocenić przestrzenną dystrybucję powstawania indukowanych promieniowaniem ognisk γH2AX w jądrze komórkowym.

Ocena rozkładu przestrzennego $\gamma$H2AX po napromieniowaniu jonizującym

Wczesną odpowiedzią molekularną na pęknięcia dwuniciowe (DSB) DNA jest fosforylacja reszty Ser-139 w obrębie końcowego motywu SQEY histony...

Witam, nazywam się Raja Ti i przygotowuję doktorat w Baker IDI Heart and Diabetes Institute. Przeprowadzę Państwa przez kolejne etapy 3D ilustracji modyfikacji epigenetycznej, która oznacza uszkodzenie DNA i kondensację chromatyny w komórce kardiomiocytu. DNA jest owinięte wokół nukleosomów.Każdy nukleosom składa się z czterech różnych typów histonów: H2A, H2B, H3 i H4. Powstawanie pęknięć DNA jest sygnalizowane przez fosforylację H2AX. Fosforylacja H2AX zachodzi głównie w chromatynie, która jest znakowana metylacją H3K4. Teraz przyjrzymy się ilustracji 3D modyfikacji w komórce, oznakowanej immunochemicznie dla fosfo-H2AX oraz metylowanego H3K4.Zacznijmy. Rozpoczynamy od przelania zawiesiny komórkowej do probówek Falcon 15 ml. Następnie przemywamy je dwukrotnie w PBS, wirując przy 150 g i ponownie resuspendując.Zawiesić w świeżym medium, aby zaobserwować bezpośredni wpływ promieniowania na procesy komórkowe. Utrzymywać komórki na oczach przez 5 do 10 minut przed i w trakcie napromieniowania. Poddać komórki działaniu promieniowania gamma lub promieniowania rentgenowskiego. Po naświetleniu rozdzielić po 3 ml zawiesiny komórkowej do każdego z sześciu GU.Płytka wielodołkowa do wyznaczenia szczytu poziomu gamma H2AX; inkubować komórki od 30 minut do jednej godziny w temperaturze 37 °C. Używamy Cytospin do osadzania nieprzywierających komórek na szkiełkach przedmiotowych. Podczas montażu zestawu do Cytospinu należy upewnić się, że krawędź całego filtra pokrywa się z lejkiem.Odmiarzyć 50 µL zawiesiny komórkowej i nanieść ją na każde szkiełko cytospinowe. Umieścić szkiełka w wirówce do cytospinacji i wirować z prędkością 500 RPM przez pięć minut. Wyjąć szkiełka i oddzielić je od karty filtracyjnej. Nie dopuszczać do zbyt długiego wysychania komórek na powietrzu, ponieważ może to wpłynąć na tło podczas barwienia fluorescencyjnego.Używając płynnego znacznika do blokowania, obrysowujemy okręgi wokół każdego rozmazu, a następnie utrwalamy komórki w 4% paraformaldehydzie w temperaturze pokojowej przez pięć minut. W porównaniu z etanolem lub olejem, lepszą utrwalenie zaobserwowano przy użyciu 4% paraformaldehydu. Przeszkła z PPS permeabilizujemy komórki za pomocą Triton X 100 w temperaturze pokojowej przez pięć minut.W porównaniu do twin 80, zaobserwowaliśmy lepszy sygnał w komórkach z zastosowaniem Triton X 100. Obserwowano komórki z PP S3 trzykrotnie po pięć minut każdorazowo. Komórki blokowano w 1% BSA przez 10 minut w temperaturze pokojowej, powtarzając ten proces trzykrotnie w porównaniu z innymi środkami blokującymi i czasami inkubacji.BSA okazała się najskuteczniejsza w minimalizowaniu niespecyficznego wiązania przeciwciał pierwszorzędowych. Użyliśmy dwóch przeciwciał pierwszorzędowych rozcieńczonych 1:500 w 1% BSA, stosując około 50 µL przeciwciała pierwszorzędowego na każdy preparat. Inkubacja przeciwciał pierwszorzędowych w temperaturze pokojowej przez 60 minut zmniejsza tło w porównaniu z inkubacją nocną w temperaturze 4 °C. Przemyć komórki trzy razy w PBS przez pięć minut.Alexa Fluor 488 jest dobrym przeciwciałem anty-mysim, a Alexa Fluor 546 przeciwciałem anty-króliczym. Przeciwciała wtórne zastosowano w celu jednoczesnego wykrycia różnych markerów. Należy użyć przeciwciał wytworzonych w różnych gatunkach.Nanieś około 50 µL rozcieńczonego przeciwciała wtórnego na każdy preparat. Inkubuj komórki w temperaturze pokojowej przez 90 minut. Zaleca się inkubację komórek w komorze wilgotnościowej, aby zapobiec wysychaniu komórek i przeciwciał. Przemyj preparaty PBS 3 razy, każdorazowo przez pięć minut.50 µL rozcieńczenia 1:500 topo three w PBS dodano do każdego slajdu. Slajdy przemywano PBS-em trzykrotnie, za każdym razem przez pięć minut. Usunięto nadmiar wilgoci ze slajdów i dodano roztwór Antifa.Zaleca się, aby nie wysuszać komórek całkowicie przed dodaniem roztworu Antifa. Na szkiełko przedmiotowe nałożyć szkiełko nakrywkowe. Należy zachować ostrożność, aby uniknąć powstania pęcherzyków powietrza.Pozostawić preparaty na noc w ciemnej, wilgotnej komorze. Zabezpieczyć preparat lakierem do paznokci, aby zapobiec wysychaniu komórek. Obrazy uzyskane za pomocą mikroskopu konfokalnego ujawniają.W celu uzyskania lepszej rozdzielczości przestrzennej do akwizycji obrazów wykorzystano laser helowy. Wybrano obiektywy imersyjne 63x zamiast obiektywów o wyższym lub niższym powiększeniu. Zastosowanie trzykrotnego lub czterokrotnego zoomu pozwoli uzyskać obraz o lepszej rozdzielczości.W przypadku obrazowania FO z wielu komórek zaleca się stosowanie prędkości skanowania wynoszącej osiem oraz rozmiaru obrazu 1024 na 1024 piksele na komórkę. Podczas obrazowania w wielu kanałach zaleca się sekwencyjne pozyskiwanie skanów liniowych zamiast skanowania ramkowego. Aby uniknąć blaknięcia próbki, wzmocnienie detektora i offset wzmacniacza zostają dostrojone w celu zredukowania szumów oraz nasycenia sygnału.Ponieważ rozmiar Kama HX X four może być mniejszy niż 0,5 µm, zaleca się pozyskiwanie obrazów o rozdzielczości co najmniej 0,5 µm. W przypadku serii obrazów wzdłuż osi strumienia, wymagany jest krok obrazowania w układzie seryjnym z wykorzystaniem wzorca mark first oraz mark lost. Aby zobrazować relacje przestrzenne między różnymi białkami, zaleca się zastosowanie prędkości skanowania 6 przy rozmiarze obrazu 2048 na 2048 pikseli z wykorzystaniem metamor first.Po drugie, zliczenia można przeprowadzić na obrazach uzyskanych za pomocą różnych mikroskopów konfokalnych. Otwórz tagi obrazów gamma hgx bezpośrednio z menu plików lub korzystając z numerów rachunków. Przejdź do menu procesów i wybierz Arytmetykę stosu.Wybierz opcję maksymalnej projekcji (maximum projection) i zaznacz płaszczyzny, które mają zostać uwzględnione. Następnie kliknij OK. Teraz wybierz funkcję top hat i wskaż obraz Gamma H two X jako obraz źródłowy, a następnie zatwierdź wybór.Filtr top-hat oraz wynikowy obraz będą obrazami binarnymi o mniejszym poziomie szumów i zredukowanej zmienności intensywności ognisk. Przejdź do zakładki regions, wybierz narzędzie do rysowania obszarów (region drawing tool) i obrysuj jądra komórkowe. Przejdź do menu process i wybierz opcję sell threshold image.Wybierz próg włączenia i ustaw wartości progu dolnego oraz górnego. Zazwyczaj to właśnie wartości progowe wpływają na cztery liczby. Optymalny próg to taki, który minimalizuje włączenie tła i maksymalizuje włączenie obiektów.Najlepiej osiągnąć to poprzez zliczenie liczby wypustek (foray) przy użyciu różnych wartości progowych. Następnie należy porównać liczbę wypustek z wynikiem liczenia „gołym okiem”. Wybierz obraz DPI, przejdź do menu obszarów (regions) i wybierz opcję przesyłania obszarów (transfer regions).Obecnie mamy przygotowane odpowiadające sobie obrazy z obszarów zainteresowania oraz obrazy jąder do zliczenia. Większość regionów jądrowych została przeniesiona do funkcji top hat. Przejdź do menu Measure (Pomiar) i wybierz Integrated Ary Analysis lub IMA. Zaznacz Measure all regions (Pomierz wszystkie regiony) i kliknij Measure (Pomierz), aby uzyskać liczbę FTE.Teraz wartości FTE z każdego regionu można wyeksportować do arkusza kalkulacyjnego, korzystając z opcji Log data. Otwórz wcześniej utworzone obrazy z projektora jet dla każdego kanału. Przejdź do menu display i wybierz color align.Wybierz odpowiednie obrazy źródłowe dla każdego kanału, aby stworzyć obraz zbiorczy dla wszystkich trzech kanałów. Analiza skanowania liniowego jest przeprowadzana w celu zilustrowania rozmieszczenia przestrzennego różnych markerów w jądrze komórkowym. Przejdź do paska narzędzi pomiarowych, wybierz polecenie analizy skanowania liniowego i poprowadź linię przez komórkę.W ten sposób zostanie utworzony wykres przedstawiający intensywność fluorescencji każdego kanału wzdłuż linii, co obrazuje odległość poszczególnych markerów względem siebie. Aby utworzyć obraz 3D ze stosu obrazów, przejdź do menu stack i wybierz 3D reconstruction. Jako typ rekonstrukcji 3D wybierz maximum.Wybierz płaszczyznę rotacji oraz odległość kalibracji strumienia. Zazwyczaj użytkownik zatwierdza wybór, klikając „OK”, aby utworzyć rekonstrukcję 3D. To kończy nasz protokół dotyczący immunofluorescencji, barwienia i analizy obrazu.Podsumowując, mikroskopia konfokalna z immunofluorescencją to dwie techniki służące do trójwymiarowej wizualizacji różnych markerów C oraz ognisk gamma H2AX w jądrze komórkowym. Dziękujemy za uwagę.

evaluation-spatial-distribution-h2ax-following-ionizing

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Ocena przestrzennego rozmieszczenia γH2AX po napromieniowaniu jonizującym

Ilościowe oznaczanie pęknięć obu nici DNA z wykorzystaniem formowania γH2AX jako markera molekularnego stało się nieocenionym narzędziem w radiobiologii. W niniejszej pracy demonstrujemy zastosowanie testu immunofluorescencyjnego do ilościowego oznaczania ognisk γH2AX po narażeniu komórek na promieniowanie.

Ilościowe oznaczanie ognisk &gamma;H2AX w odpowiedzi na promieniowanie jonizujące

Ilościowe oznaczanie pęknięć dwuniciowych DNA na podstawie ognisk γH2AX stało się nieocenionym narzędziem, szczególnie w radiobiologii, służącym do oceny radiowrażliwości tkanek oraz efektów związków modyfikujących działanie promieniowania. W niniejszym materiale demonstrujemy zastosowanie testu immunofluorescencyjnego do ilościowego oznaczania ognisk γH2AX w próbkach tkanek.

Ilościowe oznaczenie ognisk $\gamma$H2AX w próbkach tkanek

Przedstawiono protokół oceny zmian w poziomach uszkodzeń DNA i zdolności do naprawy DNA, które mogą być wywołane przez przewlekłe napromienianie in vivo niskimi dawkami limfocytów śledziony myszy, poprzez pomiar fosforylowanego histonu H2AX, markera pęknięć dwuniciowych DNA, za pomocą cytometrii przepływowej.

Pomiar uszkodzeń i naprawy DNA w splenocytach myszy po przewlekłej ekspozycji in vivo na bardzo niskie dawki promieniowania beta i gamma

Ten manuskrypt zawiera protokół do analizy pęknięć dwuniciowych DNA za pomocą mikroskopii immunofluorescencyjnej γH2AX i 53BP1.

Mikroskopia immunofluorescencyjna γH2AX i 53BP1 do analizy powstawania i naprawy pęknięć dwuniciowych DNA

Naprawa pęknięć dwuniciowego DNA jest procesem dynamicznym, wymagającym nie tylko tworzenia kompleksów naprawczych w miejscach pęknięć, ale także ich rozwiązania po usunięciu zmiany. W tym przypadku używamy mikroskopii immunofluorescencyjnej do przejściowych i długotrwałych pęknięć dwuniciowych jako narzędzia do analizy tego mechanizmu utrzymania genomu.

Charakterystyka procesów naprawy DNA przy przejściowych i długotrwałych pęknięciach dwuniciowego DNA za pomocą mikroskopii immunofluorescencyjnej

Prezentowana metoda łączy ilościową analizę pęknięć dwuniciowych DNA (DSB), dystrybucji cyklu komórkowego i apoptozy, aby umożliwić specyficzną dla cyklu komórkowego ocenę indukcji i naprawy DSB, jak również konsekwencji niepowodzenia naprawy.

Specyficzny dla cyklu komórkowego pomiar γH2AX i apoptozy po stresie genotoksycznym za pomocą cytometrii przepływowej

Po uszkodzeniu DNA, ludzkie komórki aktywują niezbędne szlaki naprawcze, aby przywrócić integralność swojego genomu. W tym miejscu opisujemy metodę immunofluorescencji pośredniej jako sposób na wykrycie białek naprawy DNA, analizę ich przestrzennej i czasowej rekrutacji oraz pomoc w badaniu interakcji białko-białko w miejscach uszkodzenia DNA.

Wizualizacja oddziaływania białek naprawy DNA za pomocą immunofluorescencji

Ten artykuł przedstawia podstawowe etapy immunobarwienia i immunoprecypitacji chromatyny. Protokoły te są powszechnie stosowane do badania procesów komórkowych związanych z uszkodzeniem DNA oraz do wizualizacji i ilościowego określenia rekrutacji białek zaangażowanych w naprawę DNA.

Wizualizacja i ilościowe określanie uszkodzeń DNA specyficznych dla miejsca na podstawie endonukleazy

Ten protokół przedstawia przygotowanie preparatu i automatyczną ocenę testu ognisk γ-H2AX na limfocytach krwi obwodowej. Aby zilustrować metodę i czułość testu, izolowane limfocyty napromieniano in vitro. Ta zautomatyzowana metoda wykrywania DNA DSB jest przydatna w szybkich i wysokowydajnych zastosowaniach dozymetrii biologicznej.

Zautomatyzowana mikroskopowa metoda oceny ognisk γ-H2AX w ludzkich limfocytach krwi obwodowej

Ten protokół przedstawia metodę oceny powstawania i naprawy pęknięć dwuniciowych DNA poprzez jednoczesne wykrywanie ognisk γH2AX i 53BP1 w jądrach interfazowych ludzkich limfocytów obwodowych traktowanych bleomycyną.

Podwójna immunofluorescencja γH2AX i 53BP1 w ludzkich limfocytach obwodowych

Tutaj prezentujemy prosty i szybki protokół wykrywania oddziaływań białek w miejscach uszkodzenia DNA.

Test ligandów zbliżeniowych do lokalizacji białek w miejscach uszkodzenia DNA

Poznaj metodę oceny rozkładu przestrzennego γH2AX po promieniowaniu jonizującym w jądrze komórkowym. Technika ta umożliwia wizualizację uszkodzeń DNA i modyfikacji chromatyny.

Ocena rozkładu przestrzennego $\gamma$H2AX po napromieniowaniu jonizującym

Przeglądaj więcej filmów