Ocena rozkładu przestrzennego γH2AX po promieniowaniu jonizującym

Cześć, nazywam się Raja Ti i robię doktorat w Instytucie Serca i Cukrzycy Baker IDI. Przeprowadzę Cię przez kroki, które są związane z ilustracją 3D wschodniej modyfikacji, która zaznaczyła uszkodzenie DNA i kondensację chromatyczną w nowej komórce serca. DNA jest owinięte wokół stref jądrowych.

Każdy nukleosom składa się z czterech różnych typów histonów, H dwa A, H dwa b, H trzy i H cztery promienie. Tworzenie DNA pęka i jest to oznaczone PHO z H dwa X. Ten pho z H dwa X występuje głównie w kreatynie, która jest oznaczona metylacją H trzy K cztery. Teraz przyjrzymy się ilustracji 3D modyfikacji w etykiecie immunologicznej komórki z warstwą pho H dwa X i metylowaną H Trzy K cztery.

Zacznijmy. Zaczynamy od umieszczenia przebiegu E zawiesiny komórkowej w 15 milach. Probówki Falcon S myje się dwukrotnie za pomocą zapachu PB w jednym 50 G i Resus.

Zawieś na nowym nośniku, aby zobaczyć natychmiastowy wpływ promieniowania na zdarzenia komórkowe. Utrzymuj komórki na oczach przez pięć do 10 minut przed i w trakcie napromieniania. Wystaw komórki na działanie promieniowania gamma lub promieni rentgenowskich Po napromieniowaniu dozuj trzy mililitry zawiesiny komórek do każdego GU z sześciu.

Płytka studzienkowa dla piku gamma H dwie X inkubują komórki między 30 minutami do jednej godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Używamy misji Cytosine do umieszczania nieprzylegających komórek na szklanych szkiełkach. Podczas montażu klipsa cytozyny upewnij się, że cały przewód filtra pokrywa się z lejkiem.

Dozuj jeden 50 mikrolitrów, przetrzyj tę zawiesinę komórek Do każdego końcowego miejsca cytozyny cytozyna zaciska się w misji Cytozyna i kręć nią 500 obr./min przez pięć minut. Usuń klipsy cytozyny i oddziel szkiełka od karty filtra. Nie pozwól, aby komórki wyschły na powietrzu zbyt długo, ponieważ może to wpłynąć na tło w barwieniu fluoresceiną.

Za pomocą płynnej szpilki blokującej rysujemy kręgi Wokół każdego rozmazu utrwalamy komórki za pomocą 4% głowicy paraform w temperaturze pokojowej przez pięć minut. W porównaniu z etanolem lub olem lepsze utrwalenie zaobserwowano przy 4% główce paraform. Ślizgi wiatrowe z komórkami przepuszczalnymi PPS z Triton X 100 w temperaturze pokojowej przez pięć minut.

W porównaniu z bliźniakiem 80 zaobserwowaliśmy lepszy sygnał w komórkach per z Triton X 100. Obserwuj komórki z PP S3 razy przez pięć minut. Zablokuj komórki w jednej osobie BSA przez 10 minut w temperaturze pokojowej i powtórz to trzy razy w porównaniu z innymi środkami blokującymi i czasami.

BSA było najbardziej skuteczne W minimalizowaniu nieswoistego wiązania przeciwciał pierwszorzędowych, użyliśmy dwóch przeciwciał pierwszorzędowych rozcieńczonych jeden na 500 z 1% BSA w około 50 mikrolitrach przeciwciała pierwszorzędowego na każdym szkiełku. Inkubacja przeciwciała pierwszorzędowego w temperaturze pokojowej przez 60 minut zmniejsza barwienie tła w porównaniu z inkubacją przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Umyj komórki trzykrotnie PBS przez pięć minut.

Alexa piętro 4 88, dobre anty mysz i Alexa piętro 5 46 słowo anty królik. Przeciwciała drugorzędowe zastosowano w celu jednoczesnego utrzymania różnych markerów. Używaj przeciwciał wyhodowanych u różnych gatunków.

Dodać około 50 mikrolitrów rozcieńczonego przeciwciała drugorzędowego do każdego szkiełka. Inkubować komórki w temperaturze pokojowej przez 90 minut. Zaleca się inkubację komórek w wilgotnej komorze, ponieważ zapobiegnie to wysuszaniu komórek i przeciwciał szkiełek do mycia PB S3 razy przez pięć minut.

Do każdego szkiełka dodano 50 mikrolitrów rozcieńczenia jeden na 500 topo trzy w PBS. Myj szkiełka PBS trzy razy każdy przez pięć minut. Usuń nadmiar wilgoci ze szkiełek i dodaj roztwór Antify.

Zaleca się, aby nie suszyć całkowicie komórek przed dodaniem roztworu Antify. Umieść szkiełko nakrywkowe na szkiełku podstawowym. Potasu należy przyjmować, aby uniknąć tworzenia się pęcherzyków powietrza.

Pozostaw szkiełka na noc w ciemnej, wilgotnej komorze. Uszczelnij szkiełko lakierem do paznokci, aby zapobiec wysuszeniu komórek. Obrazy uzyskane za pomocą mikroskopu konfokalnego ujawniają.

Lepsza rozdzielczość przestrzenna zniknęła, a do akwizycji obrazu użyto lasera helowego. Obiekt z emisją oleju 63 dwie soczewki preferowane są zamiast soczewek o większym lub mniejszym powiększeniu. Trzykrotny lub czterokrotny współczynnik powiększenia zapewni obraz o lepszej rozdzielczości.

W przypadku rozliczania FO z wielu komórek preferowane jest użycie prędkości skanowania wynoszącej osiem, rozmiaru obrazu 1024 w komórkach o rozmiarze 1024 pikseli. W przypadku obrazowania dla wielu kanałów zaleca się sekwencyjną akwizycję skanowania liniowego w porównaniu ze skanowaniem klatek. Aby uniknąć blaknięcia próbki, wzmocnienie detektora i przesunięcie wzmacniacza są regulowane w celu zmniejszenia myszy i nasycenia sygnału.

Ponieważ rozmiar Kama HX X four może być mniejszy niż 0,5 mikrometra, zaleca się pozyskiwanie obrazów z dokładnością co najmniej 0,5 mikrometra. Obrazy o stopniowym rozmiarze wzdłuż osi strumienia są wymagane w przypadku wzoru serii strumieniowej przy użyciu wzoru najpierw zaznacz i oznacz utracony. Aby zilustrować zależność przestrzenną między różnymi białkami, zaleca się użycie prędkości skanowania sześciu przy rozmiarze obrazu 2048 I 2 48 pikseli przy użyciu metamoru najpierw.

Drugi można liczyć na podstawie obrazów uzyskanych pod różnymi mikroskopami konfokalnymi. Otwieraj znaczniki obrazów gamma hgx bezpośrednio z menu plików lub przy użyciu numerów rachunków. Tagi. Przejdź do menu procesu i wybierz Arytmatyka stosu.

Wybierz maksymalną projekcję i wybierz plany, które mają zostać uwzględnione. I kliknij OK. Teraz wybierz cylinder i wybierz obraz Gamma H two X jako obraz źródłowy.

Filtr cylindra i wynikowy obraz będzie obrazem binarnym z mniejszą ilością szumów i zmniejszoną zmiennością intensywności ognisk. Przejdź do regionów i wybierz narzędzie do rysowania regionów i narysuj regiony wokół jąder. Przejdź do obrazu, menu i progu sprzedaży.

Wybierz próg włączenia i ustaw dolną i wyższą wartość progową. Zazwyczaj to wartości progowe wpływają na liczbę cztery. Optymalna wartość progowa to taka, która minimalizuje włączenie tła i maksymalizuje włączenie próby.

Najlepiej można to osiągnąć, licząc liczbę wypadów przy użyciu różnych wartości progowych. A potem porównaj liczbę wypadów z liczeniem gołym okiem. Wybierz obraz DPI i przejdź do menu regionów i wybierz opcję transferu regionów.

Teraz mamy odpowiednie zdjęcia z wyprawy i nuklearne gotowe do zliczenia. Większość regionów jądrowych zostaje przeniesiona do cylindra. Przejdź do pomiaru, menu i wybierz zintegrowaną analizę ary lub IMA, wybierz Zmierz wszystkie regiony i kliknij na pomiar, aby uzyskać numer FTE.

Teraz numery FTE z każdego regionu można wyeksportować do arkusza kalkulacyjnego za pomocą opcji Dane dziennika. Otwórz poprzednio utworzone obrazy projektora strumieniowego dla każdego kanału. Przejdź do ekranu i wybierz wyrównanie kolorów.

Wybierz odpowiednie obrazy źródłowe dla każdego kanału, aby utworzyć obraz obrazu dla wszystkich trzech kanałów. Analiza skanowania liniowego jest wykonywana w celu zilustrowania przestrzennego położenia różnych markerów w jądrze. Przejdź do polecenia pomiaru pasków narzędzi i wybierz analizę skanowania linii, suchą linię w poprzek komórki.

Spowoduje to utworzenie wykresu przedstawiającego intensywność fluorescencji każdego kanału wzdłuż linii i reprezentuje odległość różnych znaczników względem siebie. Aby utworzyć obraz 3D ze stosu, przejdź do menu stosu i wybierz Rekonstrukcja 3D. Wybierz maksymalny typ rekonstrukcji 3D.

Wybierz plan rotacji, wybierz odległość kalibracji strumienia. Zazwyczaj użytkownik określa przycisk OK, aby utworzyć rekonstrukcję 3D. I na tym kończymy nasz protokół dotyczący immunofluoru, barwienia i analizy obrazu.

Podsumowując, immunofluorescencyjny mikroskop konfokalny to dwie techniki trójwymiarowego widzenia różnych markerów C i gamma H dwa X foy w jądrze komórkowym. Dzięki za oglądanie.