Mikroskopia z kontrastem fazowym do oceny mutantów rozwojowych u Streptomyces

Zacznij od płytek agarowych zawierających kolonie dzikich i zmutowanych szczepów Streptomyces coelicolor, nitkowatej bakterii glebowej.

Umieść sterylne szkiełko nakrywkowe na obszarze gęstego wzrostu kolonii, gdzie włókna powietrzne, które są włóknami wystającymi ponad powierzchnię kolonii, są wyraźnie widoczne.

Delikatnie dociśnij szkiełko nakrywkowe, aby przenieść włókna powietrzne i związane z nimi zarodniki na powierzchnię szkiełka nakrywkowego.

Następnie weź szkiełko mikroskopowe z podłożem montażowym i zamontuj szkiełko nakrywkowe komórką do dołu, aby zachować struktury bakteryjne.

Umieść szkiełko na stoliku mikroskopowym, dodaj kroplę olejku immersyjnego na szkiełko nakrywkowe i wyrównaj obiektyw.

Korzystając z mikroskopii z kontrastem fazowym, uzyskaj obrazy włókien powietrznych zarówno ze szczepów dzikich, jak i zmutowanych.

Włókna typu dzikiego wykazują jednolitej wielkości, regularnie rozmieszczone zarodniki.

W przeciwieństwie do tego, zmutowane szczepy wykazują wady, takie jak wybrzuszone włókna, nieregularne zarodniki lub zlizowane zarodniki, ujawniając rozwojowe różnice fenotypowe między typem dzikim a mutantami.

Aby przygotować szkiełko nakrywkowe do liftingu bakterii, użyj sterylnej pęsety, aby podnieść sterylne szkiełko nakrywkowe i umieść szkiełko nakrywkowe na płytce agarowej MS, gdzie rozwój bakterii jest gęsty. Za pomocą pęsety delikatnie dociśnij tylną część szkiełka nakrywkowego, aby zapewnić wystarczający transfer zarodników bakterii i grzybni powietrznej. Podnieś szkiełko nakrywkowe z płytki i umieść je pod kątem 45 stopni, tak aby materiał komórkowy był skierowany w stronę powierzchni szkiełka mikroskopowego zawierającego 15 mikrolitrów kropli 50% glicerolu.

Pozwól, aby szkiełko nakrywkowe opadło na glicerol, co zmniejszy pęcherzyki powietrza. Aby wykonać mikroskopię z kontrastem fazowym w różnych odstępach czasu, umieść przygotowane szkiełko na stoliku mikroskopu i dodaj kroplę olejku immersyjnego na środek szkiełka nakrywkowego. Obróć obiektyw fazowy 100x na miejsce i ustaw wieżyczkę skraplacza na odpowiednie ustawienie fazy.

Gdy soczewka obiektywu zetknie się z olejem, do ustawienia ostrości obrazu należy używać wyłącznie pokrętła precyzyjnej regulacji. Zbadaj kilka pól widzenia, aby dostrzec zauważalne i spójne różnice między zmutowanymi szczepami a typem dzikim. Takich jak zdolność do tworzenia zarodników, wielkość i kształt zarodników oraz ogólna liczba zarodników.