JoVE Encyclopedia of Experiments
Mikrobiologia
0 wyświetleń • 2:15 min • October 30th, 2025
Jako odniesienie weź szkiełko zawierające uśpione zarodniki bakterii i mikrosfery fluorescencyjne.
Zarodniki przenoszą czerwone i zielone fluorescencyjne reportery dla białek kiełkujących, z wewnętrzną błoną wybarwioną przy użyciu barwnika lipofilowego.
Zamontuj szkiełko na mikroskopie oświetlenia strukturalnego lub karcie SIM wyposażonej w obiektyw zanurzeniowy z olejkiem.
Zlokalizuj mikrosfery fluorescencyjne i dostosuj ostrość, aby zminimalizować rozmycie obrazu.
Następnie użyj światła przechodzącego, aby zlokalizować zarodniki bakterii.
Przełącz się w tryb SIM i oświetl zarodniki, aby wzbudzić fluorofory.
Uzyskaj obrazy fluorescencyjne o wysokiej rozdzielczości na całej głębokości zarodników.
Na lipofilowej, barwionej barwnikiem błonie wewnętrznej białka kiełkowania pojawiają się jako wyraźne czerwone i zielone ogniska. Umożliwia to precyzyjne mapowanie lokalizacji białek kiełkujących w przetrwalnikach bakterii.
Aby zobrazować próbki, umieść szkiełko w mikroskopie oświetlenia strukturalnego wyposażonym w 100-krotny obiektyw olejowy i skup się na 100-nanometrowych mikrosferach fluorescencyjnych.
Wyreguluj pierścień korekcyjny na obiektywie 100x, aż uzyskasz funkcję symetrycznego rozproszenia punktów, aby zminimalizować rozmycie obrazów, i wybierz pole widzenia z około 10 okrągłymi mikrosferami fluorescencyjnymi. Zastosuj siatkową regulację ostrości dla wyznaczonych długości fal wzbudzenia, w tym przypadku 561 i 488 nanometrów, jako wskazówkę dla oprogramowania do analizy obrazu przed ustawieniem ostrości na zarodnikach światła transmisyjnego. Uchwyć obraz w świetle transmisyjnym w trybie 16-krotnej średniej z 20-milisekundową ekspozycją dla każdego obrazu.
Następnie uchwyć surowe obrazy fluorescencyjne zarodników za pomocą mikroskopu oświetlenia strukturalnego 3D w trybie oświetlenia 3D-SIM.