Protokół identyfikacji gatunków ryb na podstawie DNA

Ta publikacja opisuje, jak korzystać z Systemu Identyfikacji Gatunków Ryb Agilent do identyfikacji gatunków ryb poprzez ekstrakcję DNA i przeprowadzanie analizy PCR i RFLP.

System Identyfikacji Gatunków Ryb to prosta, szybka i dokładna metoda identyfikacji gatunków ryb obecnych w danej próbce oparta na DNA. Próbki ryb traktuje się proteinazą K w celu uwolnienia kwasów nukleinowych do roztworu. DNA genomowe ryb jest następnie izolowane i amplifikowane PCR przy użyciu starterów, które wiążą się z sekwencjami znajdującymi się we wszystkich genomach ryb.

Produkty PCR są następnie trawione za pomocą trzech różnych enzymów restrykcyjnych i rozpuszczane w bioanalizatorze Agilent 2100. Długości fragmentów powstające w reakcjach trawienia można wykorzystać do określenia gatunków ryb za pomocą polimorfizmu długości fragmentów restrykcyjnych lub oprogramowania do dopasowywania wzorców RFLP. Cześć, nazywam się Rachel Formosa i pracuję w Agilent Technologies.

Dzisiaj pokażemy Ci procedurę identyfikacji gatunków ryb na podstawie DNA. Procedura ta jest metodą przesiewową, która pozwala zidentyfikować gatunki ryb obecne w próbkach świeżych, mrożonych, mielonych, gotowanych, suszonych lub w inny sposób przetworzonych. A można to osiągnąć w mniej niż jeden dzień roboczy.

Używamy tej procedury do badania autentyczności owoców morza, co jest bardzo ważne dla branży owoców morza, ponieważ zastępowanie i błędne etykietowanie może mieć poważne konsekwencje ekonomiczne, środowiskowe i związane z bezpieczeństwem żywności. Ponadto określenie gatunków ryb za pomocą identyfikacji wizualnej i innych tradycyjnych metod może być szczególnie trudne. Po przetworzeniu ryby, testy DNA zapewniają znacznie dokładniejszy i bardziej wiarygodny wynik.

Więc zacznijmy. Rozpocznij przygotowywanie próbek do ekstrakcji DNA, umieszczając od 10 do 1000 miligramów każdej surowej lub gotowanej próbki tkanki rybnej w 1,5-mililitrowych mikroprobówkach wirówkowych dla każdej ryby. Pobrać próbkę z 220 mikrolitrów świeżo przygotowanego roztworu proteinazy i pipetować w górę iw dół.

Inkubować probówki w temperaturze 65 stopni Celsjusza przez 10 minut po wirówce inkubacyjnej przez trzy do pięciu minut w temperaturze 14 000 Gs, aby osadzać wszelkie niestrawione tkanki. Następnie ostrożnie przenieś 150 mikrolitrów każdego supernatantu do świeżej probówki o pojemności 1,5 mililitra, unikając niestrawionego materiału na dole i oleistego materiału obecnego na górze. Supernatant zostanie teraz wykorzystany do ekstrakcji genomowego DNA.

Rozpocznij ekstrakcję genomowego DNA, dodając 500 mikrolitrów buforu wiążącego kwas nukleinowy do każdej próbki. Dzięki temu całkowita objętość próbki wyniesie 650 mikrolitrów. Wirować próbkę aż do homogenizacji.

Następnie przenieś każdą próbkę do kubka wirowego wiążącego DNA, który został umieszczony w jednej z dwóch mililitrowych probówek dostarczonych w zestawie. Zatrzaśnij nasadkę rurki na górze kubka wirowego. Wiruj próbki przez jedną minutę w temperaturze 14 000 Gs, aby załadować DNA na matrycę kubka wirowego.

Po odwirowaniu wyjmij kubki wirowe, wyrzuć filtrat i umieść kubki z powrotem w probówkach z pojemnikiem. Dodaj 500 mikrolitrów jednego x bufor do płukania o wysokiej zawartości soli. Zakryj probówki i ponownie odwiruj po odwirowaniu.

Wyrzucić filtrat i ponownie umieścić kubki wirowe z powrotem w probówkach pojemników. Teraz dodaj 500 mikrolitrów 80% etanolu. Zakręć rurkę i wiruj z prędkością 14 000 G przez jedną minutę.

Powtórz płukanie etanolem jeszcze dwa razy po trzecim płukaniu w 80% etanolu, wyrzuć filtraty. Wymień kubki wirowe w rurkach pojemnika i tym razem wiruj przez dwie minuty, aby wysuszyć matrycę włóknistą. Teraz przenieś kubki wirowe do 1,5 mililitrowych probówek zbiorczych.

Dodaj 100 mikrolitrów buforu ewolucyjnego do każdej filiżanki wirowej bezpośrednio na matrycy włókien wewnątrz kubka. Następnie zatrzaśnij nakrętki probówek zbiorczych na kubkach wirowych i inkubuj je w temperaturze pokojowej przez jedną minutę. Po inkubacji należy wirować próbki z maksymalną prędkością przez jedną minutę.

Następnie wyrzuć kubek wirowy i zakryj rurki. Jeśli mierzone są stężenia DNA, oczekuje się stężeń w zakresie od pięciu nanogramów na mikrolitr do 500 nanogramów na mikrolitr. DNA może być teraz przechowywane w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez okres do jednego miesiąca w celu długotrwałego przechowywania, umieść DNA w temperaturze minus 20 lub minus 80 stopni Celsjusza.

Wykonaj PCR przy użyciu starterów i odczynników znajdujących się w zestawie odczynników P-C-R-R-F-L-P. Zgodnie z dołączonym pisemnym protokołem zaleca się przeprowadzenie każdej próbki, w tym pozytywnej kontroli anty no template w dwóch egzemplarzach, podczas gdy PCR jest uruchomiony. Przygotować główne mieszanki enzymów restrykcyjnych do mineralizacji z DTE E jeden HAE trzy i NL trzy, łącząc następujące składniki w kolejności: 1,5 mikrolitra sterylnej wody destylowanej, 0,5 mikrolitra 10 x buforu enzymatycznego i 0,5 mikrolitra 10 x enzymu.

Przygotować wystarczającą ilość na wszystkie próbki plus jedną objętość reakcyjną, nadmiar mieszaniny odczynników fourex three. Następnie rozprowadzić 2,5 mikrolitra do każdej probówki reakcyjnej oznaczonej nazwą próbki i enzymu. Po zakończeniu PCR wyjmij próbki z termocyklera i umieść je na lodzie.

Dodaj 2,5 mikrolitra każdego produktu PCR do każdej z trzech probówek do trawienia restrykcyjnego dla tej reakcji. DDE jeden HAE trzy i NLA trzy. Następny wir.

Krótko odwirować i inkubować procesy trawienia w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez dwie godziny. Jeśli jest to wygodniejsze, trawienie można również inkubować przez noc. Po roztrawieniu inkubuj reakcje w temperaturze 65 stopni Celsjusza przez 15 minut.

Następnie dodaj jeden mikrolitr 60-milimolowego EDTA do każdej probówki, aby zakończyć reakcję i wirować. Korzystając z zestawu odczynników do bioanalizatora Agilent, przygotuj i załaduj trawienie restrykcyjne do dołków chipa DNA A zgodnie z przewodnikiem po zestawie. Dla każdej próbki wszystkie trzy ekstrakty powinny być załadowane na ten sam chip.

Następnie zwiruj wiór i załaduj go do maszyny. Po zakończeniu przebiegu przejdź do kontekstu testu i wybierz kartę podsumowania chipów. W polu nazwy próbki wprowadź nazwę próbki dla wszystkich 12 dołków chipa, aby zidentyfikować gatunki ryb dla badanych próbek DNA.

Uruchom program dekodujący RFLP, klikając plik. Następnie otwórz plik XAD. Otworzy się otwarte okno dialogowe.

Teraz wybierz plik XAD dla użytego chipa DNA. I kliknij otwórz, aby zobaczyć listę próbek załadowanych na chip. Należy wybrać trzy składniki trawienia odpowiadające pierwszej próbce DNA.

W kolumnie enzymu określ enzymy restrykcyjne, które zostały użyte w polu oznaczonym jako minimalna wysokość piku jako procent dolnego markera. W razie potrzeby wartość domyślna to 10%. Wartość ta może być obniżona w celu zidentyfikowania małych pików, które zostały pominięte lub podniesione w celu odrzucenia pików wynikających z niespecyficznego szumu w elektroferogramie.

Po wprowadzeniu jakichkolwiek zmian w minimalnej wartości wysokości szczytowej kliknij przycisk Integruj ponownie. Teraz kliknij calc u dołu okna dialogowego. Dane o długości fragmentu uzyskane z przebiegu bioanalizatora wypełnią pola oprogramowania.

Następnie z listy rozwijanej wyników w lewym górnym rogu ekranu wybierz kości. Jeżeli próbka ryb składa się z pojedynczego gatunku ryb lub mieszanki, jeżeli próbka może składać się z mieszanki, tabela na dole ekranu oznaczona jest połączoną listą punktową. Najlepsze dopasowania gatunków na podstawie wyników wszystkich trzech reakcji trawienia.

Idealne dopasowania z wynikiem jeden są podświetlone na zielono. Bliskie dopasowania są podświetlone na żółto u góry ekranu. Dolna wartość odcięcia określa minimalny rozmiar fragmentu używany w analizie, a wartość tolerancji dopasowania określa, jak blisko długości musi znajdować się fragment przewidywany, aby można go było uznać za zgodny.

Pokazane wartości są ustawieniami domyślnymi i można je dostosować. Powtórz te kroki, aby przeprowadzić analizę pozostałych próbek DNA na końcówce. Próbki DNA czterech różnych gatunków ryb zostały wyizolowane, amplifikowane i strawione przy użyciu metody opisanej w tym filmie.

Żel do bioanalizatora przedstawiający próbki trawienia restrykcyjnego jest pokazany tutaj przy użyciu bioanalizatora Agilent i dekodera RFLP. Do identyfikacji ryb wykorzystywane są tutaj programowe wzorce gięcia. Pierwsza próbka jest prawidłowo zidentyfikowana jako pstrąg, druga jako tuńczyk, a trzecia jako gleba skalna.

I ostatnia próbka jako specyficzny dorsz. Właśnie pokazaliśmy, jak przeprowadzić identyfikację gatunków ryb na podstawie DNA za pomocą metody P-C-R-R-F-L-P firmy agilent. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby uniknąć zanieczyszczenia krzyżowego próbek, ponieważ metoda jest tak czuła.

Więc to wszystko. Teraz wiesz, jak szybko, łatwo i dokładnie zidentyfikować gatunki ryb obecne w Twoich próbkach. Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w eksperymentach.