Kwantyfikacja aktywności elementów cis-regulatorowych w siatkówce myszy za pomocą elektroporacji eksplantacyjnej.

Ten protokół opisuje prosty i tani sposób ilościowego określania aktywności elementów cis-regulatorowych (tj. wzmacniaczy/promotorów) w żywych siatkówkach myszy za pomocą elektroporacji eksplantacyjnej. Opisano przygotowanie DNA, rozwarstwienie siatkówki, elektroporację, hodowlę eksplantatów siatkówki oraz analizę i kwantyfikację po utrwaleniu.

Ogólnym celem tej procedury jest elektrooczyszczanie implantów siatkówki myszy za pomocą fluorescencyjnych reporterów transkrypcyjnych i ilościowe określenie ich poziomów ekspresji. Osiąga się to poprzez najpierw wyizolowanie tkanki siatkówki noworodka myszy poprzez preparację. Drugim etapem zabiegu jest elektroelektryzacja siatkówki za pomocą fluorescencyjnych konstruktów reporterowych DNA.

Trzecim etapem zabiegu jest hodowla elektroporowanych siatkówk w postaci implantów przez osiem dni. Ostatnim etapem procedury jest pobranie eksplanu siatkówki i ilościowe określenie poziomów ekspresji reporterów fluorescencyjnych. Ostatecznie można uzyskać wyniki, które pokazują względne poziomy ekspresji różnych konstruktów reporterowych promotora w rozwijającej się siatkówce myszy poprzez elektroporację x explan, a następnie analizę danych ilościowych.

Nazywam się Joe Corbo i jestem wykładowcą na Wydziale Patologii i Immunologii w Washington University School of Medicine w St. Louis. A dzisiaj zamierzamy zaprezentować protokół wideo demonstrujący technikę elektroporacji X explan w siatkówkach nowonarodzonych myszy w celu ilościowego określenia aktywności elementów regulatorowych CYS specyficznych dla fotoreceptorów i zademonstrowania tego protokołu przez doktorantkę z mojego laboratorium, Cindy Montana. Najpierw wysterylizuj komorę elektroporacyjną i wszystkie narzędzia 70% etanolem w ramach przygotowań do pobrania oczu.

Zdezynfekuj zarówno rękawice, jak i blat stołu etanolem i utrzymuj sterylne warunki przez cały czas trwania zabiegu. Następnie w kapturze do hodowli tkankowej odpipetować sześć mililitrów pożywki preparacyjnej na jedną sterylną 60-milimetrową szalkę Petriego, a trzy mililitry pożywki na dwie sterylne 35-milimetrowe szalki. Wróć do stołu, zdezynfekuj głowę i szyję nowonarodzonego szczeniaka myszy za pomocą 70% etanolu.

Po szybkim odcięciu głowy za pomocą nożyczek przenieś głowę do sterylnego 100 milimetrowego naczynia, odetnij skórę głowy małymi nożyczkami, aby odsłonić oczy pod mikroskopem preparacyjnym. Za pomocą zakrzywionych kleszczy delikatnie wyjmij oko z oczodołu, a następnie umieść oko w 35-milimetrowym naczyniu zawierającym sekcję. Średni. Kontynuuj zbieranie oczu w taki sposób, aby na każdą porcję DNA do elektroporacji przypadało od trzech do czterech oczu, utrzymując oczy i pożywkę separacyjną w temperaturze pokojowej aż do zakończenia.

Zdezynfekuj zarówno żyletkę, jak i opakowanie sterylnej plastikowej pipety transferowej 70% etanolem, a następnie użyj żyletki, aby odciąć końcówkę pipety na tyle wysoko, aby można było odpipetować całe oko. Za pomocą poszerzonej pipety przenieś jedno oko z 35-milimetrowej szalki na 60-milimetrową szalkę pod mikroskopem preparacyjnym z dużą mocą. Użyj cienkich kleszczy, aby usunąć wszelkie tkanki, takie jak mięśnie zewnątrzgałkowe i tłuszcz z powierzchni oka.

Następnie usuń nerw wzrokowy, ściskając go u podstawy. Aby wyizolować siatkówkę, należy zrobić mały otwór w twardówce na rąbku, twardówka i nabłonek barwnikowy siatkówki wydają się błyszczące w stosunku do tkanki siatkówki, która jest matowo szara. Włóż po jednym bolcu z obu par kleszczy do otworu i delikatnie rozerwij twardówkę i RPE.

Pamiętaj, aby pozostawić obiektyw na miejscu. Użyj poszerzonej pipety, aby przenieść wypreparowaną siatkówkę do drugiej 35-milimetrowej płytki zawierającej pożywkę. Zbierz wszystkie siatkówki i przechowuj je w inkubatorze do hodowli tkankowych o temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Do czasu elektroporacji działającej w kapturze do hodowli tkankowych dla każdego DNA Eloqua, które ma być elektroporowane, napełnij jedną sterylną 35-milimetrową pożywkę do preparacji, a drugą pożywką hodowlaną. Za pomocą pipety P 200 umyj komory w naczyniu do elektroporacji sterylnym XPB S3 razy. Napełnij komory 60 mikrolitrowymi porcjami DNA i wypełnij wszelkie nieużywane komory 60 mikrolitrami jednego XPBS.

Podłącz elektrody do naczynia do elektroporacji i wprowadź odpowiednie ustawienia w elektronice. Użyj cienkich kleszczyków, aby chwycić siatkówki za soczewkę i przenieść je do komór elektroporacyjnych. Umieszczenie do czterech siatkówk w każdej komorze.

Ułóż siatkówki tak, aby soczewka opierała się o metalowy pręt przymocowany do elektrody dodatniej. Wytrzyj kleszcze między każdą komorą, aby uniknąć przenoszenia DNA z jednej komory do drugiej. Gdy wszystkie siatkówki zostaną wyrównane, naciśnij start na elektro.

Na metalowym pręcie przymocowanym do elektrody ujemnej powinny tworzyć się drobne pęcherzyki. Odłącz elektrody i wyłącz elektro za pomocą kleszczy. Delikatnie odsuń siatkówki od ścianek komory.

Przenieś siatkówki z komór do 35-milimetrowych szalek zawierających podłoże preparacyjne. Za pomocą sterylnej pipety transferowej przenieś siatkówki z pożywki preparacyjnej na 35-milimetrowe szalki zawierające pożywkę hodowlaną. Oznacz studzienki sterylnej sześciodołkowej płytki hodowlanej i napełnij każdą studzienkę trzema mililitrami kultury. Średni.

Użyj sterylnych kleszczyków, aby unosić okrągłe filtry nukleo watmana na pożywce w każdej studzience, błyszczącą stroną filtrów skierowaną do góry. Za pomocą lunety sekcyjnej przenieś pojedynczą siatkówkę na filtr sterylną soczewką pipety transferowej skierowaną w dół. Jeśli siatkówka wyląduje soczewką do góry, wciągnij ją z powrotem do pipety i spróbuj ponownie.

Umieść nie więcej niż cztery siatkówki w każdej studzience i trzymaj je w osobnych kropelkach. Po umieszczeniu siatkówki w studzienkach przenieś płytkę hodowlaną do inkubatora do hodowli tkankowych o temperaturze 37 stopni Celsjusza i hoduj przez żądany czas. Zwykle po ośmiu dniach obserwuje się udaną elektroporację, która powoduje ekspresję konstruktu DNA na jednej czwartej do jednej trzeciej powierzchni siatkówki.

Poziomy fluorescencji określa się ilościowo poprzez porównanie jednorodnie elektroporowanych regionów wyrażających konstrukt CRE z regionami poza siatkówką, a następnie normalizację w celu kontrolowania ekspresji GFP. W szczególności fotoreceptory pręcików są skutecznie transdukowane. Oto wyniki elektroporacji, w której dwa promotory specyficzne dla pręcików napędzają ekspresję GFP i czerwieni DS w zewnętrznej warstwie jądrowej.

Nakładając na siebie dwa wzorce ekspresji z barwieniem DPI pokazanym tutaj na niebiesko, widoczna jest ekspresja specyficzna dla fotoreceptora. Nie obserwuje się ekspresji ani w warstwie międzyprzezroczystości, ani w warstwie komórek zwojowych. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś mieć dobre pojęcie o tym, jak analizować elektro i hodowlę eksplantatów siatkówki myszy w celu ilościowego określenia aktywności elementów regulatorowych torbieli siatkówki.

Dziękuję za oglądanie i życzę powodzenia w eksperymentach.