Name: Kwantyfikacja aktywności elementów cis-regulatorowych w siatkówce myszy za pomocą elektroporacji eksplantacyjnej. (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-06-28T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 38 s
Description: Poznaj metodę kwantyfikacji aktywności elementów cis-regulatorowych w siatkówce myszy za pomocą elektroporacji eksplantacyjnej. Technika ta umożliwia badanie ekspresji genów w komórkach fotoreceptorów.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Autorzy chcieliby podziękować Karen Lawrence za pomoc przy sekcji opisującej konstrukcję komory do elektroporacji.

<ol><li>Carroll, S. B., Grenier, J. K., Weatherbee, S. D. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCarroll%2C+SB+%22From+DNA+to+diversity+%3A+molecular+genetics+and+the+evolution+of+animal+design%22">From DNA to diversity : molecular genetics and the evolution of animal design</a>. , 2nd edn, Blackwell Pub. (2005).</li>
<li>Davidson, E. H. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDavidson%2C+EH+%22Genomic+regulatory+systems+%3A+development+and+evolution%22">Genomic regulatory systems : development and evolution</a>. , Academic Press. (2001).</li>
<li>Ptashne, M., Gann, A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPtashne%2C+M+%22Genes+%26+signals%22">Genes & signals</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2002).</li>
<li>Blow, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ChIP-Seq+identification+of+weakly+conserved+heart+enhancers%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">ChIP-Seq identification of weakly conserved heart enhancers.</a> Nat Genet. 42, 806-810 (2010).</li>
<li>Visel, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ChIP-seq+accurately+predicts+tissue-specific+activity+of+enhancers%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">ChIP-seq accurately predicts tissue-specific activity of enhancers.</a> Nature. 457, 854-858 (2009).</li>
<li>Matsuda, T., Cepko, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electroporation+and+RNA+interference+in+the+rodent+retina+in+vivo+and+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Electroporation and RNA interference in the rodent retina in vivo and in vitro.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 16-22 (2004).</li>
<li>Matsuda, T., Cepko, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlled+expression+of+transgenes+introduced+by+in+vivo+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Controlled expression of transgenes introduced by in vivo electroporation.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 1027-1032 (2007).</li>
<li>LoTurco, J., Manent, J. B., Sidiqi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+and+improved+tools+for+in+utero+electroporation+studies+of+developing+cerebral+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Cereb+Cortex%22%5BJournal%5D)">New and improved tools for in utero electroporation studies of developing cerebral cortex.</a> Cereb Cortex. 19, 120-125 (2009).</li>
<li>Matsuda, T., Cepko, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+gene+function+in+the+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Analysis of gene function in the retina.</a> Methods Mol Biol. 423, 259-278 (2008).</li>
<li>Lee, J., Myers, C. A., Williams, N., Abdelaziz, M., Corbo, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+fine-tuning+of+photoreceptor+cis-regulatory+elements+through+affinity+modulation+of+transcription+factor+binding+sites%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Quantitative fine-tuning of photoreceptor cis-regulatory elements through affinity modulation of transcription factor binding sites.</a> Gene Ther. 17, 1390-1399 (2010).</li>
<li>Carter-Dawson, L. D., LaVail, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rods+and+cones+in+the+mouse+retina.+II.+Autoradiographic+analysis+of+cell+generation+using+tritiated+thymidine%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Rods and cones in the mouse retina. II. Autoradiographic analysis of cell generation using tritiated thymidine.</a> J Comp Neurol. 188, 263-272 (1979).</li>
<li>Young, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+differentiation+in+the+retina+of+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Anat+Rec%22%5BJournal%5D)">Cell differentiation in the retina of the mouse.</a> Anat Rec. 212, 199-205 (1985).</li>
<li>Corbo, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRX+ChIP-seq+reveals+the+cis-regulatory+architecture+of+mouse+photoreceptors%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">CRX ChIP-seq reveals the cis-regulatory architecture of mouse photoreceptors.</a> Genome Res. 20, 1512-1525 (2010).</li>
<li>Kim, D. S., Matsuda, T., Cepko, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+core+paired-type+and+POU+homeodomain-containing+transcription+factor+program+drives+retinal+bipolar+cell+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">A core paired-type and POU homeodomain-containing transcription factor program drives retinal bipolar cell gene expression.</a> J Neurosci. 28, 7748-7764 (2008).</li>
<li>Karra, D., Dahm, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transfection+techniques+for+neuronal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Transfection techniques for neuronal cells.</a> J Neurosci. 30, 6171-6177 (2010).</li>
<li>Onishi, A., Peng, G. H., Chen, S., Blackshaw, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pias3-dependent+SUMOylation+controls+mammalian+cone+photoreceptor+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Pias3-dependent SUMOylation controls mammalian cone photoreceptor differentiation.</a> Nat Neurosci. 13, 1059-1065 (2010).</li>
</ol>

Nie zadeklarowano konfliktów interesów.

Elektroporacja eksplantów jest prostym sposobem ilościowego określania aktywności elementów cis-regulatorowych w rozwijającej się siatkówce myszy. W porównaniu z analizą cis-regulacyjną za pomocą transgenezy mysiej, elektroporacja jest znacznie tańsza, wymagając jedynie noworodków myszy, DNA, narzędzi sekcyjnych oraz sprzętu do elektroporacji i hodowli tkankowej. Jest ona również znacznie mniej czasochłonna: jeden eksperyment wymaga zaledwie kilku godzin przygotowania, okresu hodowli wynoszącego około ośmiu dni oraz kilku godzin na koniec eksperymentu na obrazowanie i analizę danych. Elektroporacja eksplantów jest ponadto lepsza od analizy cis-regulacyjnej opartej na hodowlach komórkowych, ponieważ wykorzystuje ona rzeczywistą tkankę siatkówki. Siatkówka rozwija się w hodowli eksplantów dość prawidłowo – tworzy trzy wyraźne warstwy komórkowe (warstwę jądrową zewnętrzną, warstwę jądrową wewnętrzną i warstwę komórek zwojowych), choć fotoreceptory nie wykształcają segmentów zewnętrznych.
Kolejną zaletą jest to, że elektroporacja eksplantów jest wysoce powtarzalna. Elektroporacja tych samych konstruktów do różnych siatkówek, nawet w różne dni, zazwyczaj prowadzi do uzyskania tych samych względnych poziomów ekspresji. Ponadto, ponieważ uważa się, że elektroporowane plazmidy są utrzymywane episomalnie w jądrze komórkowym i nie są włączane do chromosomów, nie wydają się one podlegać tym samym efektom miejsca integracji, które utrudniają analizę elementów regulacyjnych cis przeprowadzaną u myszy transgenicznych.
Elektroporacja eksplantatów posiada kilka ograniczeń. Po pierwsze, jedynie komórki znajdujące się w cyklu komórkowym mogą zostać wydajnie transdukowane za pomocą elektroporacji.15W dniu P0 głównymi populacjami komórek objętymi tą metodą są pręciki oraz inne typy komórek siatkówki powstające w późniejszym etapie (komórki bipolarne, komórki amacryne, glej Müllera). Opisano również elektroporację fotoreceptorów czopkowych za pomocą elektroporacji w dniu P0.16 jednak wydajność wydaje się być niska. Drugim ograniczeniem jest fakt, że hodowla eksplantów powyżej dwóch tygodni prowadzi do postępującej deformacji siatkówki, w związku z czym nie jest ona zalecana. Jeśli jednak wymagana jest kwantyfikacja promotora w późniejszych punktach czasowych, to in vivo elektroporacja9 można przeprowadzić, a następnie wykonać dyssekcję siatkówki w wybranym punkcie czasowym, przygotować preparat siatkówki w metodzie flat-mount oraz przeprowadzić kwantyfikację zgodnie z opisem w sekcji 9. Trzecim ograniczeniem jest fakt, że test ten charakteryzuje się jedynie umiarkowaną przepustowością. W przeciwieństwie do testów opartych na kulturach komórkowych, które umożliwiają zbadanie setek konstruktów w jednym doświadczeniu, technika opisana w niniejszym protokole wymaga co najmniej jednej pełnej siatkówki myszy na konstrukt. W związku z tym w ciągu jednego dnia można racjonalnie poddać elektroporacji jedynie kilkanaście konstruktów.
Dodatkowym zastrzeżeniem dotyczącym ilościowego oznaczania aktywności promotora przy użyciu opisanego podejścia jest możliwość wystąpienia zjawiska „przesiąkania” (bleed-through) fluorescencji DsRed do kanału GFP, szczególnie podczas badania bardzo silnych promotorów. Wynika to z faktu, że widmo emisji DsRed częściowo pokrywa się z widmem emisji GFP. Aby uniknąć tego problemu, należy stosować zoptymalizowane filtry emisyjne, które minimalizują nakładanie się widm DsRed i GFP. W przypadku braku dostępu do takich zoptymalizowanych zestawów filtrów innym potencjalnym rozwiązaniem byłoby zastosowanie białka fluorescencyjnego o przesunięciu w stronę barwy niebieskiej (np. BFP lub CFP) zamiast GFP.

<table><tbody><tr><td>Szalka do elektroporacji, Microslide 453</td><td>BTX Technologies</td><td>45-0105</td><td>Patrz sekcja 1 protokołu w celu wprowadzenia modyfikacji</td></tr><tr><td>100% silikonowy klej akwariowy</td><td>Perfecto Manufacturing</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plastikowy statyw na mikroprobówki</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-541</td><td>Używany będzie tylko uchwyt statywu</td></tr><tr><td>Narzędzie Dremel</td><td></td><td></td><td>Do odcięcia uchwytu od plastikowego statywu na probówki</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>11965</td><td></td></tr><tr><td>F12</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>11765</td><td></td></tr><tr><td>L-Glu/pen/strep</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>10378-016</td><td>stężenie 100X</td></tr><tr><td>Insulina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I-6634</td><td>Dla roztworu stokowego 1000X resuspenderować w stężeniu 5mg/ml w 5mM HCl i wysterylizować przez filtr</td></tr><tr><td>FBS</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>26140-079</td><td></td></tr><tr><td>Elektroporator prostokątny ECM 830</td><td>BTX Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Filtry Nuclepore</td><td>Whatman, GE Healthcare</td><td>110606</td><td>25mm, 0.2&amp;#x03BC;m</td></tr><tr><td>Inkubator do hodowli tkankowych</td><td></td><td></td><td>37&amp;#x00B0;C, 5% CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td></tr><tr><td>Szkiełka nakrywkowe nr 1.5</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-544E</td><td>grubość 0.16mm</td></tr><tr><td>Fluorescencyjny mikroskop złożony wyposażony w kamerę</td><td></td><td></td><td>Kamera powinna być monochromatyczna (&lt;em&gt;np.&lt;/em&gt;, kamera ORCA-ER firmy Hamamatsu)</td></tr><tr><td>Zestaw filtrów EGFP/DsRed do mikroskopu złożonego</td><td>Chroma Technology Corp.</td><td>86007</td><td>Ten zestaw filtrów minimalizuje przenikanie sygnału między kanałem czerwonym a zielonym</td></tr><tr><td>Oprogramowanie ImageJ</td><td>National Institutes of Health</td><td></td><td>&lt;a href=&quot;http://rsbweb.nih.gov/ij/">http://rsbweb.nih.gov/ij/&lt;/a&gt;</td></tr></tbody></table>

ilościowe określenie aktywności elementów regulacyjnych cis w siatkówce myszy za pomocą elektroporacji eksplantatu

Quantifying the Activity of cis-Regulatory Elements in the Mouse Retina by Explant Electroporation

Czynniki transkrypcyjne w komórkowych sieciach genowych kontrolują wzorce czasoprzestrzenne oraz poziomy ekspresji swoich genów docelowych poprzez wiązanie się z elementami regulacyjnymi cis (CREs), które są krótkimi (˜300-600 bp) odcinkami genomowego DNA znajdującymi się powyżej (upstream), poniżej (downstream) lub w obrębie intronów kontrolowanych przez nie genów. CREs (t.j. enhancery/promotory) zazwyczaj składają się z wielu zgrupowanych miejsc wiązania zarówno dla aktywatorów, jak i represorów transkrypcji1-3. Służą one jako logiczne integratory sygnałów transkrypcyjnych, generując jednolity wynik w postaci czasoprzestrzennie precyzyjnej i ilościowo dokładnej aktywności promotora. Większość dotychczasowych badań nad regulacją cis u ssaków opierała się na transgenezie u myszy jako metodzie oceny funkcji enhancera CREs4-5. Technika ta jest czasochłonna, kosztowna i ze względu na efekty miejsca insercji w dużej mierze nieilościowa. Z drugiej strony, ilościowe testy funkcji CRE u ssaków opracowano w systemach hodowli tkankowych (np. testy podwójnej lucyferazy), jednak znaczenie tych wyników in vivo jest często niepewne.
Elektroporacja stanowi doskonałą alternatywę dla tradycyjnej transgenezy u myszy, ponieważ umożliwia zarówno spatiotemporalną, jak i ilościową ocenę aktywności regulacyjnej cis w żywej tkance ssaków. Technika ta okazała się szczególnie użyteczna w analizie regulacji cis w ośrodkowym układzie nerwowym, zwłaszcza w korze mózgu i siatkówce6-8. Choć elektroporacja siatkówki myszy, zarówno in vivo, jak i ex vivo, została opracowana i szczegółowo opisana przez Matsudę i Cepko6-7,9, niedawno opracowaliśmy prostą metodę ilościowego pomiaru aktywności specyficznych dla fotoreceptorów elementów CRE w elektroporowanych siatkówkach myszy10. Biorąc pod uwagę, że ilość DNA wprowadzanego do siatkówki drogą elektroporacji może różnić się w zależności od eksperymentu, w każdym badaniu konieczne jest zastosowanie współelektroporowanej „kontroli załadunku”. Pod tym względem technika ta jest bardzo podobna do podwójnego testu lucyferazowego stosowanego do ilościowego pomiaru aktywności promotora w hodowlach komórkowych.
Podczas badania aktywności cis-regulatorowej fotoreceptorów elektroporację zazwyczaj przeprowadza się u noworodków myszy (0. dzień postnatalny, P0), co odpowiada okresowi szczytowej produkcji pręcików11-12. Gdy typy komórek siatkówki stają się postmitotyczne, elektroporacja jest znacznie mniej wydajna. Biorąc pod uwagę wysoką stopę powstawania pręcików u noworodków myszy oraz fakt, że pręciki stanowią ponad 70% komórek w siatkówce dorosłej myszy, większość komórek poddanych elektroporacji w dniu P0 to pręciki. Z tego powodu fotoreceptory pręcikowe są najłatwiejszym do badania typem komórek siatkówki za pomocą elektroporacji. Technika opisana w niniejszym materiale jest przede wszystkim użyteczna do ilościowego określania aktywności elementów CRE fotoreceptorów.

Niniejszy protokół opisuje prostą i niedrogą metodę ilościowego określania aktywności elementów cis-regulatorowych (tj. enhancerów/promotorów) w żywych siatkówkach myszy za pomocą elektroporacji eksplantów. Opisano przygotowanie DNA, wycięcie siatkówki, elektroporację, hodowlę eksplantów siatkówki oraz analizę i kwantyfikację po utrwaleniu.

Ilościowe określenie aktywności elementów regulacyjnych cis w siatkówce myszy za pomocą elektroporacji eksplantatu

Czynniki transkrypcyjne w obrębie komórkowych sieci genów kontrolują czasoprzestrzenny wzorzec oraz poziomy ekspresji swoich genów docelowych poprzez wiązanie się z...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest elektroporacja implantów siatkówki myszy reporterami transkrypcyjnymi fluorescencyjnymi oraz ilościowe określenie poziomu ich ekspresji. Jest to realizowane poprzez wstępne wyizolowanie tkanki siatkówki myszy noworodkowej za pomocą dysekcji. Drugim krokiem procedury jest elektroporacja siatkówki konstruktami reporterowymi DNA fluorescencyjnego.Trzecim krokiem procedury jest hodowla elektroporowanych siatkówek w formie implantów przez osiem dni. Ostatnim krokiem procedury jest pobranie eksplantu siatkówki i ilościowe określenie poziomów ekspresji reporterów fluorescencyjnych. W rezultacie można uzyskać wyniki ukazujące względne poziomy ekspresji różnych konstruktów reporterowych promotorów w rozwijającej się siatkówce myszy poprzez elektroporację eksplantów, a następnie ilościową analizę danych.Nazywam się Joe Corbo i jestem pracownikiem naukowym w Katedrze Patologii i Immunologii w Washington University School of Medicine w St. Louis. Dzisiaj zaprezentujemy protokół wideo demonstrujący technikę elektroporacji ex vivo w siatkówkach noworodków myszy w celu ilościowego oznaczenia aktywności specyficznych dla fotoreceptorów elementów regulacyjnych CYS. Protokół ten zaprezentuje doktorantka z mojego laboratorium, Cindy Montana. W pierwszej kolejności, w przygotowaniu do pobrania gałek ocznych, należy wysterylizować komorę do elektroporacji oraz wszystkie instrumenty za pomocą 70% etanolu.Zdezynfekuj obie rękawiczki oraz blat etanolem i zachowaj warunki sterylne przez cały czas trwania procedury. Następnie, w komorze do hodowli tkankowej, pipetuj 6 mL medium do sekcji do jednej sterylnej szalki Petriego o średnicy 60 mm oraz 3 mL medium do dwóch sterylnych szalek o średnicy 35 mm. Po powrocie do blatu zdezynfekuj głowę i szyję noworodka myszy 70% etanolem.Po szybkim odcięciu głowy za pomocą nożyczek, przenieś ją do sterylnej szalki 100 mm, a następnie za pomocą małych nożyczek odetnij skórę głowy, aby odsłonić oczy pod mikroskopem stereoskopowym. Używając zakrzywionej pęsety, delikatnie wyjmij oko z oczodołu, a następnie umieść je w szalce 35 mm zawierającej medium do sekcji. Kontynuuj pobieranie oczu w taki sposób, aby na każdą alikwot DNA do elektroporacji przypadały trzy do czterech oczu, przechowując oczy i medium do sekcji w temperaturze pokojowej do zakończenia procesu.Zdezynfekować żyletkę oraz opakowanie sterylnej plastikowej pipety transferowej 70% etanolem, a następnie za pomocą żyletki odciąć końcówkę pipety na odpowiedniej wysokości, aby umożliwić pobranie całego oka. Używając poszerzonej pipety, przenieść jedno oko z szalki 35 mm do szalki 60 mm pod dużym powiększeniem mikroskopu stereoskopowego. Za pomocą precyzyjnej pęsety usunąć z powierzchni oka wszelkie tkanki, takie jak mięśnie pozagałkowe i tłuszcz.Następnie usuń nerw wzrokowy, odrywając go poprzez uciśnięcie u podstawy. Aby wyizolować siatkówkę, wykonaj niewielki otwór w twardówce na wysokości limbusa; twardówka oraz nabłonek pigmentowy siatkówki wydają się błyszczące w porównaniu do tkanki siatkówki, która ma matowoszary kolor. Wprowadź po jednym ramieniu z obu par pęset do otworu i ostrożnie rozdarj twardówkę oraz nabłonek pigmentowy siatkówki.Należy pozostawić soczewkę na miejscu. Za pomocą poszerzonej pipety przenieść wypreparowaną siatkówkę do drugiej szalki 35 milimetrowej zawierającej pożywkę. Zebrać wszystkie siatkówki i przechowywać je w inkubatorze do hodowli tkankowych w temperaturze 37°C.Przed rozpoczęciem elektroporacji, pracując w komorze z laminarnym przepływem powietrza do hodowli tkanek, dla każdej porcji DNA przeznaczonej do elektroporacji napełnić jedną sterylną szalkę 35 mm medium do sekcji, a drugą medium hodowlanym. Za pomocą pipety P 200 wypłukać komory w szalce do elektroporacji sterylnym 1X PBS trzy razy. Napełnić komory 60 µl aliquotami DNA, a wszystkie niewykorzystane komory uzupełnić 60 µl 1X PBS.Podłącz elektrody do szalki do elektroporacji i wprowadź odpowiednie ustawienia w elektroporatorze. Za pomocą precyzyjnej pęsety chwyć siatkówki za soczewkę i przenieś je do komór elektroporacyjnych, umieszczając do czterech siatkówek w każdej komorze.Ustaw siatkówki w taki sposób, aby soczewka opierała się o metalowy pręt przymocowany do elektrody dodatniej. Przecieraj pęsetę pomiędzy każdą komorą, aby uniknąć przeniesienia DNA z jednej komory do następnej. Po wyrównaniu wszystkich siatkówek naciśnij przycisk start w elektroforze.Na pręcie metalowym przymocowanym do elektrody ujemnej powinny pojawić się małe pęcherzyki. Odłącz elektrody i za pomocą pęsety wyłącz urządzenie do elektroforezy. Ostrożnie odsuń siatkówki od ścianek komory.Przenieś siatkówki z komór do szalek 35 mm zawierających medium do sekcji. Za pomocą sterylnej pipety transferowej przenieś siatkówki z medium do sekcji do szalek 35 mm zawierających medium hodowlane. Opisz dołki sterylnej płytki hodowlanej z sześcioma dołkami i napełnij każdy dołek 3 ml medium hodowlanego.Za pomocą sterylnej pincety umieść okrągłe filtry Watman Nucleo na powierzchni medium w każdym dołku, tak aby błyszcząca strona filtrów była skierowana do góry. Przy użyciu stereomikroskopu przenieś pojedynczą siatkówkę na filtr za pomocą sterylnej pipety transferowej, kierując stronę soczewki w dół. Jeśli siatkówka spocznie stroną soczewki do góry, wciągnij ją z powrotem do pipety i spróbuj ponownie.W każdej studzience należy umieścić nie więcej niż cztery siatkówki, utrzymując je w osobnych kroplach. Po umieszczeniu siatkówek w studzienkach, przenieś płytkę hodowlaną do inkubatora do hodowli tkankowych ustawionego na 37°C i inkubuj przez pożądany czas. Zazwyczaj ośmiodniowy okres, przedstawiony tutaj, prowadzi do pomyślnej elektroporacji i ekspresji konstruktu DNA na obszarze od jednej czwartej do jednej trzeciej powierzchni siatkówki.Poziomy fluorescencji są ilościowo określane poprzez porównanie jednorodnie elektroporowanych obszarów wykazujących ekspresję konstruktu CRE do obszarów poza siatkówką, a następnie normalizację do kontrolnej ekspresji GFP. Wykazano, że fotoreceptory pręcikowe są szczególnie wydajnie transdukowane. Poniżej przedstawiono wyniki elektroporacji, w której dwa promotory specyficzne dla pręcików sterują ekspresją GFP oraz DS red w zewnętrznej warstwie jądrowej.Poprzez nałożenie dwóch wzorów ekspresji na barwienie DPI przedstawione tutaj na niebiesko, widoczna jest ekspresja specyficzna dla fotoreceptorów. Nie stwierdzono ekspresji ani w warstwie międzyjądrowej, ani w warstwie komórek zwojowych. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo mieć jasne wyobrażenie o tym, jak przeprowadzić sekcję i hodowlę eksplantów siatkówki mysiej w celu ilościowego określenia aktywności elementów regulacyjnych cyst siatkówki.Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w prowadzeniu eksperymentów.

quantifying-activity-cis-regulatory-elements-mouse-retina-explant

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Określenie aktywności elementów cis-regulacyjnych w siatkówce myszy za pomocą elektroporacji eksplantatów

W niniejszej pracy przedstawiamy dwie techniki manipulowania ekspresją genów w komórkach zwojowych siatkówki (RGCs) myszy za pomocą elektroporacji in utero oraz ex vivo. Techniki te pozwalają badać, w jaki sposób zmiany w ekspresji genów wpływają na rozwój RGCs, prowadzenie aksonów oraz właściwości funkcjonalne.

Elektroporacja in utero oraz ex vivo w celu ekspresji genów w komórkach zwojowych siatkówki myszy

Prezentujemy protokół elektroporacji in vivo do transfekcji pojedynczych komórek lub małych skupisk komórek zwojowych siatkówki (RGCs) oraz innych typów komórek siatkówki u myszy postnatalnych w szerokim zakresie wieku. Zdolność do znakowania i genetycznej manipulacji postnatalnymi RGCs in vivo stanowi potężne narzędzie w badaniach nad rozwojem.

Transfekcja komórek zwojowych siatkówki myszy za pomocą elektroporacji in vivo

Przedstawiono metodę wprowadzania plazmidowego DNA do komórek siatkówki myszy w celu przeprowadzenia badań nad przyrostem lub utratą funkcji in vivo. Metoda ta wykorzystuje przejściowy wzrost przepuszczalności błon plazmatycznych komórek wywołany przyłożeniem zewnętrznego pola elektrycznego.

In vivo elektroporacja rozwijającej się siatkówki myszy

Niniejszy artykuł przedstawia rejestrację sygnałów z pojedynczych komórek pochodzących z fluorescencyjnie znakowanych populacji neuronów w nienaruszonej siatkówce myszy. Dzięki zastosowaniu dwufotonowego wzbudzenia w podczerwieni, transgenicznie znakowane komórki zostały wytypowane do rejestracji metodą patch-clamp w celu zbadania ich reakcji na światło, właściwości pól recepcyjnych oraz morfologii.

Charakterystyka elektrofizjologiczna populacji komórek wykazujących ekspresję GFP w nienaruszonej siatkówce

Opisano metodę warunkowego wyciszania ekspresji białka docelowego w siatkówce dorosłego danio-zebry, która polega na dokonywaniu iniekcji domięśniowych morfolino antysensownych oraz ich elektroporacji do siatkówki. W wyniku tego procesu ekspresja białka jest wyciszona przez kilka dni, co umożliwia zbadanie roli tego białka w regenerującej się lub nienaruszonej siatkówce.

In vivo elektroporacja morfolin do siatkówki dorosłego danio pręgowanego

Ogólnym celem tego filmu jest pokazanie, jak przeprowadzić celowaną iniekcję do siatkówki oraz elektroporację konstruktów DNA/RNA in ovo do siatkówki zarodka kurczaka w stadium 22-23 według skali Hamburgera i Hamiltona, co odpowiada około 4. dniu inkubacji (E4). Technika ta jest bardzo użyteczna w badaniu ekspresji genów, regulacji genów oraz zmian morfologicznych w rozwijającej się siatkówce kurczaka.

Elektroporacja in ovo siatkówki zarodka kurczaka

Niniejsza praca opisuje opracowanie techniki elektroporacji in vitro, która umożliwia manipulację ekspresją genów w dolnej części wargi rombowej embrionów w połowie okresu gestacji.

In vitro elektroporacja dolnej wargi rombowej zarodków myszy w połowie okresu gestacji

Hodowle embrionalnych komórek siatkówki kurcząt stanowią cenne narzędzia do badania biologii fotoreceptorów. Opracowaliśmy skuteczną technikę transferu genów opartą na elektroporacji plazmidowej siatkówki ex ovo przed hodowlą. Technika ta znacznie zwiększa wydajność transfekcji w porównaniu z obecnie dostępnymi protokołami, dzięki czemu manipulacja genetyczna jest możliwa dla tego systemu.

Efektywny transfer genów w siatkówkach piskląt w badaniach pierwotnych hodowli komórkowych: podejście do elektroporacji ex-ovo

Ten protokół opisuje metodę preparowania, eksperymentalnego manipulowania i hodowli całych eksplantatów siatkówki z zarodków kurczaka. Kultury eksplantatów są przydatne, gdy potrzebny jest wysoki wskaźnik sukcesu, skuteczność i odtwarzalność w celu przetestowania wpływu plazmidów na elektroporację i/lub substancje odczynnikowe, tj. inhibitory enzymatyczne.

Całe eksplantaty siatkówki z zarodków kurczaka do elektroporacji i zabiegów odczynnikami chemicznymi

Demonstrujemy metodę szczepienia hodowanych komórek w określone miejsca wczesnych embrionów myszy, aby określić ich potencjał in vivo. Wprowadzamy również zoptymalizowaną metodę elektroporacji, która wykorzystuje szklane naczynia włosowate o znanej średnicy, co pozwala na precyzyjne dostarczenie egzogennego DNA do kilku komórek w zarodkach.

Metody precyzyjnie zlokalizowanego transferu komórek lub DNA do wczesnych zarodków myszy po implantacji

Opracowaliśmy nowatorskie podejście do utraty funkcji, które polega na wprowadzeniu i genomowej integracji sztucznych sekwencji mikro-RNA w zarodkach piskląt za pomocą elektroporacji in ovo i systemu transpozonów Tol2. Technika ta zapewnia solidną i stabilną metodologię knockdownu genów do badań funkcji genów podczas rozwoju.

Podejście do utraty funkcji w embrionalnej siatkówce pisklęcia przy użyciu transgenicznej ekspresji sztucznych mikroRNA za pośrednictwem transpozonu Tol2

Poznaj metodę kwantyfikacji aktywności elementów cis-regulatorowych w siatkówce myszy za pomocą elektroporacji eksplantacyjnej. Technika ta umożliwia badanie ekspresji genów w komórkach fotoreceptorów.

Ilościowe określenie aktywności elementów regulacyjnych cis w siatkówce myszy za pomocą elektroporacji eksplantatu

Przeglądaj więcej filmów