Name: Inżynieria białkowa za pomocą wyświetlacza powierzchni drożdży (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-11-29T13:40:00.000+00:00
Duration: 5 min 49 s
Description: Poznaj inżynierię białkową z wykorzystaniem wyświetlacza powierzchni drożdży do selekcji wariantów wiążących antygeny. Ta metoda umożliwia precyzyjną kontrolę warunków sortowania cytometrycznego i wizualizację bibliotek białkowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez Austriacki Fundusz Naukowy (FWF Project W1224 - Doctoral Program on Biomolecular Technology of Proteins - BioToP and FWF Project ESP 465-B), Federalne Ministerstwo Cyfryzacji i Gospodarki Austrii, Narodową Fundację Badań, Technologii i Rozwoju Austrii do Christian Doppler Research Association (Christian Doppler Laboratory for Next Generation CAR T Cells), oraz poprzez prywatne darowizny na rzecz Instytutu Badań nad Rakiem Dziecięcym im. św. Anny (Wiedeń, Austria). E.S. jest stypendystką Austriackiej Akademii Nauk w Instytucie Badań nad Rakiem Dziecięcym im. św. Anny. Figury zostały stworzone przy użyciu BioRender.com.

Optimizing Protein Functions Through Yeast Surface Display Techniques

M.W.T. otrzymuje dofinansowanie od Miltenyi Biotec. Wszyscy autorzy są wynalazcami w zgłoszeniach patentowych dotyczących technologii i zmodyfikowanych białek, które zostały opracowane przy użyciu wyświetlacza powierzchni drożdży.

Wyświetlanie powierzchni drożdży ewoluowało jako jedna z kluczowych metod stosowanych w inżynierii białek. Chociaż jest powszechnie stosowany do inżynierii powinowactwa 1,18,40,41, ekspresji/stabilności 24,27,42,43 i aktywności28,44, dalsze zastosowania, takie jak mapowanie epitopów45,46 lub charakterystyka poszczególnych mutantów na powierzchni komórek drożdży9 są również możliwe. W tym protokole przedstawiamy podstawowe kroki do rozpoczęcia kampanii wyboru powierzchni drożdży, w tym selekcję za pomocą kulek magnetycznych i sortowania metodą cytometrii przepływowej, a także dywersyfikację biblioteki drożdży przez epPCR w celu dojrzewania powinowactwa.
Jednym z podstawowych wymagań przy konwencjonalnym wyborze powierzchni drożdży jest dostępność rozpuszczalnego białka o odpowiedniej jakości. Rozpoczęcie od dobrze sfałdowanego białka docelowego o wysokiej czystości i określonym stanie oligomeryzacji (tj. białko monomeryczne powinno być obecne tylko jako monomer) zapewnia najwyższy wskaźnik sukcesu w selekcji wariantu białka wiążącego się z docelowym antygenem o wysokim powinowactwie. Alternatywą dla trudnych do ekspresji białek docelowych jest selekcja komórkowa, która stanowi rozsądną strategię obejścia tego ograniczenia47. Wyświetlanie powierzchni drożdży ma jednak wiele zalet, takich jak możliwość charakteryzowania otrzymanych wariantów białek bezpośrednio na powierzchni drożdży bez konieczności wykonywania pracochłonnego i czasochłonnego klonowania, ekspresji w postaci rozpuszczalnej i oczyszczania białka. Zarówno powinowactwo, jak i stabilność wariantów można analizować bezpośrednio na powierzchni drożdży9. 
W tym protokole pokazujemy, w jaki sposób biblioteka wariantów białek G4, a dokładniej 10.domeny typu III ludzkiej fibronektyny, została wybrana do wiązania się z antygenem hRBP4 w obecności małej cząsteczki A1120. Połączenie selekcji kulek i sortowania metodą cytometrii przepływowej dało wzbogacenie wariantów, które wykazały zwiększone wiązanie z docelowym antygenem podczas rund selekcyjnych (Figura 2B). Wykazaliśmy, że zastosowanie niższych stężeń antygenu umożliwia selekcję wariantów białka o wysokim powinowactwie (ryc. 2C). Zazwyczaj powinowactwo, które można osiągnąć za pomocą selekcji drożdży, mieści się w zakresie nanomolowym lub nawet pikomolarnym18. Końcowe powinowactwo zależy od docelowego antygenu, liczby rund selekcyjnych i dojrzewania powinowactwa, użytego rusztowania wiążącego i zastosowanej strategii bramkowania. Charakterystyka poszczególnych wariantów białek nie jest objęta tym protokołem, ale została szczegółowo wyjaśniona w naszej poprzedniej pracy9. Chociaż wyświetlanie drożdży było pierwotnie stosowane do inżynierii fragmentów przeciwciał, takich jak scFvs 1,40, metoda ta jest szeroko stosowana również w przypadku białek nieopartych na przeciwciałach10.
Podsumowując, wyświetlanie powierzchni drożdży jest potężnym narzędziem inżynierii białkowej, które umożliwia generowanie wariantów białek o nowych lub ulepszonych właściwościach, takich jak wiązanie się z prawie każdym białkiem docelowym i/lub zwiększona stabilność.

Ekspozycja na powierzchni drożdży (yeast surface display) jest jedną z kluczowych technologii w dziedzinie inżynierii białek. Umożliwia ona selekcję wariantów białek o pożądanych właściwościach, takich jak poprawione powinowactwo lub stabilność. Po raz pierwszy wprowadzona w 1997 roku1, jest jedną z najczęściej stosowanych technologii ekspozycji, obok ekspozycji fagowej2,3, ekspozycji rybosomalnej4 oraz ekspozycji na komórkach ssaków5,6,7. Białko docelowe (POI) jest eksponowane na powierzchni komórek drożdży poprzez połączenie go z białkami kotwiczącymi. Dostępny jest szereg różnych białek kotwiczących, a najczęściej POI jest łączone z końcem C białka Agn2p, będącego białkiem sprzęgającym aglutyniny drożdżowej1,8. Ponadto POI jest zazwyczaj flankowane przez dwa znaczniki, takie jak znacznik hemaglutyniny (HA-tag) i znacznik c-myc, co umożliwia detekcję poziomu ekspozycji przy użyciu przeciwciał znakowanych fluorescencyjnie i cytometrii przepływowej (Rycina 1A). Typowe kampanie selekcji drożdży obejmują kombinację selekcji za pomocą kulek magnetycznych i sortowania cytometrycznego. Selekcje na kuleczkach umożliwiają przetwarzanie dużej liczby komórek i wzbogacanie wariantów białek wiążących antygen docelowy, także tych o niskim powinowactwie, ponieważ wielowartościowe oddziaływania z kuleczkami obciążonymi antygenem prowadzą do efektów awidności i tym samym zapobiegają utracie wariantów o niskim powinowactwie (Rycina 1B). Analiza i selekcja metodą cytometrii przepływowej dają korzyść w postaci wizualizacji wiązania eksponowanych wariantów POI z znakowanym antygenem. W konsekwencji populacje wiążące mogą być sortowane i hodowane, co prowadzi do wzbogacenia wariantów białek o pożądanych właściwościach w ciągu kilku rund sortowania. Ponadto można przeprowadzić dodatkowe rundy randomowej mutagenezy, aby dalej zwiększyć różnorodność, a tym samym prawdopodobieństwo znalezienia dodatkowych mutacji przyczyniających się do powinowactwa i/lub stabilności białka.
Prezentacja białek na powierzchni drożdży (yeast surface display) oferuje pewne zalety, takie jak (a) eukariotyczny aparat ekspresyjny, umożliwiający oksydacyjne fałdowanie białek oraz eukariotyczne modyfikacje posttranslacyjne (np. N-glikozylację), (b) normalizację ekspresji dzięki detekcji dwóch znaczników peptydowych flankujących białko, (c) wizualną inspekcję postępów selekcji za pomocą cytometrii przepływowej (np. procent wiążących komórek i intensywność wiązania) oraz (d) możliwość analizy poszczególnych mutantów białek na drożdżach (np. analizy termostabilności oraz powinowactwa), co stanowi oszczędzającą czas alternatywę dla żmudnej ekspresji i oczyszczania białek9. W rzeczywistości zarówno powinowactwa (wartości KD), jak i stabilności (wartości T50) białek prezentowanych na powierzchni drożdży wykazały dobre korelacje z danymi uzyskanymi za pomocą metod biofizycznych i rozpuszczalnych białek9,10,11,12. Prezentacja na powierzchni drożdży była wykorzystywana do inżynierii różnorodnych białek, np. fragmentów przeciwciał13,14,15,16, 10tej domeny III fibronektyny17,18, rcSso7d19,20 lub knottinów21. Podobnie, podjęto szeroko zakrojone badania nad optymalizacją projektów bibliotek drożdżowych poprzez zmianę pozycji randomizowanych oraz wykorzystania kodonów aminokwasowych17,22,23. Prezentacja na powierzchni drożdży okazała się skuteczna w inżynierii stabilności14,15,24,25, powinowactwa18,26,27, aktywności enzymatycznej28,29,30,31 oraz ekspresji białek32. Dodatkowo, za pomocą prezentacji na powierzchni drożdży zrealizowano bardziej zaawansowane zastosowania, takie jak wiązanie warunkowe w obecności lub przy braku małej cząsteczki20.
W niniejszym protokole opisujemy wszystkie kluczowe etapy kampanii selekcyjnej z wykorzystaniem ekspozycji powierzchniowej drożdży na przykładzie biblioteki G4 (opartej na 10th domena III fibronektyny (Fn3) wyselekcjonowana przeciwko antygenowi ludzkiej białku wiążącej retinol 4 (hRBP4) w obecności małej cząsteczki A112020Selekcję tę przeprowadzono w celu uzyskania oddziaływania białko-białko zależnego od małej cząsteczki, która może służyć jako przełącznik molekularny. Warto zauważyć, że choć przy zastosowaniu ekspozycji powierzchniowej drożdży możliwe są alternatywne podejścia, typowe selekcje drożdżowe zazwyczaj mają na celu uzyskanie wiązania z antygenem docelowym bez wcześniejszego powinowactwa wiązania. Opisujemy wszystkie etapy kampanii selekcji drożdżowej, obejmujące hodowlę biblioteki drożdży, selekcje na kuleczkach, sortowanie cytometryczne oraz dojrzewanie powinowactwa za pomocą PCR podatnego na błędy (epPCR). Niniejszy protokół stanowi zatem uzupełnienie wcześniejszych protokołów dotyczących ekspozycji powierzchniowej drożdży.33,34 i może służyć jako podstawa do selekcji w metodzie prezentacji na powierzchni drożdży (Rycina 1z dowolną wybraną biblioteką drożdżową i dowolnym antygenem docelowym.
<img alt="Schemat ekspozycji drożdżowej z blokowym przedstawieniem dojrzewania powinowactwa dla przesiewania i wzbogacania biblioteki białek." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66994/66994fig1v5.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Zasada ekspozycji powierzchniowej drożdży oraz typowy przebieg selekcji w systemie ekspozycji powierzchniowej drożdży. (A) POI jest klonowane do wektora do ekspozycji powierzchniowej drożdży i zazwyczaj flankowane N-końcowym znacznikiem HA oraz C-końcowym znacznikiem c-myc. Konstrukt jest fuzowany z białkiem kojarzenia drożdżowego Aga2p w celu ekspozycji na powierzchni. Przedstawione białko to zmodyfikowany ligand „RS3” z PDB ID: 6QBA20. (B) Schemat blokowy ilustrujący typowy przebieg kampanii selekcyjnych w systemie ekspozycji powierzchniowej drożdży, które łączą wzbogacanie wariantów białek o pożądanych właściwościach poprzez selekcję na kuleczkach i sortowanie cytometryczne, a także epPCR w celu dojrzewania powinowactwa. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66994/66994fig1largev5.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.</a>

<table><tbody><tr><td>10-beta elektrokompetentna E. coli&nbsp;</td><td>NEB</td><td>C3020K</td><td></td></tr><tr><td>Agar-Agar, Kobe I</td><td>Carl Roth</td><td>5210.5</td><td></td></tr><tr><td>Sól sodowa ampicyliny</td><td>Carl Roth</td><td>K029.2</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-c-myc, klon 9E10, AF488</td><td>Invitrogen</td><td>MA1-980-A488 (Thermo Fisher)</td><td></td></tr> <tr><td>Przeciwciało anty-c-myc, klon 9E10, AF647</td><td>Invitrogen</td><td>MA1-980-A647 (Thermo Fisher)</td><td></td></tr> <tr><td>Przeciwciało anty-HA, klon 16B12, AF488</td><td>BioLegend</td><td>901509 (Biozym)Przeciwciało</td><td></td></tr> <tr><td>anty-HA, klon 16B12, AF647</td><td>BioLegend</td><td>682404 (Biozym)</td><td></td></tr><tr><td>BamHI-HF</td><td>NEB</td><td>R3136S Albumina</td><td></td></tr><tr><td>surowicy bydlęcej, zimna frakcja etanolowa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4503</td><td></td></tr><tr><td>Monohydrat kwasu cytrynowego</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1909</td><td></td></tr><tr><td>D-Galaktoza</td><td>Carl Roth</td><td>4987.2</td><td></td></tr><tr><td>D-Glucose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>Drożdże Difco baza azotowa</td><td>Becton Dickinson (BD)&nbsp;</td><td>291940</td><td></td></tr><tr><td>Wodorofosforan di-sodowy siedmiowodny</td><td>Carl Roth</td><td>X987.3</td><td></td></tr><tr><td>DL-Dithiothreitol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D0632</td><td></td></tr><tr><td>D-Sorbitol</td><td>Carl Roth</td><td>6213.1</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s sól fizjologiczna buforowana fosforanami (10x)</td><td>Thermo Scientific</td><td>14190169</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads Biotyna Binder</td><td>Invitrogen</td><td>11047 (Fisher Scientific)</td><td></td></tr><tr><td>Magnes DynaMag-2</td><td>Thermo Fisher</td><td>12321D</td><td></td></tr><tr><td>EBY100</td><td>ATCC</td><td>MYA-4941</td><td></td></tr><tr><td>Kuweta do elektroporacji 1 mm (do E.coli)</td><td>VWR</td><td>732-1135</td><td></td></tr><tr><td>Kuweta elektroporacyjna 2 mm (do drożdży)</td><td>VWR</td><td>732-1136</td><td></td></tr><tr><td>Absolutny etanol</td><td>MERCK</td><td>1070172511</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do mutagenezy losowej GeneMorph II</td><td>Agilent Technologies</td><td>200550</td><td></td></tr><tr><td>Gibco Bacto Casamino Acids</td><td>Becton Dickinson (BD)</td><td>223120</td><td></td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>AppliChem</td><td>131339.1211</td><td></td></tr><tr><td>LE agaroza& nbsp;</td><td>Biozym</td><td>840004</td><td></td></tr><tr><td>Octan litu dwuwodny</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L4158</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do ekstrakcji żelem DNA Monarch</td><td>NEB</td><td>T1020S</td><td></td></tr><tr><td>Monarch PCR & Zestaw do oczyszczania DNA</td><td>NEB</td><td>T1030S</td><td></td></tr><tr><td>Multifuge 1S-R</td><td>Heraeus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NheI-HF</td><td>NEB</td><td>R3131S</td><td></td></tr><tr><td>Pożywka wzrostowa</td><td>NEB</td><td>B9035S</td><td></td></tr><tr><td>pCTCON2</td><td>Addgene</td><td>#41843</td><td></td></tr><tr><td>Sól sodowa penicyliny G</td><td>Przeciwciało Sigma-Aldrich</td><td>P3032</td><td></td></tr><tr><td>Penta-He, AF488</td><td>Qiagen</td><td>35310</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało Penta-His, AF647</td><td>Qiagen</td><td>35370</td><td></td></tr><tr><td>Pepton ex kazeina trawiona tryptycznie</td><td>Carl Roth</td><td>8986.3</td><td></td></tr><tr><td>Q5 Polimeraza DNA o wysokiej wierności&nbsp;</td><td>NEB</td><td>M0491S</td><td></td></tr><tr><td>SaII-HF</td><td>NEB</td><td>R3138S</td><td></td></tr><tr><td>Octan sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8750-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek sodu</td><td>Carl Roth</td><td>3957.2</td><td></td></tr><tr><td>Diwodorofosforan sodu jednowodny</td><td>Carl Roth</td><td>K300.2</td><td></td></tr><tr><td>Filtr butelkowy z gwintem Steritop</td><td>MERCK</td><td>S2GPT01RE</td><td></td></tr><tr><td>Streptawidyna, AF488</td><td>Invitrogen</td><td>S32354 (Thermo Fisher)</td><td></td></tr><tr><td>Streptawidyna, AF647</td><td>Invitrogen</td><td>S32357 (Thermo Fisher)</td><td></td></tr><tr><td>Siarczan streptomycyny</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6501</td><td></td></tr><tr><td>Cytrynian tri-sodu dwuwodny</td><td>Carl Roth</td><td>4088.1</td><td></td></tr><tr><td>Spektrofotometr UV-Vis</td><td>Agilent</td><td>8453</td><td></td></tr><tr><td>Ekstrakt drożdżowy, mikrogranulat</td><td>Carl Roth</td><td>2904.4</td><td></td></tr><tr><td>Zymoprep Plazmid drożdżowy Miniprep II</td><td>Zymo Research</td><td>D2004&nbsp;</td><td></td></tr></tbody></table>

inżynieria białkowa za pomocą wyświetlacza powierzchni drożdży

Protein Engineering by Yeast Surface Display

Inżynieria białkowa umożliwia poprawę istniejących funkcji danego białka lub generowanie nowych funkcji. Jednym z najczęściej stosowanych i wszechstronnych narzędzi w dziedzinie inżynierii białek jest wyświetlanie powierzchni drożdży, w którym pula losowych białek ulega ekspresji na powierzchni drożdży. Powiązanie fenotypu (np. wiązania białka wyświetlanego przez drożdże z antygenem będącym przedmiotem zainteresowania) i genotypu (kodowania plazmidu dla wariantu białka) umożliwia wybór tej biblioteki pod kątem pożądanych właściwości i późniejsze sekwencjonowanie wzbogaconych wariantów. Łącząc selekcję kulek magnetycznych z sortowaniem metodą cytometrii przepływowej, można wybrać i wzbogacić warianty białek o zwiększonym wiązaniu z docelowym antygenem. Warto zauważyć, że oprócz dojrzewania powinowactwa, wiązanie z celem można również osiągnąć bez żadnego początkowego powinowactwa wiązania. W tym miejscu przedstawiamy protokół krok po kroku, który obejmuje wszystkie istotne elementy kampanii wyboru ekspozycji powierzchni drożdży i podaje przykłady typowych wyników ekspozycji powierzchni drożdży. Pokazujemy, że wyświetlanie powierzchni drożdży jest szeroko stosowaną i solidną metodą, którą można ustalić w każdym laboratorium biologii molekularnej z dostępem do cytometrii przepływowej.

Bibliotekę G4 wyselekcjonowano przeciwko antygenowi hRBP4 związanemu z małocząsteczkowym lekiem A1120. Barwienie bibliotek do sortowania cytometrycznego przeprowadzono zgodnie z opisem w Metodzie 6, a zastosowaną strategię bramkowania przedstawiono na Rysunku 2A. Pierwsza brama obejmowała wszystkie komórki na podstawie ich morfologii, a druga brama (histogram szerokości FSC) wykazała rygorystyczną strategię bramkowania zastosowaną w celu wyselekcjonowania pojedynczych komórek i usunięcia agregatów komórkowych. Trzecia i ostatnia brama przedstawiała ekspresję wariantów białkowych (oś x) w stosunku do wiązania antygenu (oś y). Sortowano komórki drożdży wykazujące zarówno sygnał ekspresji, jak i wiązania. Co istotne, brama sortowania została ustawiona w sposób rygorystyczny, aby wzbogacić domeny wiążące o silny sygnał wiązania, a tym samym wysokim powinowactwie. Ta rygorystyczna selekcja doprowadziła do wzbogacenia populacji ekspresyjnych komórek drożdży specyficznie wiążących docelowy antygen w trakcie całego procesu selekcji (Rysunek 2B). W późniejszych rundach sortowania cytometrycznego stężenie antygenu zmniejszono 10-krotnie (ze 100 nM do 10 nM). W konsekwencji całkowity sygnał wiązania uległ zmniejszeniu, a wykrywalne i sortowane były nadal jedynie białka wiążące o wysokim powinowactwie (Rysunek 2C).
<img alt="Schemat bramkowania cytometrii przepływowej dla sortowania komórek; przedstawia poziomy FSC, SSC oraz wiązania antygenu." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66994/66994fig2v5.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2: Reprezentatywne wyniki selekcji biblioteki G4 opartej na Fn3 z wykorzystaniem ekspozycji powierzchniowej drożdży w celu wiązania antygenu (hRBP4 w obecności A1120). (A) Ogólna strategia bramkowania dla sortowania bibliotek drożdżowych. Pierwsza brama (FSC vs. SSC) służy do wyboru wszystkich komórek drożdży i wykluczenia zdarzeń rozproszenia; druga brama (histogram FSC-W) ma na celu usunięcie agregatów komórkowych i wybór wyłącznie pojedynczych komórek drożdży. Trzecia brama przedstawia poziom ekspozycji powierzchniowej (detekcja znacznika HA lub c-myc) w stosunku do wiązania antygenu (tutaj hRBP4 w obecności 5 µM A1120, wykrywanego za pomocą przeciwciał anty-His). Bibliotekę barwiono dodatkowo wyłącznie przeciwciałami wtórnymi (bez antygenu), gdzie nie oczekuje się wiązania antygenu. Posortowane komórki zaznaczono kolorem niebieskim. (B) Ewolucja biblioteki G4 w ciągu 3 rund sortowania cytometrycznego. W każdej rundzie selekcji można zaobserwować wzbogacenie populacji wiążącej. (C) Zastosowanie niższych stężeń antygenu umożliwia selekcję wariantów białkowych o wyższym powinowactwie do docelowego antygenu. Po 10-krotnym zmniejszeniu stężenia antygenu (tutaj hRBP4) pojawiają się inne przekątne, co wskazuje na obecność klonów o wyższym (posortowane komórki, kolor niebieski) lub niższym powinowactwie. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66994/66994fig2largev5.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>

Ten protokół opisuje podstawowe kroki do przeprowadzenia kampanii selekcji powierzchni drożdży w celu wzbogacenia wariantów białek wiążących się z interesującym nas antygenem.

Inżynieria białkowa za pomocą wyświetlacza powierzchni drożdży

Protein engineering enables the improvement of existing functions of a given protein or the generation of novel functions. One of the most widely used and ...

W moim laboratorium opracowujemy terapie komórkowe nowej generacji, łącząc inżynierię białkową z inżynierią komórkową. Projektujemy więc składniki białek, aby uzyskać nowe funkcje lub ulepszyć istniejące, a następnie włączamy te białka zerowe do terapii komórkowych. Rozwinęliśmy również wyświetlacz powierzchniowy do specjalistycznych zastosowań, w tym inżynierii stabilności białek, inżynierii przełączników białek regulowanych małymi cząsteczkami oraz specyficznego ukierunkowania na potwierdzenia aktywowanych receptorów związanych z rakiem.Zaletą wyświetlania powierzchni drożdży w porównaniu z innymi technologiami wyświetlania, takimi jak wyświetlanie fagów lub rybosomów, jest wizualizacja biblioteki metodą cytometrii przepływowej podczas procesu sortowania oraz precyzyjna kontrola warunków selekcji, takich jak stężenie antygenu i rygorystyczność bramki sortującej. Na początek przygotuj koraliki do pierwszej selekcji koralików, ponownie zawieszając 10 mikrolitrów kulek magnetycznych ze spoiwem biotynowym w 990 mikrolitrach PBSA. Do mycia umieść rurkę na stojaku magnetycznym na dwie minuty przy otwartej pokrywie.Następnie ostrożnie usuń supernatant. Ponownie zawiesić umyte kulki w 1,5 mililitrowej mikroprobówce wirówkowej w jednym mililitrze PBSA z 6,7 do 33 pikomolami biotynylowanego antygenu. Po inkubacji umieść probówkę na stojaku magnetycznym na dwie minuty z otwartą pokrywą, usuń supernatant i umyj kulki naładowane antygenem jednym mililitrem PBSA.Gdy kulki osiądą, usuń PBSA. Następnie ponownie zawiesić kulki załadowane antygenem w 50 mikrolitrach PBSA. Przygotuj komórki, kulki antygenowe i roztwór koralików niedźwiedzia do selekcji negatywnej.Po umyciu ponownie zawiesić kulki antygenowe w 50 mikrolitrach PBSA i ponownie zawiesić koraliki niedźwiedzia w 150 mikrolitrach PBSA. W przypadku pierwszej selekcji negatywnej dodaj 50 mikrolitrów umytych gołych kulek do 950 mikrolitrów umytych komórek w PBSA i inkubuj mieszaninę przez 1,5 godziny w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Po inkubacji umieścić probówki zawierające zawiesiny komórek kulki niedźwiedzia na stojaku magnetycznym z otwartą pokrywą.Odpipetuj płyn z pokrywki do probówki i odczekaj dwie minuty. Następnie przenieś niezwiązane komórki do świeżej mikroprobówki wirówkowej i dodaj 50 mikrolitrów umytych koralików niedźwiedzich. Po trzech rundach selekcji negatywnej dodaj do komórek 50 mikrolitrów roztworu kulek obciążonego antygenem.Inkubować przez dwie godziny w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Teraz umieść komórki zawierające koraliki załadowane antygenem na stojaku magnetycznym z otwartą pokrywą. Odpipetuj każdy płyn znajdujący się w pokrywce do probówki.Odczekaj dwie minuty przed odrzuceniem niezwiązanych komórek. Wykonaj wszystkie pozostałe kroki zgodnie z opisem dla pierwszego wyboru kulki antygenu. Po trzech negatywnych i jednej pozytywnej selekcji, szybko ponownie zawieś komórki w jednym mililitrze SDCAA i przenieś do kolby zawierającej większą objętość SDCAA.Po całonocnej indukcji ekspresji powierzchniowej białek w SGCAA w bibliotekach drożdży, osadzaj wystarczającą ilość komórek, aby pokryć 10-krotność różnorodności i odrzuć supernatant. Ponownie zawiesić osad w PBSA i przenieść go do mikroprobówek wirówkowych. Użyj 30 milionów komórek do barwienia w każdej probówce.Przygotuj tyle probówek, ile jest to wymagane w oparciu o różnorodność, w tym jedną probówkę kontrolną bez antygenu. Następnie odwirować probówki o sile 2000 x g przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Zawiesić osad w 200 mikrolitrach PBSA zawierającego antygen i inkubować przez godzinę w temperaturze czterech stopni Celsjusza.Po ponownym odwirowaniu usunąć PBSA z osadu. Następnie ponownie zawieś komórki w 100 mikrolitrach zimnego PBSA zawierającego przeciwciała w celu barwienia wyświetlacza i wykrywania antygenu. Inkubować przez 30 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.Po inkubacji odwirować komórki w temperaturze 2000 x g przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Dodaj jeden mililitr PBSA do granulki i powtórz wirowanie. Następnie usuń większość supernatantu, pozostawiając tylko 20 do 30 mikrolitrów, aby zapobiec wysychaniu granulek.Ponownie zawiesić granulat w zimnym PBSA tuż przed sortowaniem. Teraz posortuj komórki bezpośrednio na nośniku SDCAA. Po sortowaniu przenieść komórki do kolby wibracyjnej zawierającej większą objętość pożywki SDCAA i inkubować w temperaturze 30 stopni Celsjusza z wytrząsaniem z prędkością 180 obr./min.

protein-engineering-by-yeast-surface-display

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Przedstawiamy szczegółowy protokół do konstruowania i sprawdzania bibliotek mutantów dla kampanii ukierunkowanej ewolucji u Saccharomyces cerevisiae.

Metoda ukierunkowanej ewolucji u Saccharomyces cerevisiae: tworzenie i badanie przesiewowe biblioteki mutantów

Tutaj wprowadzamy protokół do używania substratów z powierzchni drożdży do testów modyfikacji enzymatycznej. Platformę zademonstrowano, wykorzystując analizę aktywności defosforylacji fosfatazy tyrozynowej SHP-2 w stosunku do jednego z jej substratów jako reprezentatywny test modyfikacji enzymatycznej.

Modyfikacja enzymatyczna i cytometria przepływowa oceny białek powierzchniowych drożdży

Opracowaliśmy zdecelularyzowaną macierz zewnątrzkomórkową płuca oraz nowatorski bioreaktor biomimetyczny, które mogą być wykorzystywane do generowania funkcjonalnej tkanki płucnej. Poprzez zasiewanie komórek do macierzy i ich hodowlę w bioreaktorze, otrzymujemy tkankę wykazującą efektywną wymianę gazową po krótkotrwałym przeszczepieniu in vivo.

Procedura inżynierii płuc

Opisujemy metodę pomiaru energii wiązania, wyrażonej jako napięcie powierzchniowe tkanki, pomiędzy komórkami wewnątrz trójwymiarowych agregatów przypominających tkankę. Wykazano, że różnice w napięciu powierzchniowym tkanki korelują z inwazyjnością nowotworów płuc, mięśni i mózgu oraz są fundamentalnymi czynnikami determinującymi ustanawianie relacji przestrzennych między różnymi typami komórek.

Pomiar kohezji agregatów metodą tensjometrii powierzchni tkanek

Opracowano wszechstronną technikę litografii plazmowej do tworzenia stabilnych wzorów powierzchniowych służących do kierowania adhezją komórkową. Technika ta może być stosowana do tworzenia sieci komórkowych, w tym takich, które naśladują naturalne tkanki, i była wykorzystywana do badania kilku odrębnych typów komórek.

Wzornictwo powierzchni metodą litografii plazmowej do tworzenia sieci komórkowych

Opisano projekt syntetycznego operonu kodującego zarówno aparat sekrecyjny, jak i monomery strukturalne włókien curli. Nadprodukcja tych amyloidów i polimerów adhezyjnych pozwala na mierzalny wzrost adhezji chassis E. coli1. Wyjaśniono proste sposoby wizualizacji i kwantyfikacji adhezji.

Inżynieria bakterii adherentnych poprzez stworzenie pojedynczego syntetycznego operonu curli

Biokompatybilne nanoczujniki zol-żel reagujące na pH mogą być wbudowane w elektrowirowane rusztowania z poli(kwasu mlekowo-ko-glikolowego) (PLGA). Wyprodukowane rusztowania samoraportujące mogą być wykorzystywane do monitorowania warunków mikrośrodowiskowych in situ podczas hodowli komórek na rusztowaniu. Jest to korzystne, ponieważ konstrukt komórkowy 3D może być monitorowany w czasie rzeczywistym bez zakłócania eksperymentu.

Rusztowania samoraportujące do trójwymiarowej hodowli komórkowej

Opisano metodę otrzymywania nanowłókien i złożonych nanostruktur z pojedynczych lub wielu białek macierzy zewnątrzkomórkowej. Metoda ta wykorzystuje interakcje białko-powierzchnia do tworzenia wolnostojących materiałów na bazie białek o przestrajalnym składzie i architekturze do wykorzystania w różnych zastosowaniach inżynierii tkankowej i biotechnologii.

Nanowłókna i nanostruktury białkowe ECM zaprojektowane przy użyciu montażu inicjowanego powierzchniowo

Tutaj prezentujemy protokół wyjaśniający użycie mikroskopii siły sondy Kelvina jako narzędzia do generowania wysokiej rozdzielczości nanoskalowych map potencjału powierzchniowego. Narzędzie to zastosowano do oceny wpływu potencjału powierzchniowego na zdolność wiązania mikroorganizmów z powierzchniami podłoża.

Pomiar potencjału powierzchniowego bakterii za pomocą mikroskopii sił sondy Kelvina

To jest wytyczne do konstruowania in vivo unaczynionej tkanki za pomocą mikrochirurgicznej pętli tętniczo-żylnej lub przepływowej konfiguracji szypułki wewnątrz komory inżynierii tkankowej. Powstałe unaczynione tkanki mogą być wykorzystane do regeneracji narządów i wymiany ubytków tkanek, a także do testowania leków i modelowania chorób.

Inżynieria tkankowa poprzez wewnętrzne unaczynienie w komorze inżynierii tkankowej in vivo

Poznaj inżynierię białkową z wykorzystaniem wyświetlacza powierzchni drożdży do selekcji wariantów wiążących antygeny. Ta metoda umożliwia precyzyjną kontrolę warunków sortowania cytometrycznego i wizualizację bibliotek białkowych.

Inżynieria białkowa za pomocą wyświetlacza powierzchni drożdży

Przeglądaj więcej filmów