Inżynieria białkowa za pomocą wyświetlacza powierzchni drożdży

W moim laboratorium opracowujemy terapie komórkowe nowej generacji, łącząc inżynierię białkową z inżynierią komórkową. Projektujemy więc składniki białek, aby uzyskać nowe funkcje lub ulepszyć istniejące, a następnie włączamy te białka zerowe do terapii komórkowych. Rozwinęliśmy również wyświetlacz powierzchniowy do specjalistycznych zastosowań, w tym inżynierii stabilności białek, inżynierii przełączników białek regulowanych małymi cząsteczkami oraz specyficznego ukierunkowania na potwierdzenia aktywowanych receptorów związanych z rakiem.

Zaletą wyświetlania powierzchni drożdży w porównaniu z innymi technologiami wyświetlania, takimi jak wyświetlanie fagów lub rybosomów, jest wizualizacja biblioteki metodą cytometrii przepływowej podczas procesu sortowania oraz precyzyjna kontrola warunków selekcji, takich jak stężenie antygenu i rygorystyczność bramki sortującej. Na początek przygotuj koraliki do pierwszej selekcji koralików, ponownie zawieszając 10 mikrolitrów kulek magnetycznych ze spoiwem biotynowym w 990 mikrolitrach PBSA. Do mycia umieść rurkę na stojaku magnetycznym na dwie minuty przy otwartej pokrywie.

Następnie ostrożnie usuń supernatant. Ponownie zawiesić umyte kulki w 1,5 mililitrowej mikroprobówce wirówkowej w jednym mililitrze PBSA z 6,7 do 33 pikomolami biotynylowanego antygenu. Po inkubacji umieść probówkę na stojaku magnetycznym na dwie minuty z otwartą pokrywą, usuń supernatant i umyj kulki naładowane antygenem jednym mililitrem PBSA.

Gdy kulki osiądą, usuń PBSA. Następnie ponownie zawiesić kulki załadowane antygenem w 50 mikrolitrach PBSA. Przygotuj komórki, kulki antygenowe i roztwór koralików niedźwiedzia do selekcji negatywnej.

Po umyciu ponownie zawiesić kulki antygenowe w 50 mikrolitrach PBSA i ponownie zawiesić koraliki niedźwiedzia w 150 mikrolitrach PBSA. W przypadku pierwszej selekcji negatywnej dodaj 50 mikrolitrów umytych gołych kulek do 950 mikrolitrów umytych komórek w PBSA i inkubuj mieszaninę przez 1,5 godziny w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Po inkubacji umieścić probówki zawierające zawiesiny komórek kulki niedźwiedzia na stojaku magnetycznym z otwartą pokrywą.

Odpipetuj płyn z pokrywki do probówki i odczekaj dwie minuty. Następnie przenieś niezwiązane komórki do świeżej mikroprobówki wirówkowej i dodaj 50 mikrolitrów umytych koralików niedźwiedzich. Po trzech rundach selekcji negatywnej dodaj do komórek 50 mikrolitrów roztworu kulek obciążonego antygenem.

Inkubować przez dwie godziny w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Teraz umieść komórki zawierające koraliki załadowane antygenem na stojaku magnetycznym z otwartą pokrywą. Odpipetuj każdy płyn znajdujący się w pokrywce do probówki.

Odczekaj dwie minuty przed odrzuceniem niezwiązanych komórek. Wykonaj wszystkie pozostałe kroki zgodnie z opisem dla pierwszego wyboru kulki antygenu. Po trzech negatywnych i jednej pozytywnej selekcji, szybko ponownie zawieś komórki w jednym mililitrze SDCAA i przenieś do kolby zawierającej większą objętość SDCAA.

Po całonocnej indukcji ekspresji powierzchniowej białek w SGCAA w bibliotekach drożdży, osadzaj wystarczającą ilość komórek, aby pokryć 10-krotność różnorodności i odrzuć supernatant. Ponownie zawiesić osad w PBSA i przenieść go do mikroprobówek wirówkowych. Użyj 30 milionów komórek do barwienia w każdej probówce.

Przygotuj tyle probówek, ile jest to wymagane w oparciu o różnorodność, w tym jedną probówkę kontrolną bez antygenu. Następnie odwirować probówki o sile 2000 x g przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Zawiesić osad w 200 mikrolitrach PBSA zawierającego antygen i inkubować przez godzinę w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Po ponownym odwirowaniu usunąć PBSA z osadu. Następnie ponownie zawieś komórki w 100 mikrolitrach zimnego PBSA zawierającego przeciwciała w celu barwienia wyświetlacza i wykrywania antygenu. Inkubować przez 30 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Po inkubacji odwirować komórki w temperaturze 2000 x g przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Dodaj jeden mililitr PBSA do granulki i powtórz wirowanie. Następnie usuń większość supernatantu, pozostawiając tylko 20 do 30 mikrolitrów, aby zapobiec wysychaniu granulek.

Ponownie zawiesić granulat w zimnym PBSA tuż przed sortowaniem. Teraz posortuj komórki bezpośrednio na nośniku SDCAA. Po sortowaniu przenieść komórki do kolby wibracyjnej zawierającej większą objętość pożywki SDCAA i inkubować w temperaturze 30 stopni Celsjusza z wytrząsaniem z prędkością 180 obr./min.