Inżynieria białkowa za pomocą wyświetlacza powierzchni drożdży
November 29th, 2024
Ten protokół opisuje podstawowe kroki do przeprowadzenia kampanii selekcji powierzchni drożdży w celu wzbogacenia wariantów białek wiążących się z interesującym nas antygenem.
W moim laboratorium opracowujemy terapie komórkowe nowej generacji, łącząc inżynierię białkową z inżynierią komórkową. Projektujemy więc składniki białek, aby uzyskać nowe funkcje lub ulepszyć istniejące, a następnie włączamy te białka zerowe do terapii komórkowych. Rozwinęliśmy również wyświetlacz powierzchniowy do specjalistycznych zastosowań, w tym inżynierii stabilności białek, inżynierii przełączników białek regulowanych małymi cząsteczkami oraz specyficznego ukierunkowania na potwierdzenia aktywowanych receptorów związanych z rakiem.
Zaletą wyświetlania powierzchni drożdży w porównaniu z innymi technologiami wyświetlania, takimi jak wyświetlanie fagów lub rybosomów, jest wizualizacja biblioteki metodą cytometrii przepływowej podczas procesu sortowania oraz precyzyjna kontrola warunków selekcji, takich jak stężenie antygenu i rygorystyczność bramki sortującej. Na początek przygotuj koraliki do pierwszej selekcji koralików, ponownie zawieszając 10 mikrolitrów kulek magnetycznych ze spoiwem biotynowym w 990 mikrolitrach PBSA. Do mycia umieść rurkę na stojaku magnetycznym na dwie minuty przy otwartej pokrywie.
Następnie ostrożnie usuń supernatant. Ponownie zawiesić umyte kulki w 1,5 mililitrowej mikroprobówce wirówkowej w jednym mililitrze PBSA z 6,7 do 33 pikomolami biotynylowanego antygenu. Po inkubacji umieść probówkę na stojaku magnetycznym na dwie minuty z otwartą pokrywą, usuń supernatant i umyj kulki naładowane antygenem jednym mililitrem PBSA.
Gdy kulki osiądą, usuń PBSA. Następnie ponownie zawiesić kulki załadowane antygenem w 50 mikrolitrach PBSA. Przygotuj komórki, kulki antygenowe i roztwór koralików niedźwiedzia do selekcji negatywnej.
Po umyciu ponownie zawiesić kulki antygenowe w 50 mikrolitrach PBSA i ponownie zawiesić koraliki niedźwiedzia w 150 mikrolitrach PBSA. W przypadku pierwszej selekcji negatywnej dodaj 50 mikrolitrów umytych gołych kulek do 950 mikrolitrów umytych komórek w PBSA i inkubuj mieszaninę przez 1,5 godziny w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Po inkubacji umieścić probówki zawierające zawiesiny komórek kulki niedźwiedzia na stojaku magnetycznym z otwartą pokrywą.
Odpipetuj płyn z pokrywki do probówki i odczekaj dwie minuty. Następnie przenieś niezwiązane komórki do świeżej mikroprobówki wirówkowej i dodaj 50 mikrolitrów umytych koralików niedźwiedzich. Po trzech rundach selekcji negatywnej dodaj do komórek 50 mikrolitrów roztworu kulek obciążonego antygenem.
Inkubować przez dwie godziny w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Teraz umieść komórki zawierające koraliki załadowane antygenem na stojaku magnetycznym z otwartą pokrywą. Odpipetuj każdy płyn znajdujący się w pokrywce do probówki.
Odczekaj dwie minuty przed odrzuceniem niezwiązanych komórek. Wykonaj wszystkie pozostałe kroki zgodnie z opisem dla pierwszego wyboru kulki antygenu. Po trzech negatywnych i jednej pozytywnej selekcji, szybko ponownie zawieś komórki w jednym mililitrze SDCAA i przenieś do kolby zawierającej większą objętość SDCAA.
Po całonocnej indukcji ekspresji powierzchniowej białek w SGCAA w bibliotekach drożdży, osadzaj wystarczającą ilość komórek, aby pokryć 10-krotność różnorodności i odrzuć supernatant. Ponownie zawiesić osad w PBSA i przenieść go do mikroprobówek wirówkowych. Użyj 30 milionów komórek do barwienia w każdej probówce.
Przygotuj tyle probówek, ile jest to wymagane w oparciu o różnorodność, w tym jedną probówkę kontrolną bez antygenu. Następnie odwirować probówki o sile 2000 x g przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Zawiesić osad w 200 mikrolitrach PBSA zawierającego antygen i inkubować przez godzinę w temperaturze czterech stopni Celsjusza.
Po ponownym odwirowaniu usunąć PBSA z osadu. Następnie ponownie zawieś komórki w 100 mikrolitrach zimnego PBSA zawierającego przeciwciała w celu barwienia wyświetlacza i wykrywania antygenu. Inkubować przez 30 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.
Po inkubacji odwirować komórki w temperaturze 2000 x g przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Dodaj jeden mililitr PBSA do granulki i powtórz wirowanie. Następnie usuń większość supernatantu, pozostawiając tylko 20 do 30 mikrolitrów, aby zapobiec wysychaniu granulek.
Ponownie zawiesić granulat w zimnym PBSA tuż przed sortowaniem. Teraz posortuj komórki bezpośrednio na nośniku SDCAA. Po sortowaniu przenieść komórki do kolby wibracyjnej zawierającej większą objętość pożywki SDCAA i inkubować w temperaturze 30 stopni Celsjusza z wytrząsaniem z prędkością 180 obr./min.
Przegląd
Ten protokół opisuje kluczowe kroki prowadzenia kampanii selekcji wyświetlania na powierzchni drożdży w celu wzbogacenia wariantów białek wiązających się z antygenem o interesie. Metoda pozwala na precyzyjną kontrolę warunków selekcji i wizualizację cytometryczną przepływową podczas procesu sortowania.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Inżynieria białek
- Inżynieria komórkowa
- Rozwój terapeutyczny
Tło
- Wyświetlanie na powierzchni drożdży jest potężnym narzędziem w inżynierii białek.
- Umożliwia wizualizację bibliotek podczas sortowania.
- Zapewnia kontrolę nad stężeniem antygenu i rygorystycznością sortowania.
- Wykorzystywane w zastosowaniach takich jak inżynieria stabilności białek i terapia ukierunkowana.
Cel badania
- Wzbogacenie wariantów białek wiązających się z określonymi antygenami.
- Poprawa wydajności terapii komórkowych.
- Rozwój nowych przełączyczy białkowych regulowanych przez małe cząsteczki.
Zastosowane metody
- Przygotowanie magnetycznych pereł z wiązaniem biotyny.
- Selekcja negatywna przy użyciu przemytych aktywnych pereł i komórek.
- Selekcja pozytywna z perłami obciążonymi antygenem.
- Sortowanie przepływowe komórek wzbogaconych w cytometrze przepływowym.
Główne wyniki
- Skuteczna wzbogaca białek wiązających się z antygenami.
- Zdemonstrowano kontrolę nad warunkami selekcji.
- Efektywne odzyskiwanie pożądanych wariantów białek do dalszych badań.
Wnioski
- Wyświetlanie na powierzchni drożdży jest skuteczne w selekcji wariantów białek.
- Zapewnia solidną platformę do opracowywania terapii nowej generacji.
- Favoryzuje postęp w inżynierii białek i zastosowaniach terapeutycznych.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Yeast surface display enables rapid, high-fidelity engineering of protein variants with improved or novel binding properties, directly supporting early-stage therapeutic discovery. The method's integration of phenotype-genotype linkage and flow cytometric selection enhances predictive confidence in target validation and lead identification. This platform is broadly accessible and scalable, positioning it as a reusable capability for protein engineering pipelines in biopharma R&D.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of therapeutic hypotheses by selecting protein variants with desired binding profiles.
- Supports biological de-risking through precise control of selection stringency and antigen concentration.
- Facilitates functional target validation by linking protein phenotype to genotype for downstream analysis.
- Improves predictive confidence for portfolio triage by enriching high-affinity binders.
Screening & Assay Development
- Prepares validated yeast-displayed protein libraries for downstream screening workflows.
- Standardizes assay conditions and enhances reproducibility via flow cytometric visualization and sorting.
- Enables quantitative assessment of binding affinity and specificity for reliable compound evaluation.
- Supports scalable enrichment and reuse of engineered protein variants across campaigns.
Translational & Preclinical Research
- Aligns engineered proteins with disease-relevant targets for translational continuity.
- Provides a robust platform for preclinical validation of protein-based therapeutics.
- Reduces mechanistic ambiguity by enabling selection for stability and functional activity.
- Supports risk-adjusted advancement decisions through quantitative enrichment data.
Pipeline & Workflow Integration
Yeast surface display fits at the intersection of early discovery, lead identification, and preclinical validation, enabling iterative optimization of protein therapeutics.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by selecting for functional protein variants.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative outputs for affinity and specificity assessment.
- Analytics: Provides flow cytometric and sequencing data to compare variant performance across conditions.
- Translational Research: Bridges discovery and preclinical stages by generating candidates with validated binding properties.
- Enterprise Reuse: Offers a modular, scalable platform adaptable to diverse protein engineering objectives.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in protein engineering.
- Operational Value: Standardizes and streamlines selection workflows for reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Enables informed go/no-go decisions and capital-efficient portfolio management.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of protein therapeutic candidates.
Implementation Considerations
- Requires expertise in molecular biology and flow cytometry for optimal execution.
- Needs access to flow cytometric instrumentation and analytical infrastructure.
- Demands cross-team standardization of selection and sorting protocols.
- Adaptable to various protein targets and model systems with protocol adjustments.
- Dependent on library diversity and antigen availability for campaign success.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:00
Introduction
0:52
Yeast Surface Display Selection Using Magnetic Beads
1:57
Second Bead Selection Round with 3 Negative and 1 Positive Selection
3:43
Flow Cytometric Sorting for Yeast Surface Display Selection of the Fn3-Based G4 Library for Binding to the Antigen
