Pobieranie próbek pojedynczych komórek za pomocą mikrodysekcji laserowej: technika zbierania komórek docelowych z heterogenicznej populacji komórek

Mikrodysekcja wychwytu laserowego pomaga uzyskać pojedynczą komórkę docelową z mieszaniny komórek przygotowanej na szkiełku podstawowym. Zacznij od pobrania na jego powierzchni odpowiedniego szkiełka podstawowego pokrytego przepuszczalną dla promieniowania UV, biochemicznie obojętną membraną. Wystaw szkiełko na działanie światła UV, aby uczynić je bardziej hydrofilowym i lepiej przylegać do komórek.

Zamontować szkiełko w aparacie do cytowirówki. Dodać zawiesinę komórek do portu lejkowego aparatu. Cytowirówka, aby umożliwić skoncentrowanie siły odśrodkowej i osadzenie monowarstwy komórek na małym obszarze na szkiełku podstawowym. Pozostaw szkiełko do wyschnięcia na powietrzu.

Umieść szkiełko próbką do góry pod mikroskopem laserowym do mikroskopu preparacyjnego. Zdefiniuj region otaczający komórkę zainteresowania. Teraz skoncentruj wiązkę laserową, aby przeciąć obszar zawierający komórkę docelową wraz z powłoką membrany. Następnie rozogniskuj wiązkę laserową i pulsuj ją, aby wytworzyć ciśnienie. Energia ta katapultuje mikrowypreparowany obszar do odwróconej nasadki wstępnie zmontowanej rurki zbiorczej zawierającej bufor umieszczony nad szkiełkiem.

Wyjmij rurkę i zamknij jej nakrętkę. Zakręć probówką, aby doprowadzić bufor zawierający pojedynczą komórkę docelową do dna probówki. Wstaw rurkę do lodówki do czasu dalszej analizy.

W celu mikodysekcji laserowej cytowirkę należy przelać całe 300 mikrolitrów zawiesiny komórkowej na szkiełko pokryte membraną o sile 300 x g przez 5 minut. Następnie umieść szkiełko pokryte membraną na mikroskopie zdolnym do laserowej mikodysekcji. Następnie odpipetuj 4,5 mikrolitra głównej mieszanki do lizy komórek do nakrętki 0,2-mililitrowej probówki do PCR.

Umieść nasadkę nad próbką i zbierz pojedynczą komórkę za pomocą mikrodysekcji laserowej. Bezpośrednio po tym sprawdź, czy w nasadce PCR nie ma wyizolowanych komórek. Wyjmij probówkę PCR z mikroskopu laserowego mirkodysekcyjnego i zamknij probówkę. Zbierz cały płyn na dnie tubki za pomocą krótkiego wirowania.