Modelowanie raka prostaty w genetycznie modyfikowanych modelach mysich: technika zlokalizowanej edycji genów za pośrednictwem CRISPR/Cas9 w komórkach przedniego płata prostaty myszy

Zacznij od znieczulonego i przygotowanego mysiego modelu knock-in CRISPR/Cas9 z genomem zmodyfikowanym do ekspresji endonukleaz Cas9 i białek zielonej fluorescencji lub GFP przez silny promotor upstream. Kaseta floxed-STOP lub LSL włożona bezpośrednio za promotorem blokuje transkrypcję Cas9 i GFP w normalnych warunkach.

Naciąć ścianę brzucha myszy, aby odsłonić jej przedni płat prostaty przyczepiony do pęcherzyka nasiennego. Wstrzyknąć pożądaną zawiesinę adenowirusową do płata przedniego, aby ułatwić celowe dostarczanie genomu wirusa do komórek. Umieść płat prostaty z powrotem w jamie brzusznej i zszyj nacięcie.

W komórkach zakażonych wirusem genom wirusa wykazuje ekspresję enzymów rekombinazy Cre i przewodników RNA ukierunkowanych na gen, który ma zostać zmutowany. Enzymy Cre rozpoznają kasetę LSL i wycinają bloker transkrypcji z floksem. Ten krok pozwala promotorowi sterować ekspresją endonukleaz Cas9 i GFP.

Następnie endonukleazy Cas9 tworzą kompleksy z kodowanymi przez wirusa przewodnikami RNA, które kierują te kompleksy do sekwencji docelowej w genie, który ma zostać zmutowany. Ta lokalizacja pozwala endonukleazie Cas9 na rozszczepienie genomowego DNA w genie docelowym, co prowadzi do zmian genetycznych.

Zmiana onkogenna powoduje, że zmutowane komórki przekształcają się w rakowe. Koekspresja białek reporterowych GFP w zmutowanych komórkach ułatwia identyfikację i śledzenie progresji raka.

Aby dostarczyć wirusa do prostaty, po znieczuleniu 8-tygodniowego samca myszy zgodnie z protokołem tekstowym, zbadaj głębokość znieczulenia, oceniając rozluźnienie mięśni, wycofanie pedału i odruchy powiekowe. Gdy zaobserwuje się utratę odruchów, ogol dolną część brzucha zwierzęcia. Za pomocą sterylnego bawełnianego wacika ostrożnie zakryj oczy zwierzęcia weterynaryjną maścią okulistyczną, aby zapobiec ślepocie spowodowanej kseroftalmią. Następnie użyj 70% etanolu i 10% jodowidonu, aby przetrzeć ogolony brzuch, aby zdezynfekować obszar operacyjny.

Następnie za pomocą sterylnych nożyczek chirurgicznych wykonaj około 1-centymetrowe pionowe nacięcie skóry w dolnej linii środkowej brzucha. Następnie za pomocą cienkich kleszczy punktowych podnieś otrzewną, aby zapobiec uszkodzeniu narządów leżących pod spodem, i użyj nożyczek chirurgicznych, aby ostrożnie wykonać 8-milimetrowe lub krótsze nacięcie przez otrzewną. Delikatnie odsuń tkankę tłuszczową na bok, aby odsłonić pęcherzyk nasienny. Następnie za pomocą kleszczy z pierścieniami ostrożnie podnieś pęcherzyk nasienny, aż będzie można zidentyfikować przednią część prostaty.

Teraz, za pomocą strzykawki insulinowej o pojemności 0,5 mililitra i igły o wymiarach 30 G x 8 milimetrów, wstrzyknij łączną objętość 30 mikrolitrów roztworu wirusa do przedniego nabłonka prostaty. Zminimalizuj wyciek i upewnij się, że płyn został wchłonięty w tkance, tworząc mały pęcherzyk. Następnie umieść pęcherzyk nasienny z powrotem w jamie brzusznej.

Aby upewnić się, że płyn zostanie wchłonięty w tkance w postaci małego pęcherzyka i bez wycieków, należy wstrzykiwać go równolegle do pęcherzyka nasiennego i zgodnie z kształtem przedniego płata prostaty.

Za pomocą igły stożkowej i koła o średnicy 13 milimetrów i średnicy 3/8 zszyj otrzewną dwoma do trzech prostych przerywanych szwów wchłanialnego szwu 6-0. Następnie, unosząc skórę kleszczami, aby uniknąć uszkodzenia otrzewnej, zszyj skórę trzema sterylnymi klipsami o wymiarach 4,8 x 6,5 milimetra.

Aby uzyskać lepszą rekonwalescencję po operacji, użyj sterylnej strzykawki o pojemności 1 mililitra i igły 27 G x 1/2 cala do podania antidotum na znieczulenie w dawce 0,1 mililitra na gram masy ciała we wstrzyknięciu dootrzewnowym. Następnie ostrożnie umieść zwierzę z powrotem w klatce.

• CRISPR/Cas9 knock-in mouse model - Genetically engineered rodent model used for research purposes involving the CRISPR/Cas9 genome editing system.
• Lsl cassette - A genetic construct used to block transcription under certain conditions.
• Cas9 endonucleases - Enzymes expressed by the Cas9 gene, used in CRISPR for cutting DNA at desired locations.
• Green Fluorescent Proteins (GFPs) - Proteins that glow green under specific light; used as a marker in biological research.
• Prostate Cancer Model - A mouse model designed for prostate cancer studies.

• Introduce CRISPR/Cas9 knock-in mouse model – Define and contextualize the genetically engineered rodent model utilized for genome editing research (e.g., mouse models of prostate cancer).
• Key Concepts – Summarize principles of genetic editing using concepts like lsl-cassette, Cas9 endonucleases, and GFPs (e.g., targeted viral genome delivery).
• Underlying Mechanisms – Briefly describe the process of creating a genetic mutation (e.g., Cre recombinase enzymes and guide-RNA).
• Connect to Experiment – Discuss the importance of these processes in creating prostate cancer mouse models, demonstrating genetic alteration and cancer progression.

• What is the CRISPR/Cas9 knock-in mouse model and how does it assist in genetic research?
• How does the incorporation of GFPs help in tracing cancer progression?
• What is the role of Cas9 endonucleases in the genetic mutation process?

• Practical Applications – Discuss real-world use cases of these techniques in genetic research and cancer study (e.g., prostate cancer research).
• Industry Impact – Identify research sectors benefiting from mouse models, including genome science, biotechnology, and healthcare (e.g., CRISPR technology).
• Societal Importance – Emphasize the wider benefits of this technology, in aiding our understanding of diseases and therapies (e.g., cancer research).
• Link to Scientific Advancements – Discuss the significant breakthroughs these models have led to in scientific research.