JoVE Encyklopedia Eksperymentów
Badania nad rakiem
0 wyświetleń • 3:18 min. • April 30th, 2023
Kłębuszek nerkowy to złożona sieć naczyń włosowatych w nerkach, która filtruje odpady i usuwa nadmiar płynu z krwi. Szybkość filtracji nerkowej zależy od tej wyspecjalizowanej struktury, którą można zbadać za pomocą barwnika Periodic Acid Schiff lub PAS.
Na początek weź parafinowany wycinek kory nerki na szklanym szkiełku. Potraktuj szkiełko ksylenem. Cząsteczki ksylenu rozpuszczają wosk parafinowy z części tkankowej. Następnie wystaw próbkę na działanie zmniejszających się stężeń alkoholu. Alkohol usuwa ślady ksylenu, jednocześnie nawilżając część tkanki w celu późniejszego związania plamy.
Teraz dodaj kwas periodyczny do próbki. Kwas periodyczny przekształca diole obecne w polisacharydach tkankowych, takich jak glikogen lub mucyna, w aldehydy. Aldehydy te reagują z odczynnikiem Schiffa, kombinacją kwasu fuksynowego i siarkowego, tworząc barwnik w kolorze magenty, który barwi wycinek tkanki. Opłucz szkiełko, aby usunąć nadmiar plamy.
Po spłukaniu dodaj żelazo-hematoksylinę, jądrowy barwnik przeciwzapalny, który wiąże się z DNA i barwi go na fioletowo. Umyj, aby usunąć nadmiar plam. Na koniec odwodnić próbkę za pomocą zwiększającej mocy alkoholu, a następnie ksylenu, który służy jako środek czyszczący. Ten krok pomaga poprawić kontrast przekroju tkanki do badania mikroskopowego.
Chorobę kłębuszków nerkowych można uwidocznić jako pogrubienie błony podstawnej, zmienione naczynia włosowate i nieprawidłowe komórki, które odnoszą się do upośledzenia funkcji nerek.
Aby uzyskać szczegółową wizualizację komórek kłębuszków nerkowych i macierzy mezangialnej, należy wysuszyć próbki kory nerkowej osadzonej w parafinie w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 1 godzinę, a następnie przeprowadzić deparafinowanie za pomocą kolejnych zanurzeń w ksylenie i zstępującym etanolu. Ponownie uwodnić próbki w wodzie destylowanej przez 5 minut i inkubować szkiełka w roztworze kwasu okresowego w komorze wyciągowej.
Po 5 minutach przepłukać szkiełka trzema 5-minutowymi płukaniami w 100 mililitrach wody destylowanej, a następnie 15-minutową inkubacją w odczynniku Schiffa. Pod koniec inkubacji umyć szkiełka pod bieżącą wodą z kranu przez 5 minut i przeciwbarwić hematoksyliną przez 3 sekundy, a następnie dokładnie spłukać pod bieżącą wodą z kranu przez kolejne 15 minut.
Następnie odwodnij szkiełka za pomocą wznoszących się zanurzeń w etanolu i dwóch kolejnych 3-minutowych zanurzeń w ksylenie. Po wyschnięciu na powietrzu szkiełka można zamontować za pomocą podłoża montażowego na bazie ksylenu w celu oceny ich struktury kłębuszkowej pod mikroskopem świetlnym przy 400-krotnym powiększeniu.