Narzędzia do edycji zasad za pośrednictwem CRISPR: technika edycji genomu w celu wywołania ukierunkowanej substytucji zasad

W przypadku edycji genomu za pośrednictwem CRISPR zacznij od hodowli HAP1-BE3, haploidalnej linii komórkowej ze zintegrowanym genem BE kodującym enzym edytora zasad. Do tej hodowli dodaj wektory lentiwirusowe zawierające plazmid CRISPR-Cas9 przeznaczony dla określonego celu, takiego jak gen ludzkiego raka piersi, BRCA1.

Cząsteczka lentiwirusa łączy się z błoną komórkową gospodarza, uwalniając plazmid, który ostatecznie integruje się z genomem komórki gospodarza, tworząc segmenty genu CRISPR-Cas9-BE. Geny te generują gRNA ukierunkowane na BRCA1, endonukleazę Cas9 i deaminazę cytydynową BE.

GRNA ukierunkowane na BRCA1 to RNA, które łączy się z Cas9 i kieruje kompleks do locus genu BRCA1. W pobliżu tego genu locus znajduje się Protospacer Adjacent Motif (PAM), w którym BE może stabilnie dokować i przemieszczać się w górę rzeki, aby dotrzeć do swojego aktywnego regionu katalitycznego. W tym przypadku BE rozpoznaje zasadę cytydyny i przekształca ją w urydynę.

Ta mutacja substytucji zasad wyzwala nukleazę Cas9 do przecięcia niezmodyfikowanej nici DNA. Pęknięcie nici DNA aktywuje enzymy naprawcze, które wypełniają brakującą zasadę i przekształcają uracyl, zasadę inną niż DNA, w tyminę. Ogólnie rzecz biorąc, procesy te generują wariant genu.

Teraz inkubuj komórki w warunkach fizjologicznych i subkulturze, aby namnażać wariant genu. Wyodrębnij genomowe DNA i zsekwencjonuj je, aby przeanalizować wydajność edycji zasad za pośrednictwem CRISPR.

Wysiewaj 5 x 10⁵ komórek HAP1-BE3 na basenie na 24-dołkowych płytkach na dzień przed transfekcją i hoduj je, aby osiągnąć 70% do 80% konfluencji w celu transfekcji. Transfect BRCA1 ukierunkowane na przewodnikowe RNA za pomocą zakupionych odczynników do transfekcji, zgodnie z protokołem producenta. Użyj 1 mikrograma przewodnikowego RNA BRCA1, aby indukować konwersję CG do TA w miejscach docelowych BRCA1. Następnie inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza i subkulturuj co 3 do 4 dni. Zbierz granulki komórek 3, 10 i 24 dni po transfekcji, aby przeanalizować wydajność edycji bazy. Ekstrakcja genomowego DNA za pomocą zestawu do oczyszczania genomowego DNA.