JoVE Encyklopedia Eksperymentów
Techniki biologiczne
0 wyświetleń • 2:58 min. • July 8th, 2025
W przypadku edycji genomu za pośrednictwem CRISPR zacznij od hodowli HAP1-BE3, haploidalnej linii komórkowej ze zintegrowanym genem BE kodującym enzym edytora zasad. Do tej hodowli dodaj wektory lentiwirusowe zawierające plazmid CRISPR-Cas9 przeznaczony dla określonego celu, takiego jak gen ludzkiego raka piersi, BRCA1.
Cząsteczka lentiwirusa łączy się z błoną komórkową gospodarza, uwalniając plazmid, który ostatecznie integruje się z genomem komórki gospodarza, tworząc segmenty genu CRISPR-Cas9-BE. Geny te generują gRNA ukierunkowane na BRCA1, endonukleazę Cas9 i deaminazę cytydynową BE.
GRNA ukierunkowane na BRCA1 to RNA, które łączy się z Cas9 i kieruje kompleks do locus genu BRCA1. W pobliżu tego genu locus znajduje się Protospacer Adjacent Motif (PAM), w którym BE może stabilnie dokować i przemieszczać się w górę rzeki, aby dotrzeć do swojego aktywnego regionu katalitycznego. W tym przypadku BE rozpoznaje zasadę cytydyny i przekształca ją w urydynę.
Ta mutacja substytucji zasad wyzwala nukleazę Cas9 do przecięcia niezmodyfikowanej nici DNA. Pęknięcie nici DNA aktywuje enzymy naprawcze, które wypełniają brakującą zasadę i przekształcają uracyl, zasadę inną niż DNA, w tyminę. Og
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych