Cyfrowy PCR oparty na chipie do wykrywania rzadkich wariantów transkryptu za pomocą chipa nanofluidycznego

Technika cyfrowego PCR oparta na chipie polega na podziale pojedynczej reakcji na komory nanofluidycznego chipa. Amplifikacja podzielonych sekwencji umożliwia wykrywanie rzadkich wariantów transkryptów — niekanonicznych transkryptów występujących z niską częstotliwością.

Na początek weź próbkę zawierającą cDNA docelowego rzadkiego wariantu transkryptu i wariantu powszechnego. Dodaj roztwór zawierający termostabilną polimerazę DNA, dNTP i startery.

Dodaj powszechne i rzadkie sondy oligonukleotydowe specyficzne dla wariantu transkryptu — znakowane różnymi reporterami fluorescencyjnymi i cząsteczkami wygaszającymi. Wygaszacz absorbuje fluorescencję reportera, gdy znajduje się w bliskiej odległości.

Załaduj mieszaninę na chip nanofluidyczny. Roztwór jest podzielony na nanokomory o jednakowej wielkości. Każda komora zawierająca cDNA służy jako niezależne naczynie reakcyjne.

Rozpocznij proces cykli termicznych. Wysoka temperatura denaturacji rozdziela dwuniciowe DNA na pojedyncze nici. Obniż temperaturę, pozwalając starterom i sondom oligonukleotydowym na wyżarzanie się do komplementarnych regionów na pojedynczych niciach DNA.

Zwiększ temperaturę, aby osiągnąć etap przedłużania, w którym polimeraza DNA rozciąga starter i rozszczepia sondę. Odległość od wygaszacza umożliwia emisję fluorescencji reportera. Odczytaj sygnał fluorescencji.

Utwórz wykres punktowy przedstawiający komnaty ze wzmocnionym celem rzadkiej transkrypcji oraz komory pozbawione celu. Sygnały dodatnie dla celu wskazują na obecność w próbce wariantu z rzadkim transkryptem.

Na początek pozwól wzorcowi wymieszać i test rozmrozić w temperaturze pokojowej przez co najmniej 20 minut. Następnie załaduj 0,5-mililitrowe probówki z 6-mikrolitrowymi porcjami próbek cDNA. Zrób także rurkę kontrolną bez szablonu. Następnie delikatnie zmieszać mieszankę wzorcową i podwielokrotność 8,7 mikrolitra na reakcję do sterylnej probówki.

Następnie do każdej reakcji dodaj 0,87 mikrolitra niestandardowego startera testowego i dodaj 1,83 mikrolitra wody wolnej od nukleaz. Delikatnie wymieszaj kombinację i przenieś 11,4 mikrolitra do każdej probówki zawierającej cDNA i do kontroli bez matrycy. Następnie delikatnie wymieszaj probówki i połącz zawartość probówki za pomocą wirowania impulsowego. Aby uzyskać optymalne wyniki, załaduj frytki tak szybko, jak to możliwe.

Podłącz ładowarkę wiórów i poczekaj, aż kontrolka zmieni kolor na zielony. Następnie należy przygotować strzykawkę z płynem zanurzeniowym, delikatnie pociągając tłok na głębokość od 1 do 2 milimetrów, a następnie zdjąć nakrętkę i dodać końcówkę.

Następnie zwróć uwagę na kod napisany na wieczku nowego chipa, a następnie ostrożnie przytrzymaj pokrywę z boku, zdejmij folię ochronną i umieść ją w gnieździe pokrywy lepką stroną do góry. Teraz naciśnij dźwignię, aby otworzyć zacisk i ostrożnie załaduj wiór do gniazda wiórów.

Następnie włóż nowe ostrze załadowcze do ładowarki. Dociśnij go delikatnie, aby upewnić się, że jest mocno na swoim miejscu. Teraz przenieś 14,5 mikrolitra mieszanki reakcyjnej na ostrze ładujące. Nie twórz pęcherzyków powietrza i nie odchylaj ostrza. Następnie naciśnij przycisk "Ładowanie", aby rozprowadzić wolumin na chipie.

Ważne jest, aby upewnić się, że ostrze ładujące jest na swoim miejscu. Następnie, podczas napełniania ostrza, nie wciskaj pipety do drugiego oporu, aby uniknąć wprowadzenia pęcherzyków. Nie odchylaj również ostrza końcówką.

Kontynuuj, używając strzykawki, aby przenieść około 20 kropli płynu zanurzeniowego na powierzchnię chipa. Uważaj, aby nie dotknąć powierzchni końcówką i całkowicie zakryj powierzchnię, nie przelewając jej. Następnie obróć ramię wirnika, aby pokrywa zetknęła się z chipem, i dociśnij przez 15 sekund. Następnie naciśnij przycisk pokrywy, aby zwolnić wiór i przywrócić ramię ładowarki do pozycji spoczynkowej. Teraz otwórz zacisk i przytrzymaj zmontowany chip pod kątem 45 stopni, aby ostrożnie dozować płyn zanurzeniowy przez otwór napełniania za pomocą strzykawki. Następnie lekko obróć chip, aby usunąć pęcherzyki powietrza, a następnie usuń nadmiar płynu sterylną chusteczką.

Unikaj rozlewania płynu zanurzeniowego na brzeg końcówki. Jeśli tak się stanie, ostrożnie usuń nadmiar przed uszczelnieniem.

Na koniec uszczelnij pojemnik na wióry, delikatnie odklejając etykietę na pokrywie, a następnie zablokuj port napełniania na co najmniej 5 sekund. Teraz użyj chipa w ciągu dwóch godzin, a do tego czasu przechowuj go w ciemności.

Aby skonfigurować reakcję, otwórz pokrywę i zainstaluj adaptery na obu blokach, nawet jeśli używany jest jeden blok. Następnie umieść chip na blokach próbki i skieruj jego porty napełniania w kierunku przodu termocyklera i nieznacznie podnieś port. Użyj pustych żetonów, aby zrównoważyć dwa bloki.

Następnie połóż podkładkę termiczną na konfiguracji, aby całkowicie zakryć wióry. Następnie zaprogramuj cykle, zamknij pokrywę i rozpocznij reakcję.

Po zakończeniu reakcji wyłącz termocykler, wyjmij podkładki termiczne, a następnie usuń wióry. Pozwól frytkom rozmrozić się do temperatury pokojowej przez co najmniej 10 minut w ciemności i przeanalizuj je w ciągu godziny. Oczyść powierzchnię wiórów izopropanolem, sprawdzając je pod kątem wycieków lub innych problemów.

Aby zapisać dane, włóż pamięć USB do systemu detektora, w którym można zapisać dane. Następnie otwórz tackę na wióry systemu detektora i załaduj chip stroną zadrukowaną do góry. Zamknij tacę i odczekaj 30 sekund na przetworzenie danych. Następnie wyjmij chip i powtórz proces dla następnego chipa.

Następnie przenieś pamięć USB z detektora do komputera i przenieś files. Otwórz oprogramowanie oparte na chmurze, a następnie utwórz projekt i zaimportuj wszystkie pliki danych dla interesujących Cię chipów. Następnie w zakładce "Zdefiniowane chipy" wybierz użyty barwnik i test. Określ, czy chip jest akceptowalny, wizualizując go w zakładce "Przejrzyj dane". Jeśli próbka została dobrze załadowana, co najmniej 13 000 punktów powinno być użytecznych.

Następnie spójrz na wykres rozrzutu dla wybranego żetonu. Tam zastosuj próg zdefiniowany przez typ testu. W przypadku sygnału barwnika reporterowego amidytu fluoresceiny należy użyć progu 6,000. Teraz usuń wszelkie podejrzane sygnały, które mogą powodować fałszywe alarmy. Zaznacz wątpliwe miejsce na wykresie rozrzutu za pomocą narzędzia "Lasso" i wybierz opcję "Nieokreślone".

Wszystkie pozostałe dodatnie plamy wskazują na obecność kopii cDNA rzadkiego analizowanego celu.