Wykorzystanie trójkolorowego jednocząsteczkowego FRET do badania korelacji oddziaływań białek

Tutaj prezentujemy protokół do uzyskiwania trójkolorowych danych smFRET i ich analizy za pomocą 3D zespołowego modelu Ukrytego Markowa. Dzięki takiemu podejściu naukowcy mogą wyodrębnić informacje kinetyczne ze złożonych systemów białkowych, w tym kooperatywność lub skorelowane interakcje.

Ogólnym celem tej procedury jest zbadanie dynamiki złożonych układów białkowych w sposób ilościowy, z naciskiem na skorelowane interakcje, takie jak kooperatywność. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania z dziedziny biologii ilościowej, w której kompleksy białkowe i ich dynamiczne interakcje mają kluczowe znaczenie. Główną zaletą tej techniki jest to, że pozwala ona na zastosowanie dynamicznego, wielokolorowego, jednocząsteczkowego FRET do biologicznie istotnych systemów.

Przed montażem komory przepływowej wyciąć kanał przepływowy w przezroczystej folii samoprzylepnej o grubości 40 mikronów, spryskać klejem szybkomocującym po nieprzylepnej stronie folii i pozostawić klej do wyschnięcia. Aby rozpocząć montaż komory przepływowej, należy zaopatrzyć się w zjeżdżalnię kwarcową z topionego topienia PEG o grubości trzech milimetrów z biotyną PEG z otworami wlotowymi i wylotowymi. Nałóż warstwę folii sufitowej pokrytą klejem w sprayu na funkcjonalizowaną stronę prowadnicy, wyrównując kanał z hakami wlotowymi i wylotowymi.

Podgrzej szkiełko do 80 stopni Celsjusza na gorącej płycie przez minutę. Dociśnij folię do szkiełka przez 30 sekund za pomocą dodatkowego szkiełka mikroskopowego, aby równomiernie rozprowadzić nacisk. A następnie pozwól montażowi ostygnąć przez minutę.

Odklej arkusz ochronny zakrywający klej. Umieść szkiełko nakrywkowe na odsłoniętym kleju, aby utworzyć komorę przepływową. Podgrzej komorę do 80 stopni Celsjusza przez minutę.

Dociśnij szkiełko nakrywkowe do kleju przez 30 sekund, aby uszczelnić komorę i pozwolić zmontowanej komorze ostygnąć. Nałóż kroplę glicerolu na powierzchnię pryzmatu przed umieszczeniem komory przepływowej nad pryzmatem. Zamontuj komorę przepływową w uchwycie do wielokolorowego mikroskopu pryzmatycznego typu TIRF.

Po zakończeniu podłącz rurkę doprowadzającą i wylotową. Aby rozpocząć konfigurację przyrządu do pomiaru trzech kolorów, otwórz oprogramowanie kamery CCD zwielokrotniającej elektrony, ustaw czujnik EMCCD na najniższą możliwą temperaturę. Ustaw prędkość przesunięcia kamery w pionie na 3,3 mikrosekundy, wybierz normalne napięcie zegara w pionie, ustaw częstotliwość odczytu w poziomie na 17 miliherców przy 16 bitach, wzmocnienie przed wzmocnieniem na trzy, a poziom wzmocnienia mnożnika elektronów na 1000.

Wybierz zewnętrzne wyzwalanie pozyskiwania. Ustaw czas naświetlania na 70 milisekund. A czas nagrywania filmu do 750 cykli akwizycji.

Utwórz nowy folder dla plików pomiarowych. Włącz automatyczne zapisywanie w oprogramowaniu EMCCD i ustaw format pliku klatki filmu na TIFF. Ustaw ścieżkę do pliku automatycznego zapisywania na nowo utworzony folder.

Następnie otwórz oprogramowanie sterujące akustyczno-optycznym filtrem przestrajalnym, oprogramowanie sterujące laserem oraz oprogramowanie wyzwalające synchronizujące lasery, AOTF, migawki optyczne i kamery. Użyj AOTF, aby dostosować moc lasera do około trzech miliwatów przed wejściem do pryzmatu. Załaduj wzór wyzwalania, który synchronizuje wszystkie urządzenia do przemiennego wzbudzenia laserowego, a następnie zamontuj uchwyt próbki w urządzeniu.

Umieść koniec rurki wlotowej w probówce mikrowirówki zawierającej bufor doświadczalny. Podłącz rurkę wylotową do pompy strzykawkowej ustawionej w trybie wycofania. Przepłukać komorę 150 mikrolitrami buforu.

Ustaw ostrość kamerę CCD na funkcjonalnym interfejsie, wyrównaj wiązki wzbudzenia i wybiel zanieczyszczenia fluorescencyjne. Następnie przelej 300 mikrolitrów 0,25 miligrama na mililitr roztworu deglikozylowanej awidyny i buforu do komory i inkubuj przez jedną minutę. Wypłukać niezwiązaną deglikozylowaną awidynę z komory za pomocą buforu.

Następnie przepuść 300 mikrolitrów buforu o stężeniu BSA 0,5 miligrama na mililitr przez komorę, aby zablokować wady funkcjonalizacji powierzchni. Następnie załadować komorę przepływową 150 mikrolitrowymi porcjami biotynylowanego, znakowanego fluorescencyjnie Hsp90 w buforze zawierającym BSA o rosnących stężeniach Hsp90, aż do osiągnięcia wystarczającej gęstości powierzchniowej. Wypłukać niezwiązane białko z komory za pomocą 300 mikrolitrów buforu zawierającego BSA.

Załadować 150 mikrolitrów 25-nanomolowego roztworu znakowanego buforu zawierającego AMP-PMP i BSA do komory i inkubować przez pięć minut. Powtórz ładowanie i inkubację jeden raz. Następnie użyj steppera piezoelektrycznego, aby przesunąć komorę próbki prostopadle do belki wzbudzenia, aby zmienić pole widzenia zgodnie z potrzebami.

W razie potrzeby wyreguluj ostrość obrazu. Rozpocznij nagrania z kamery w oprogramowaniu aparatu, klikając przycisk odbierania sygnału, jak pokazano. Zainicjuj cykle akwizycji wzbudzenia w oprogramowaniu wyzwalającym, aby rozpocząć akwizycję danych.

Aby rozpocząć analizę danych, otwórz oprogramowanie do analizy i zaimportuj nagrane filmy z dwóch kamer. Kliknij przycisk znajdź ślady, aby określić ślady intensywności fluorescencji odpowiadające potencjalnym pojedynczym cząsteczkom. Dla każdej cząsteczki oblicz sumę wszystkich śladów tej plamki o tym samym kolorze wzbudzenia.

Oceń profile intensywności we wszystkich kanałach dla mniej więcej płaskiego plateau w stawie surowej intensywności i pojedynczego etapu wybielania dla wszystkich kolorów wzbudzenia. Szukaj zachowania antyskorelowanego w odpowiednich kanałach detekcji i występowania czerwonej fluorescencji w śladzie. Jeśli wszystkie kryteria są spełnione, należy zachować ślady fluorescencji do dalszej analizy.

Tylko wskazana cząsteczka spełnia kryteria w tym przykładzie. Wyklucz ślady, które nie mają płaskich płaskowyżów, które pokazują zdarzenia mrugania, a nie antykorelację lub które mają wiele etapów wybielania. Selekcja śladów jest kluczowym krokiem we wszystkich technikach jednocząsteczkowych.

Należy wybierać tylko te ślady, które spełniają dobrze zdefiniowane kryteria. Tutaj tymi kryteriami są antykorelacja, pojedyncze etapy wybielania i płaskie płaskowyże. Następnie wyświetl zapisane cząsteczki jedna po drugiej i jeden zestaw śladów intensywności wybierz przedział czasu, w którym wszystkie czwórki podłogi są już wybielone.

Oblicz intensywność tła wiązki dla tego przedziału czasu, a następnie wybierz zakres wydajności FRET, w którym obecne są oba barwniki na Hsp90, upewniając się, że wykluczysz ślady z zdarzeniami. Obliczyć częściowe ślady fluorescencji. Wyklucz cząsteczki o niskim stosunku sygnału do szumu w śladach.

Następnie wygeneruj projekcje 2D powiązania danych częściowej fluorescencji i uruchom narzędzie do obliczania populacji względnej. Kliknij przycisk Init. Narysuj wielokąt wokół szczytu zainteresowania.

I kliknij przycisk liczba, aby obliczyć względną populację dla tego szczytu. Wygeneruj histogram 3D danych częściowej fluorescencji i znormalizuj histogram. Nadmiarowe parametry początkowe dla dopasowania gaussowskiego 3D i dodaj populacje stanów na końcu wektora parametru.

Dopasuj dane i wyświetl wyniki. Po zdefiniowaniu położenia i szerokości każdego stanu w przestrzeni częściowej fluorescencji 3D, zainicjuj interfejs Ukrytego modelu Markowa. Wybierz odpowiednią liczbę stanów, liczbę wymiarów sygnału wejściowego oraz typ wejścia.

Zoptymalizuj parametry HMM, aby określić estymatory maksymalnego prawdopodobieństwa przejścia. Powtórz wybór populacji, dopasowanie i optymalizację HMM dla podzbiorów danych. Na koniec oblicz przedział ufności dla prawdopodobieństw przejścia i zwiń stany konformacyjne, aby uprościć dane do dalszej analizy.

Stany konformacyjne białka Hsp90 badano za pomocą trzykolorowej pojedynczej cząsteczki FRET w obecności znakowanego nukleotydu reporterowego AMP-PMP. Pięć stanów konformacyjnych można było rozróżnić na podstawie intensywności fluorescencji, przy czym cztery z tych stanów były funkcjonalnie odrębne. Trzykolorowa pojedyncza cząsteczka FRET spowodowała częściowe dane fluorescencji obejmujące przestrzeń 3D.

Projekcje 2D zostały wykorzystane, aby pomóc w rozdzieleniu stanów, ponieważ wszystkie stany teoretycznie oczekiwane w warunkach eksperymentu można odróżnić na podstawie ich częściowego rozkwitu w projekcjach 2D. Względne populacje tych stanów zostały określone na podstawie rzutów 2D i zostały użyte jako ograniczenia dla pasowań Gaussa 3D. Późniejsza optymalizacja i modelowanie HMM 3D w skali całego zespołu zapewniły wyekstrahowane prawdopodobieństwa przejścia stanu.

Przedziały ufności zostały obliczone dla każdej wyodrębnionej stałej szybkości. Powtórzenie eksperymentów w obecności dodatkowych 250 mikromolowych nieznakowanych AMP-PMP wyjaśniło wpływ wiązania jednego nukleotydu na drugie miejsce wiązania w dimerze Hsp90. Zapadanie się konformacji związanych i niezwiązanych pozwoliło na obliczenie średniego czasu przebywania dla dysocjacji fluorescencyjnego AMP-PMP od Hsp90 w obecności i braku dodatkowego nieznakowanego AMP-PMP.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wyodrębnić informacje kinetyczne z dynamicznego systemu białkowego za pomocą wielokolorowego FRET i mikroskopu TIRF. Technika ta toruje drogę naukowcom zajmującym się naukami przyrodniczymi do określania skorelowanych interakcji w układach wielobiałkowych. Jest to ważne dla głębszego zrozumienia podstawowych mechanizmów regulacyjnych, takich jak kooperatywność.