Wytwarzanie cząstek podobnych do wirusa Chikungunya przy użyciu systemu ekspresji bakulowirusa w komórkach owadów

Cząsteczki podobne do wirusa Chikungunya, VLP, są niezakaźnymi strukturami złożonymi z białek otoczki wirusa osadzonych w dwuwarstwie lipidowej i pozbawionych materiału genetycznego.

Aby wytworzyć VLP Chikungunya, należy zainfekować komórki owadów Spodoptera frugiperda Sf9 rekombinowanymi bakulowirusami wykazującymi ekspresję strukturalnej kasety genowej Chikungunya. Kaseta składa się z promotora bakulowirusa połączonego z genami strukturalnymi chikungunya kodującymi kapsyd i białka otoczkowe.

Podczas inkubacji glikoproteiny otoczkowe bakulowirusa wiążą się z receptorami powierzchniowymi na komórkach owadów. Ułatwia to wnikanie i uwalnianie wirusowego DNA do cytoplazmy, generując poliproteiny zawierające kapsyd chikungunya i białka otoczkowe.

Po syntezie, autokatalityczne rozszczepienie białka kapsydu wytwarza prekursorową poliproteinę posiadającą białka otoczki w retikulum endoplazmatycznym, ER. W świetle ER enzymy rozszczepiają prekursorową poliproteinę, generując pojedyncze białka, które dostają się do przedziału Golgiego w celu dalszego przetwarzania, tworząc heterotrimery białkowe.

Proteazy rezydentne Golgiego rozszczepiają heterotrimery białek, wytwarzając dojrzałe białka otoczki z białkami E2 i E1. Te białka otoczki przemieszczają się do błony, pączkując w VLP i uwalniając się do pożywki.

Przenieś zainfekowaną kulturę do probówki i odwiruj, aby osadzać komórki owadów. Odessać supernatant zawierający VLP i przefiltrować go w celu usunięcia zanieczyszczeń.

Otrzymany filtrat, zawierający VLP chikungunya, jest gotowy do badań immunopatologicznych.

Hodowla wcześniej przygotowanych komórek Spodoptera frugiperda lub Sf9 w zawiesinie w kolbach przędzalniczych poprzez ciągłe mieszanie z prędkością 130 obr./min na wielopunktowej płytce mieszającej. Utrzymuj objętość kultur na poziomie nie większym niż połowa objętości kolby obrotowej w celu prawidłowego napowietrzenia. Następnie poddaj ekspresję CHIK VLP poprzez zakażenie 250 mililitrów komórek Sf9 w kolbie obrotowej o gęstości 2 x 10⁶ komórek na mililitr wcześniej przygotowanym rekombinowanym bakulowirusem i zwróć komórki do inkubatora o temperaturze 28 stopni Celsjusza.

Użyj wykluczenia błękitu trypanowego, aby określić, czy żywotność komórek zmniejszyła się do 70% do 80%. Po potwierdzeniu przenieś kultury bezpośrednio z zawiesiny do 50-mililitrowych stożkowych probówek i odwiruj komórki w dół. Zebrać supernatanty i przefiltrować je przez membranę porową o grubości 0,22 mikrona przed sedymentacją.