Multipleksowy test immunologiczny oparty na kulkach do identyfikacji przeciwciał specyficznych dla patogenu w ślinie

Weź mieszaninę różnych zestawów mikrosfer - lub kulek polistyrenowych o rozmiarach mikronów.

Każdy zestaw jest sprzężony z unikalnym antygenem patogenu środowiskowego i jest unikalnie znakowany fluorescencyjnie.

Dodaj mieszaninę do płytki filtracyjnej zawierającej membranę na dnie.

Wprowadź ludzką ślinę zawierającą przeciwciała przeciwko patogenom środowiskowym, które wiążą się z pokrewnymi antygenami na mikrosferach.

Usunąć niezwiązane przeciwciała za pomocą próżni. Przeciwciała związane z mikrosferą są zatrzymywane ze względu na mały rozmiar porów membrany.

Dodaj biotynylowane przeciwciała drugorzędowe, aby związać się z przeciwciałami związanymi z mikrosferą. Usuń niezwiązane przeciwciała.

Dodaj streptawidynę sprzężoną z fluorescencyjnym barwnikiem reporterowym, który wiąże się z biotyną na przeciwciałach drugorzędowych.

Usuń niezwiązany barwnik, ponownie zawieś mikrosfery i przepuść je przez multipleksowy analizator immunologiczny.

Wiązka laserowa wykrywa fluorescencję mikrosfery, identyfikując antygen, podczas gdy inna wiązka wykrywa sygnał reporterowy, potwierdzając związane przeciwciało.

Przeciwciała specyficzne dla antygenu w ślinie wskazują na wcześniejszą ekspozycję na odpowiednie patogeny.

Po ponownym zawieszeniu koralików sprzężonych z antygenem przez wirowanie i sonikację przez 20 sekund, należy rozcieńczyć sprzężone granulki do końcowego stężenia 100 kulek na mikrolitr każdego unikalnego zestawu kulek w PBS plus BSA. Następnie przygotuj rozcieńczenie od 1 do 4 śliny o temperaturze pokojowej w PBS plus BSA na 96-dołkowej płytce głębokiej. Wstępnie zwilżyć płytkę filtracyjną 100 mikrolitrami buforu do przemywania i odessać supernatant.

Następnie dodaj 50 mikrolitrów kulek sprzężonych z antygenem i równą objętość rozcieńczonej śliny do 95 dołków 96-dołkowej płytki filtracyjnej w celu końcowego rozcieńczenia od jednego do ośmiu. W tym samym czasie dodaj 50 mikrolitrów kulek sprzężonych z antygenem oraz 50 mikrolitrów samego PBS plus BSA do studzienki kontrolnej.

Inkubować kulki w ciemności w temperaturze pokojowej przez godzinę na wytrząsarce do mikropłytek z prędkością 500 obr./min. Następnie odessać supernatant i przemyć studzienki dwukrotnie 100 mikrolitrami buforu do przemywania wodą. Po drugim myciu ponownie zawieś kulki w 50 mikrolitrach PBS plus BSA, rozcieńczyć przeciwciało wtórne i dodać 50 mikrolitrów do każdej studzienki.

Po wymieszaniu zawartości studzienki za pomocą pipety wielokanałowej, inkubować płytkę na wytrząsarce w ciemności przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Następnie umyj studzienki dwukrotnie 100 mikrolitrami buforu do płukania i ponownie zawieś kulki w 50 mikrolitrach świeżego PBS plus BSA.

Teraz rozcieńczyć reporter i dodać 50 mikrolitrów do każdej studzienki. Dokładnie wymieszać za pomocą pipety wielokanałowej. Po 30 minutach w temperaturze pokojowej na wytrząsarce w ciemności umyj studzienki dwa razy, jak pokazano. Następnie ponownie zawieś kulki w 100 mikrolitrach PBS plus BSA i oceń próbki na analizatorze.