Wizualizacja powstawania i zamykania fagosomów oparta na mikroskopii TIRF

Weź szklane naczynie z dnem pokrytym polimerem, zawierające IgG-opsonizowane czerwone krwinki lub erytrocyty przyklejone do jego powierzchni.

Umieść naczynie na stoliku mikroskopu fluorescencyjnego z całkowitym wewnętrznym odbiciem, utrzymując go w temperaturze fizjologicznej.

Dodaj makrofagi zawierające znakowane fluorescencyjnie peptydy cytoplazmatyczne, które wiążą się ze spolimeryzowaną aktyną, ułatwiając wizualizację cytoszkieletu.

Podczas obrazowania skieruj wiązkę laserową pod kątem wyższym niż kąt krytyczny, powodując wewnętrzne odbicie i generowanie fal ulotnych w punkcie kontaktu.

Ulotne fale selektywnie oświetlają fluorofory na granicy faz szkło-próbka, umożliwiając wizualizację fagocytozy w czasie rzeczywistym.

Receptory Fc makrofagów wiążą się z opsonizowanymi IgG krwinkami czerwonymi, powodując grupowanie receptorów wokół obszaru kontaktu.

Grupowanie wyzwala wewnątrzkomórkowe szlaki sygnałowe i aktywację GTPazy, napędzając polimeryzację aktyny i rekrutację dynaminy, tworząc pseudopody.

Pseudopody rozciągają się wokół RBC, tworząc miseczkę fagocytarną.

W końcu końcówki pseudopodów łączą się. Nagromadzona dynamina pośredniczy w oddzieleniu fagosomu od błony komórkowej, internalizując opsonizowane RBC.

W celu niekowalencyjnego utrwalenia SRBC wlej 2 mililitry komórek opsonizowanych IgG do każdej z naczyń pokrytych polilizyną i odwiruj próbki w wirówce z wirówką z wirnikiem wahadłowym. Wyrzuć supernatanty i przemyj cząstki jednorazowo 2 mililitrami PBS plus 10% BSA.

Następnie inkubuj cząstki z 2 mililitrami świeżego PBS plus 10% BSA przez 30 minut w temperaturze pokojowej, a następnie trzy płukania 2 mililitrami PBS. Po ostatnim praniu wymień PBS na 2 mililitry pożywki mikroskopowej bez surowicy o temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Umieść czaszę kodowaną przez SRBC na stoliku mikroskopu. Następnie zeskrob transfekowane komórki będące przedmiotem zainteresowania z dna szalki hodowlanej i kilkakrotnie pipetuj komórki, aby uzyskać zawiesinę pojedynczej komórki. Dodaj transfekowane komórki do naczynia pokrytego SRBC.

Uruchom oprogramowanie do akwizycji na żywo. Znajdź komórkę, która wyraża fluorescencyjnie znakowane białka i dostosuj położenie naczynia tak, aby interesująca Cię komórka znajdowała się w środku pola. Uzyskuj 500 obrazów pod różnymi kątami od 0 do 5 stopni w krokach co 0,01 stopnia przy jednej długości fali wzbudzenia.

Aby określić kąt krytyczny, pod którym światło padające ma zostać całkowicie odbite na granicy faz szkło-medium i wygenerować falę ulotną, otwórz sekwencję obrazów w odpowiednim oprogramowaniu do obrazowania. Wybierz interesujący Cię obszar w komórce o jednolitej fluorescencji.

Następnie na karcie Obraz wybierz opcję Stosy i wykreśl profil osi Z. Aby wykreślić profil osi Z, średnia intensywność fluorescencji zmierzona w obszarze zainteresowania w funkcji kątów na osi X. Każda wartość kąta na osi x wyższa od kąta krytycznego może być następnie wykorzystana podczas sesji mikroskopowej w celu uzyskania sygnału TIRF.