Wykrywanie nieprawidłowych białek prionowych w tkance mózgowej za pomocą immunohistochemii

Weźmy slajd z nieruchomą sekcją mózgu ssaków wykazującą nieprawidłowo sfałdowane agregaty białka prionowego.

Potraktuj przekrój kwasem mrówkowym, aby zmniejszyć zakaźność agregatów prionowych.

Potraktuj kwaśnym buforem w uwodnionej komorze ciśnieniowej. Wysoka temperatura i kwaśne pH przerywają wiązania krzyżowe białek wywołane wiązaniem, demaskując epitopy antygenowe.

Zanurz w wodzie utlenionej, aby dezaktywować endogenną peroksydazę, zapobiegając niepożądanemu barwieniu tła.

Umieść szkiełko w pokrywie i dodaj bufor, aby utrzymać nawodnienie tkanek.

Wprowadzić roztwór blokujący, zapobiegający niespecyficznemu wiązaniu przeciwciał.

Dodać pierwszorzędowe przeciwciało specyficzne dla agregatów prionowych.

Usuń niezwiązane cząsteczki przeciwciała. Wprowadzić biotynylowane przeciwciało drugorzędowe, które wiąże się z przeciwciałem pierwszorzędowym.

Usuń niezwiązane cząsteczki przeciwciała. Dodaj biotynylowany enzym peroksydazy skompleksowany z awidyną, który wiąże się z biotyną na przeciwciałie drugorzędowym.

Dodaj podłoże chromogenne, które peroksydaza utlenia się do kolorowego produktu.

Za pomocą mikroskopu obserwuj poplamione agregaty.

Ostrożnie zanurz skrawki tkanki w 98% kwasie mrówkowym w temperaturze pokojowej na 30 minut. Opłucz sekcje w wodzie z kranu przez 5 minut, a następnie dwukrotnie spłucz w wodzie destylowanej. Użyj pojemnika do barwienia ze stali nierdzewnej w komorze ciśnieniowej wypełnionej 500 mililitrami wody destylowanej, aby wstępnie przygotować 10-milimolowy bufor cytrynianu w temperaturze 98 stopni Celsjusza przez 20 minut.

W celu kontroli jakości umieść na koszu odcinek samoprzylepnej taśmy wskaźnikowej autoklawu, aby monitorować temperaturę i ciśnienie. Gdy alarm wskaże, że urządzenie osiągnęło czas i temperaturę programu, zanurz kosz ze zjeżdżalniami. Następnie zainicjuj program w komorze ciśnieniowej, aby ustawić punkt drugi i zapisz ciśnienie początkowe i końcowe tego programu.

W celu inaktywacji endogennej peroksydazy zanurzyć kosz szkiełkowy zawierający skrawki próbki w kąpieli 3% nadtlenku wodoru w metanolu na 30 minut. Opłucz sekcje pod bieżącą wodą przez 5 minut. Po odsączeniu zanurz sekcje w soli fizjologicznej buforowanej trójdzielnie na dodatkowe 5 minut. W celu wykrycia odporności należy umieścić każde szkiełko na dostępnym w handlu uchwycie pokrywy, wstępnie zwilżonym solą fizjologiczną buforowaną Tris.

Trzymając stronę z chusteczką skierowaną w stronę uchwytu, a krawędzie ślizgu pokrywają się z dwoma dolnymi punktami uchwytu, upewnij się, że unikasz pęcherzyków powietrza. Przytrzymaj zespół uchwytu suwaka między kciukiem a palcem wskazującym. Trzymaj jeden palec na górze szkiełka do próbek, a drugi na spodzie uchwytu. Następnie umieść zespół w galerii systemu.

Aby upewnić się, że zestaw jest dobrze zmontowany, napełnij studzienkę między szkiełkiem do próbek a uchwytem solą fizjologiczną, nie przelewając jej. Od tego momentu upewnij się, że około 80 mikrolitrów soli fizjologicznej buforowanej Tris musi być zatrzymanych między uchwytem a szkiełkiem. Nie dopuścić do wyschnięcia sekcji.

Zmniejsz barwienie tła przed poddaniem działaniu przeciwciała pierwszorzędowego, preinkubując próbki szkiełka przez 30 minut z 20% normalną surowicą tego samego gatunku co drugorzędowe przeciwciało gospodarza w roztworze soli fizjologicznej buforowanej Tris. Nie myjąc skrawków, nanieść 200 mikrolitrów roztworu przeciwciała pierwotnego bezpośrednio do każdej studzienki zestawu szkiełek i inkubować przez 60 minut w temperaturze pokojowej.

Aby umyć sekcje, napełnij studzienki solą fizjologiczną buforowaną trisem i odczekaj 5 minut. Powtórz pranie dwa razy. Następnie rozcieńczyć biotynylowane przeciwciało drugorzędowe w stężeniu od 1 do 200 w soli fizjologicznej buforowanej trisem z 10% surowicą końską.

Napraw wymaganą objętość, w zależności od liczby sekcji, które mają być leczone. Nałożyć 200 mikrolitrów wtórnego roztworu przeciwciał do każdej studzienki zestawu szkiełek. Po 30 minutach inkubacji w temperaturze pokojowej powtórzyć płukanie solą fizjologiczną buforowaną Tris.

Do inkubacji z peroksydazą kompleksu awidyny-biotyny należy przygotować odczynnik 30 minut przed użyciem i nanieść 200 mikrolitrów roztworu do każdego dołka uchwytu płytki szkiełkowej. Po zakończeniu inkubuj zestaw uchwytów na płytki przez 30 minut w temperaturze pokojowej.