Multipleksowa metoda barwienia immunologicznego przy użyciu pierwszorzędowych przeciwciał od tego samego gatunku gospodarza

Weź stały i przepuszczalny odcinek nadnercza składający się z kory i rdzenia. Potraktuj go wrzącym kwaśnym buforem, zrywając wiązania krzyżowe wywołane fiksacją w celu zdemaskowania antygenu.

Zablokuj niespecyficzne miejsca wiązania i wprowadź pierwszorzędowe przeciwciała wiążące się z markerami specyficznymi dla kory mózgowej.

Dodać biotynylowane przeciwciała drugorzędowe skierowane przeciwko przeciwciałom pierwszorzędowym i peroksydazy sprzężonej ze streptawidyną wiążące się z biotyną.

Wprowadzić znakowany fluoroforem tyramid i nadtlenek wodoru.

Unieruchomione peroksydazy wykorzystują nadtlenek wodoru do aktywacji tyramidu, który wiąże się z pobliskimi białkami, znakując korę.

Następnie potraktuj sekcję wrzącym buforem, aby usunąć związane przeciwciała.

Wprowadź te same przeciwciała pierwszorzędowe wytwarzane przez gatunki gospodarza ukierunkowane na markery specyficzne dla rdzenia i biotynylowane przeciwciała drugorzędowe.

Wprowadzić peroksydazy sprzężone ze streptawidyną i inny tyramid sprzężony z fluoroforem, aby oznaczyć rdzeń.

Usunięcie przeciwciał pierwszorzędowych specyficznych dla kory mózgowej hamuje wiązanie ich ponownie wprowadzonych przeciwciał drugorzędowych, zapobiegając reaktywności krzyżowej.

Zastosuj barwienie jądrowe i wykonaj obrazowanie, aby uwidocznić wyraźnie zabarwioną korę i rdzeń, potwierdzając brak reaktywności krzyżowej przeciwciał.

Przed barwieniem odwoskować i ponownie nawodnić szkiełka utrwalone formaliną, zatopione w parafinie, zanurzając się w każdym roztworze na pięć minut, jak wskazano. Po drugim zanurzeniu w wodzie destylowanej umieść szkiełka w 275 mililitrach wrzącego roztworu cytrynianu sodu na dnie pudełka z końcówką do pipet z pokrywką i umieść pudełko w 700-watowej kuchence mikrofalowej o mocy 70% na osiem minut.

Pod koniec zabiegu otwórz pokrywkę i pozwól roztworowi ostygnąć do temperatury pokojowej przed umyciem szkiełek trzema pięciominutowymi płukaniami świeżego PBST w słoiku z koplinu. W celu zablokowania wszelkich niespecyficznych miejsc wiązania, po ostatnim przemyciu, należy strząsnąć nadmiar PBST z każdego szkiełka i przykryć szkiełka odpowiednią ilością odpowiedniego roztworu blokującego.

Po 30 minutach w temperaturze pokojowej w wilgotnej komorze należy wytrząsnąć nadmiar roztworu blokującego z każdego szkiełka i dodać 250 mikrolitrów pierwszego badanego przeciwciała pierwszorzędowego do każdej próbki. Aby zapobiec wysychaniu próbek, szkiełka mogą być przykryte kawałkiem folii parafinowej.

Po całonocnej inkubacji w temperaturze czterech stopni Celsjusza w wilgotnej komorze umyć szkiełka trzykrotnie świeżym PBST przez pięć minut na pranie. Strząśnij nadmiar PBST, a następnie szybko przykryj każde szkiełko 250 mikrolitrami odpowiedniego roztworu przeciwciał drugorzędowych na jednogodzinną inkubację w wilgotnej komorze w temperaturze pokojowej.

Pod koniec inkubacji umyć szkiełka trzykrotnie w świeżym PBST, jak pokazano, i dodać 250 mikrolitrów świeżo przygotowanej peroksydazy chrzanowej streptawidyny do każdego szkiełka. Po 30 minutach w temperaturze pokojowej umyj szkiełka trzykrotnie w świeżym PBST, następnie strząśnij nadmiar PBST i przykryj każde szkiełko 250 mikrolitrami świeżo przygotowanego roztworu tyramidu fluoroforowego.

Minutę później zanurz szkiełka w świeżym PBST, a następnie trzy dwuminutowe mycia w świeżym PBST. Po ostatnim płukaniu nanieś kilka kropli glicerolu 1 do 1 do roztworu PBS na skrawki i sprawdź obecność sygnału fluorescencyjnego za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej.

Aby usunąć pierwszy kompleks przeciwciał, umieść szkiełka znakowane przeciwciałami w 275 mililitrach wrzącego roztworu cytrynianu sodu na co najmniej osiem minut, jak pokazano. Pod koniec zabiegu otwórz pokrywkę i pozwól roztworowi ostygnąć do temperatury pokojowej, a następnie umyj szkiełka trzykrotnie PBST przez pięć minut na mycie.

Aby wybarwić drugie białko docelowe będące przedmiotem zainteresowania, po wykazaniu blokowania niespecyficznego wiązania, należy oznaczyć każdą próbkę 250 mikrolitrami drugiego podstawowego przeciwciała będącego przedmiotem zainteresowania w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez noc. Następnego ranka umyj szkiełka trzy razy przez pięć minut w świeżym PBST na jedno przemycie, a następnie przykryj każde szkiełko 250 mikrolitrami odpowiedniego roztworu przeciwciał wtórnych na jednogodzinną inkubację w temperaturze pokojowej.

Pod koniec inkubacji umyć szkiełka trzykrotnie w świeżym PBST, jak pokazano, i dodać 250 mikrolitrów świeżo przygotowanej peroksydazy chrzanowej streptawidyny do każdego szkiełka. Aby opracować sygnał dla drugiego białka docelowego będącego przedmiotem zainteresowania po trzech płukaniach PBST, potraktuj szkiełka tyramidem sprzężonym z fluoroforem w innym spektrum fluorescencyjnym.

Aby zatrzymać rozwój sygnału tyramidu, zanurz szkiełka w PBST, a następnie wybarwij próbki odpowiednim barwnikiem jądrowym.