Stymulacja neuronów czuciowych zwoju korzenia grzbietowego za pomocą agonisty receptora neuropeptydowego

Weź płytkę wielodołkową zawierającą transfekowane neurony czuciowe zwoju korzenia grzbietowego szczura.

Neurony studzienki testowej wykazują zmniejszoną ekspresję receptora neuropeptydowego, podczas gdy neurony studzienki kontrolnej wykazują fizjologiczne poziomy ekspresji receptora neuropeptydowego.

Zastąp pożywkę pożywką niezawierającą surowicy, aby zapewnić kontrolowane środowisko dla dokładnej reakcji na stymulację.

Dodaj agonistę receptora neuropeptydowego do studzienek i wymieszaj. Inkubuj płytkę.

W studzience kontrolnej agonista receptora neuropeptydowego wiąże się z receptorami docelowymi, uruchamiając wewnątrzkomórkową kaskadę sygnalizacyjną, która uwalnia neuroprzekaźniki.

Jednak w studzienkach testowych zmniejszona ekspresja receptora neuropeptydowego ogranicza wiązanie agonistów, co prowadzi do zmniejszonego uwalniania neuroprzekaźników w porównaniu z kontrolą.

Po inkubacji zebrać pożywkę z dołków i odwirować.

Przenieś supernatant do probówek i użyj odpowiedniego testu immunologicznego do pomiaru poziomu neuroprzekaźników. Próbka kontrolna wykazuje wyższe uwalnianie neuroprzekaźników niż próbka badana po stymulacji agonistą neuroreceptorów.

W 6 dniu, po posiewie i 72 godziny po transfekcji siRNA, zmień pożywkę hodowlaną na 200 mikrolitrów pożywki bez surowicy. Po 30-minutowej inkubacji dodać 1 mikrolitr substancji chemicznej stymulującej i delikatnie wymieszać pipetując. Po inkubacji przez wymagany okres należy pobrać pożywkę hodowlaną z naczynia hodowlanego i odwirować w temperaturze 5 000 razy g przez 5 minut w temperaturze 4 stopni Celsjusza, aby usunąć wszelkie zawieszone zanieczyszczenia. Zebrać supernatant z wirówki i w razie potrzeby rozcieńczyć solą fizjologiczną buforowaną fosforanami.