Mikroskopia dwufotonowa do badania przyciągania procesów mikrogleju w kierunku związku w wycinku mózgu myszy

Umieść wycinek mózgu myszy w komorze perfuzyjnej zawierającej płyn mózgowy pod mikroskopem dwufotonowym.

Mysz jest genetycznie zmodyfikowana do ekspresji GFP w mikrogleju, umożliwiając śledzenie ruchu mikrogleju.

Zabezpiecz plasterek za pomocą uchwytu.

Korzystając z oświetlenia w jasnym polu, zlokalizuj obszar zainteresowania.

Przełącz się na oświetlenie fluorescencyjne, aby uwidocznić mikroglej.

Napełnij mikropipetę badanym związkiem, zamontuj ją na uchwycie strzykawki i opuść, aby dotknąć plasterka.

Aktywuj tryb obrazowania dwufotonowego, skupiając niskoenergetyczne światło w bliskiej podczerwieni w tkance.

W ognisku lasera dwa fotony łączą swoją energię, aby wzbudzić GFP, emitując fluorescencję.

Rób zdjęcia w wielu płaszczyznach Z, aby skupić się na procesach mikrogleju.

Zarejestruj aktywność wyjściową, a następnie wstrzyknij związek i kontynuuj rejestrację.

Związek wiąże się z receptorami mikrogleju, uruchamiając szlaki sygnałowe, które napędzają rozszerzenie procesu mikrogleju w kierunku źródła związku.

Monitoruj wzrost fluorescencji w pobliżu miejsca wstrzyknięcia w czasie, aby śledzić ruch.

30 minut przed rozpoczęciem nagrywania podłącz pompę perystaltyczną do dostosowanej komory rejestrującej z górną i dolną perfuzją w celu optymalizacji natlenienia i żywotności wycinków tkanki i wyczyść cały system perfuzyjny 50 mililitrami ultraczystej wody. Pod koniec cyklu czyszczenia należy rozpocząć perfuzję w komorze rejestracyjnej z 50 mililitrami aCSF w szklanej zlewce przy stałym karbonowaniu i użyć jednorazowej pipety do przenoszenia z szeroką parążką, aby przenieść pierwszą próbkę, która ma być zobrazowana, do zlewki w celu usunięcia bibuły do soczewek.

Gdy sekcja opadnie na dno zlewki, przenieś sekcję do komory zapisu i umieść uchwyt na plasterek na plasterku, aby zminimalizować ruch wywołany przepływem perfuzji. Użyj oświetlenia w jasnym polu, aby skupić się na obszarze mózgu pod powiększeniem od 5 do 10 razy. Następnie użyj obiektywu 25-krotnego z soczewką zanurzoną w wodzie 0,35 raza, aby dostosować położenie pola widzenia.

Użyj oświetlenia fluorescencyjnego, aby zlokalizować fluorescencyjne komórki mikrogleju i wypełnić pipetę 10 mikrolitrami aCSF zawierającego interesujący nas związek w jego końcowym stężeniu. Skieruj końcówkę w dół, delikatnie potrząsając, aby usunąć wszelkie pęcherzyki powietrza uwięzione w końcówce i zamontuj napełnioną pipetę w uchwycie na pipetę podłączoną do 5-mililitrowej strzykawki, z tłokiem umieszczonym w pozycji 5-mililitrowej i zamontowanym na trójosiowym mikromanipulatorze.

Delikatnie opuść pipetę w kierunku plasterka, kontrolując i jednocześnie regulując obiektyw, aż końcówka pipety lekko dotknie powierzchni plasterka. Teraz dostrój laser i przełącz mikroskop w tryb wielofotonowy. Upewnij się, że komora jest osłonięta od wszelkich źródeł światła i włącz detektory bez deskanowania. Ustaw wzmocnienie i użyj tabeli przeglądowej z górnym limitem oznaczonym kolorami, aby uniknąć nasycenia pikseli na obrazie.

Następnie rozpocznij nagrywanie przez łączny czas co najmniej 30 minut, powoli wciskając tłok strzykawki z pozycji 5 do 1 mililitra po pięciu minutach przez okres 5 sekund, aby nałożyć związek na sekcję. W celu analizy obrazu należy najpierw wykonać projekcję Z i korekcję dryfu za pomocą ImageJ na interesującym Cię pliku. Następnie otwórz zmodyfikowany plik w Icy i narysuj okrągły obszar zainteresowania o średnicy 35 mikrometrów, wyśrodkowany nad miejscem wstrzyknięcia.

Uruchom film ponownie z ROI, aby upewnić się, że jest dobrze ustawiony. Następnie użyj wtyczki Intensity Evolution obszaru zainteresowania, aby zmierzyć średnią intensywność w czasie w obszarze zainteresowania i zapisać wyniki jako plik .xls.