Obrazowanie wapnia aktywności neuronów jelitowych i gleju w splocie mięśniowym okrężnicy myszy

Weźmy komorę obrazowania zawierającą unieruchomioną tkankę splotu mięśniowo-jelitowego okrężnicy myszy, w której znajdują się zwojowe sploty zbudowane z sieci neuronów jelitowych i komórek glejowych.

Komórki te są oznaczone wskaźnikiem wapnia, który fluoryzuje po związaniu wapnia.

Następnie umieść komorę na stoliku mikroskopu fluorescencyjnego. Perfekować komorę wstępnie podgrzanym buforem zawierającym inhibitory tłumiące skurcze mięśni podczas obrazowania.

Za pomocą mikroskopu zidentyfikuj zdrowe obszary zwojowe, które wykazują jednolitą fluorescencję.

Pozyskaj obrazy fluorescencyjne, aby zmierzyć aktywność wyjściową, zapewniając odniesienie dla wewnątrzkomórkowego poziomu wapnia.

Perfuzja tkanki za pomocą agonisty receptora w celu aktywacji receptorów neuronalnych, co powoduje wewnątrzkomórkowy napływ wapnia i wzrost intensywności fluorescencji.

Aktywacja neuronalna pośrednio stymuluje otaczające komórki glejowe, prowadząc do napływu wapnia, a następnie wzrostu fluorescencji.

Przechwytuj poklatkowe obrazy fluorescencyjne, aby mierzyć zmiany intensywności fluorescencji, które wskazują na dynamikę wapnia i aktywność sygnalizacyjną zarówno w neuronach, jak i komórkach glejowych w stosunku do poziomów wyjściowych.

Podczas inkubacji należy wykonać zmodyfikowany bufor Kreba zgodnie z instrukcjami zawartymi w pisemnej części protokołu i dodać 3 mikromolowe nikardypiny i 1 mikromolową skopolaminę, aby zahamować skurcze mięśni podczas wapnia 2 plus obrazowanie przy rozwarstwieniu całej góry. Umieść komorę rejestrującą pod mikroskopem fluorescencyjnym i za pomocą systemu perfuzji grawitacyjnej z wieloma podgrzewanymi zbiornikami strzykawki, ustanów ciągłą szybkość perfuzji od 2 do 3 mililitrów na minutę buforu Kreba o temperaturze 37 stopni Celsjusza. Upewnij się, że nie dopuścić do tworzenia się pęcherzyków powietrza w obu i przewodzie ssawnym podłączonym do odwadniacza. Ustaw ostrość żądanego splotu w świetle jasnego pola. Unikaj prześwietlania tkanki, co może prowadzić do fotowybielania.

Zbadaj obciążenie fluoroforem w zwojach nerwowych i wybierz zdrowe zwoje do obrazowania. Niezdrowe uszkodzone zwoje będą wykazywać morfologię autofluorescencji lub punktową i nie powinny być używane do obrazowania. Po wybraniu ganglionu przekieruj ścieżkę światła do kamery i uzyskaj obraz na żywo za pomocą oprogramowania do akwizycji obrazu. Upewnij się, że ganglion jest ostry i ustaw szybkość akwizycji obrazu oraz czasy ekspozycji.

Szybkość i czas pozyskiwania obrazów będą się różnić w zależności od zdarzeń, które badacze chcą zarejestrować. W przypadku większości eksperymentów obrazy są tradycyjnie uzyskiwane z częstotliwością od 0,5 do 1 herca dla komórek glejowych i do 2 do 10 Hz dla neuronów, ponieważ przejściowe stany przejściowe wapnia glejowego nie są tak szybkie, jak neurony przejściowe wapnia.

Rozpocznij zapis i ustal wyjściową aktywność fizjologiczną wybranego ganglionu przy braku bodźców eksperymentalnych przez 30 sekund. Następnie zastosuj wstępnie podgrzane leki, które Cię interesują, takie jak agoniści receptorów i antagoniści, używając systemu perfuzji grawitacyjnej z szybkością od 2 do 3 mililitrów na minutę, zgodnie ze zoptymalizowanym protokołem dla Twojego leku. Zatrzymaj nagrywanie i wyświetl film poklatkowy z eksperymentu.

Starannie wybierz obszary zainteresowania lub ROI, korzystając z odpowiedniego oprogramowania do analizy obrazu.

Na koniec użyj odpowiedniego oprogramowania do obrazowania, aby znormalizować i porównać intensywność fluorescencji obszarów zainteresowania z początkową wartością wyjściową. Zmiany znormalizowanej fluorescencji są wprost proporcjonalne do zmian wapnia.