Dwufotonowa mikroskopia holograficzna do badania aktywności neuronalnej i łączności w modelu mysim

Zacznij od obudzonej myszy umieszczonej pod dwufotonowym mikroskopem holograficznym zintegrowanym z przestrzennymi modulatorami światła lub SLM.

Mysz trzyma wstępnie wszczepioną płytę głowy.

W mózgu myszy neurony wyrażają kanały wrażliwe na światło czerwone i wskaźniki wapnia o zielonej fluorescencji, które wiążą się z jonami wapnia.

Aby zbadać aktywność neuronalną i łączność, ustaw parametry obrazowania.

Użyj lasera o długości 920 nanometrów, aby wzbudzić wskaźniki związane z wapniem w neuronach. Uchwyć obraz fluorescencyjny neuronu przy minimalnym fotouszkodzeniu.

Zresetuj parametry obrazowania i zogniskuj wiązkę lasera w bliskiej podczerwieni.

SLM kształtują wiązkę laserową w precyzyjne wzory holograficzne, które umożliwiają selektywne skupianie się na docelowych neuronach w wielu punktach.

Stymuluje to kanały światłoczułe, powoduje napływ jonów wapnia i zwiększa fluorescencję docelowych neuronów.

Aktywowane neurony docelowe przekazują sygnały do połączonych neuronów i zwiększają fluorescencję połączonego neuronu.

Ponownie uchwyć obraz z dwoma fotonami. Zwiększona fluorescencja w docelowych i połączonych neuronach potwierdza aktywność neuronalną i łączność.

Po umieszczeniu myszy pod mikroskopem i wykonaniu obrazowania dwufotonowego otwórz komercyjne oprogramowanie do obrazowania. W trybie obrazowania na żywo dostosuj napięcie detektora obrazu i moc lasera obrazującego, aby zoptymalizować jasność neuronów wyrażających GCaMP6m-P2A-ChRmine. Uchwyć obrazy neuronów wyrażających te białka, a następnie oświetl określone neurony zgodnie z procedurą pokazaną wcześniej.

Aby zbadać funkcjonalną łączność w neuronach warstwy 2 i 3, użyj przestrzennego modulatora światła do wygenerowania holograficznych wzorców stymulacji optogenetycznej. I połącz to z dwufotonowym obrazowaniem wapnia. Ustaw intensywność lasera obrazującego na 920 nanometrów przy 10 do 20 miliwatach, a pole widzenia na 256 mikrometrów na 256 mikrometrów. Mierzone na głębokości od 100 do 150 mikrometrów od powierzchni kory mózgowej.

Ustaw czas zatrzymania piksela na 1,5 mikrosekundy dla 2 Hz lub 100 nanosekund dla 30 Hz. Użyj zarówno 2 Hz, jak i 30 Hz jako liczby klatek na sekundę obrazowania, aby sprawdzić, czy pojedynczy bodziec holograficzny spowodował odpowiedź wapniową w neuronach. Ustaw intensywność lasera do stymulacji holograficznej, który stymuluje pojedynczy neuron, na 10 miliwatów, co jest wystarczające do wywołania aktywności neuronalnej.

Jednocześnie zobrazuj odpowiedź jonów wapnia na 920 nanometrach, z 10 bodźcami holograficznymi w odległości 1040 nanometrów i ośmiosekundowymi odstępami przez 50 milisekund po okresie podstawowym wynoszącym 10 sekund.