Konstrukty FSL: prosta metoda modyfikowania powierzchni komórek/wirionów za pomocą szeregu markerów biologicznych bez wpływu na ich żywotność

Ogólnym celem tej procedury jest nieszkodliwe i szybkie oznakowanie powierzchni żywych komórek lub S za pomocą bioaktywnych konstruktów. Osiąga się to poprzez przygotowanie najpierw roztworu dystansowego, lipidowego lub konstruktu FSL. Następnie równą część roztworu konstruktu miesza się z równą częścią roztworu komórek lub VIR.

W trzecim etapie mieszaninę inkubuje się przez 60 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Ostatnim krokiem jest umycie zmodyfikowanych komórek lub cytów lub zmodyfikowanych VIR-ów lub VIR-ów i użycie ich eksperymentalnie jak zwykle. Ostatecznie, zmodyfikowane powierzchniowo żywe komórki lub S można wizualizować za pomocą wszystkich rutynowych technik analizy eksperymentalnej, w tym cytometrii przepływowej, mikroskopii i aglutynacji.

Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak znakowanie kowalencyjne, jest to, że jest szybka, solidna, elastyczna i nie wpływa na żywotność zmodyfikowanej komórki lub Variana. Aby przygotować roztwór podstawowy FSL, najpierw dodaj jeden mililitr rozcieńczalnika do pliku produktu, aby rozpuścić suchy produkt FSL, tworząc jeden miligram na mililitr roztworu podstawowego. Poddaj fiolkę sonifikacji przez 30 sekund, przelej bulion do sterylnych pojemników o pojemności 100 mikrolitrów i przechowuj pojemniki w temperaturze od dwóch do ośmiu stopni Celsjusza przez okres do jednego tygodnia.

Aby przygotować działające roztwory konstruktu FSL do wprowadzenia tuż przed użyciem, należy ponownie sonikować roztwór przez 30 sekund w celu homogenizacji wszelkich komórek mis, a następnie rozcieńczyć konstrukt FSL i bufor do wymaganego stężenia. Roztwór roboczy należy przechowywać w temperaturze od dwóch do ośmiu stopni Celsjusza przez okres do tygodnia po zawieszeniu leku Resus w pożywce bezlipidowej lub odwirować komórki PBS w celu modyfikacji FSL wolnej od niezwiązanych lipidów. Następnie zapakuj komórki w 100 mikrolitrów rozcieńczalnika, umyj komórki do kontroli w tych samych warunkach do 100 mikrolitrów niezmodyfikowanych komórek.

W razie potrzeby dodać 100 mikrolitrów odpowiedniego rozcieńczenia roztworu FSL. Równolegle należy również utworzyć kontrole ujemne za pomocą niepowiązanych rozwiązań FSL i/lub PBS. Następnie inkubuj wszystkie podzbiory komórek przez godzinę w temperaturze 37 stopni Celsjusza po inkubacji.

Przemyć wszystkie komórki dwukrotnie pożywką bezlipidową lub PBS w celu usunięcia wszelkich wolnych konstruktów FSL i przygotować odpowiednią zawiesinę w pożywce bezlipidowej. Po zakończeniu procesu modyfikacji FSL coys mogą być przechowywane w temperaturze od czterech do ośmiu stopni Celsjusza jak kwiat. Konstrukty FSL składają się z trzech głównych elementów, funkcjonalnej głowy lub F, które mogą być różnymi biologicznie funkcjonalnymi grupami.

Przekładka RS zaprojektowana w celu wywołania odstępu między funkcjonalną głowicą a membraną w celu poprawy dyspersji wodnej i niereaktywności z ludzką surowicą i lipidem DAL lub L, co pozwala konstruktowi na spontaniczne włączenie się do powierzchni czwartej. Reprezentatywne grupy FSL są pokazane na poniższych pięciu obrazach. Żywe mysie zarodki były bezpośrednio znakowane fluoresceiną FSL przez dwie godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza w pożywce do hodowli komórek wolnych od surowicy, przemyte, a następnie oglądane pod mikroskopią fluorescencyjną.

Na tym pierwszym zdjęciu można zobaczyć dwukomórkowy zarodek lustrzany wolny od zop palita. Intensywne barwienie w środku zarodka jest reprezentatywne dla klasycznego barwienia ciała polarnego. Na następnych dwóch obrazach pokazano tutaj cztery komórki wolne od zop palita i osiem komórek lustrzanych zarodków, które wykazują cieniste zabarwienie komórek, które znajdują się poza mikroskopem P ostrości.

Obraz 16-komórkowego zarodka lustrzanego wolnego od zop palita jest pokazany na tym ostatnim zdjęciu żywych zarodków lustrzanych oznaczonych fluoresceiną FSL, czterodniowych do pięciu dni, nienaruszonych zarodków lustrzanych z zarodkami oznaczonymi zarówno zarodkiem, jak i zop LUCITA, są pokazane w następnej serii obrazów. Pokazano znakowanie fluoresceiną FSL danio pręgowanego. Ten pierwszy obraz przedstawia mikroangiografię larw danio pręgowanego po 52 godzinach od zapłodnienia, którym fluoresceina FSL została bezpośrednio wstrzyknięta do krążenia.

Można tu zaobserwować barwienie układu krwionośnego danio pręgowanego. FSL fluoresceina, heterogeniczne komórki tkanki nerki danio pręgowanego lub cyty ZK zostały stworzone ex vivo, a następnie mikrowstrzyknięte do krążenia biorcy danio pręgowanego 52 godziny po zapłodnieniu Obserwacje in vivo cytów ZK przeprowadzono dwie godziny po wstrzyknięciu poprzez obrazowanie naczyń krwionośnych pod wpływem fluorescencji za pomocą mikroskopii poklatkowej, pokazano pojedynczą klatkę wideo z dużymi wolno poruszającymi się lub nieruchomymi komórkami oznaczonymi pomarańczowymi strzałkami i szybko poruszającymi się komórkami, które wydawały się rozmyte ze względu na ich ruch oznaczony zielonymi strzałkami. Na tym obrazie pokazano znakowanie fluoresceiną FSL przez doustne pobieranie konstruktu uzyskane przez zanurzenie zarodków danio pręgowanego i pożywki zawierającej fluoresceinę FSL przez okres do pięciu dni.

Mikroskopia w jasnym polu zebry pręgowanego poddanego działaniu fluoresceiny FSL po lewej stronie odpowiada sąsiedniemu obrazowi fluorescencyjnemu po prawej. Fluorescencja była preferencyjnie zlokalizowana w przewodzie pokarmowym. Nie zaobserwowano barwienia w pokazanych tutaj nieleczonych zarodkach kontrolnych.

Tutaj wirus pęcherzykowego zapalenia jamy ustnej lub VSV bezpośrednio znakowany 10 mikrogramami na mililitr fluoresceiny FSL przez dwie godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza, a następnie utrwalanie 4% aldehydem paraformowym, a następnie analiza za pomocą skanu faktów nie wykazała oczyszczenia VSV vir. Wymagane było oznakowanie po FSL. Ten histogram pokazuje komórki jąder świń zakażone ludzkimi A, Puerto Rico 8, 19, 34 lub H, jednym N, jednym VIR-ami znakowanymi fluoresceiną FSL.

Niefluoryzujące niezakażone komórki są reprezentowane przez czarną linię, podczas gdy fuzja H jeden N jeden korona z komórkami świń, która spowodowała fluorescencję, jest oznaczona czerwoną linią. W tej następnej serii obrazów komórki były najpierw znakowane biotyną FSL przez godzinę w temperaturze 37 stopni Celsjusza, następnie myte i reagowane z awadonem znakowanym fluorem cztery, a następnie umyte i zamontowane na mokro do mikroskopii fluorescencyjnej. Pierwszy obraz przedstawia skompilowany obraz konfokalny asysty blastów zarodka myszy, a ten rysunek pokazuje centralny konfokalny wycinek zarodka z poprzedniego obrazu.

Oto żywe ruchliwe ludzkie perm zoa. Rozmycie następuje w wyniku ich ruchu. Bardziej wyraźny reprezentatywny obraz ludzkich plemników utrwalonych w aldehydzie 4% Paraform po insercji można zobaczyć na tym rysunku tutaj.

Pokazano, że ludzkie erytrocyty znakowane biotyną FSL są utrwalone za pomocą 4% insercji aldehydu paraform, nie wpływa na znakowanie FSL, jak pokazano na poniższych dwóch rysunkach, można zaobserwować 4% stałe ludzkie komórki raka endometrium RL 95. Natomiast na tym obrazie ludzkie komórki raka endometrium RL 95 nie są unieruchomione. Praktycznie nie obserwuje się różnic w etykietowaniu między tymi dwoma obrazami z fiksacją lub bez.

Cyty RBC znakowane biotyną FSL obserwowane w próbce krwi pobranej dwie godziny po dożylnym wlewie cytów pokazano tutaj po lewej stronie, komórki oglądano pod mikroskopem świetlnym po prawej, to samo pole komórek oglądano pod fluorescencją, a dwa obecne cyty można zidentyfikować na zielono. Obliczanie stosunku cytów do komórek nieznakowanych może być wykorzystane jako wskaźnik przeżycia. Ten ostatni obraz komórki znakowanej biotyną FSL pokazuje żywe ludzkie cyty biotyny endometrium, które zostały uwidocznione przez wiązanie się ze zmniejszonymi kulkami.

Ta ostatnia seria zdjęć pokazuje interakcje konstruktu FSL z markerami grup krwi. Pierwszy obraz przedstawia ludzkie cyty GLI krwinek czerwonych pokryte stężeniem FSLG 500 mikrogramów na mililitr testowanym w porównaniu z rozcieńczeniami ludzkiej surowicy. Ludzkie krwinki czerwone nie reagują naturalnie z antygenem Xena antygenem GALI.

W związku z tym cyty mogą być wykorzystywane do ilościowego określania poziomu przeciwciał w surowicy. W tym przykładzie stwierdzono, że pacjent ma miano antygi od jednego do 32, tworząc cyty o malejącym poziomie FSL. Podobnie jak w przypadku tworzenia miana antygenu, można określić optymalny poziom antygenu do wykrywania przeciwciał, komórki można tworzyć tak, aby dawały pozytywny wynik tylko wtedy, gdy poziom przeciwciał przekroczy określone miano.

Poziom antygenu FSL wymagany do uzyskania wyniku dodatniego zależy od jakości i poziomu wykrywanych przeciwciał. Zazwyczaj w przypadku antygenów węglowodanowych roztwór FSL o stężeniu 100 mikrogramów na mililitr spowoduje silną reakcję dodatnią. Ludzkie krwinki czerwone grupy O zmodyfikowane tak, aby miały określony poziom antygenu lub tzw. standaryzowane.

Cyty A są wykorzystywane do dokładnego i powtarzalnego oznaczania ilościowego antya w ludzkiej surowicy. W tym przykładzie cyty przygotowano z własnych krwinek czerwonych dawcy i stwierdzono, że poziom antya w badanej surowicy grupy O wynosi od 1 do 32. Pokazane tutaj w szóstej probówce antygeny grupy krwi A i B jednocześnie wprowadzone do pojedynczej próbki czerwonych krwinek grupy O zostały użyte do stworzenia cytów tygodnia B.

Cyty te mogą być wykorzystywane do celów kontroli jakości VO. Analiza specjalnie opracowanych cytów tygodniowych, B testowanych pod kątem odczynników antya i anty B daje oczekiwane słabe reakcje, jak pokazano na tym rysunku z reakcjami zachodzącymi w środkowej dolnej części probówek. Tę prostą technikę można wykonać w dwie godziny, jeśli zostanie wykonana prawidłowo.