Name: Konstrukty FSL: prosta metoda modyfikowania powierzchni komórek/wirionów za pomocą szeregu markerów biologicznych bez wpływu na ich żywotność (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-08-05T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 38 s
Description: Poznaj metodę modyfikacji powierzchni żywych komórek i wirionów za pomocą konstruktów FSL bez wpływu na ich żywotność. Technika ta umożliwia szybkie i bezpieczne etykietowanie komórek do badań biologicznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Autorzy dziękują Danowi Bessowi z firmy Sigma-Aldrich za prezentację materiału wideo. Dziękujemy również Donowi Branchowi, Evgenii Cherny, Scottowi Chesli, Elizabeth Hadac, Amandzie Harrison, Damienowi Heathcote, Annice Hult, Chuan-Ching Lan, Susannah McIntosh, Sarvani Komarraju, Elenie Korchaginie, Caroline Oliver, Martinowi Olssonowi, Stephenowi Parkerowi, Igorowi Rodinovowi, Aleksandrowi Tuzikovowi oraz Eleanor Williams za uzyskane wyniki oraz wkład w projektowanie i syntezę konstruktów FSL oraz określenie ich aktywności biologicznej.

Poniższy protokół opisuje ogólną procedurę wprowadzania konstruktów FSL (Rysunek 1) do błon biologicznych. Dla uproszczenia w protokole odniesiono się wyłącznie do komórek (kodecytów) w stężeniu 100%. Jednakże termin komórki można zastąpić wirionami (kodewirionami), organizmami lub strukturami komórkowymi, a ich stężenie w rozcieńczalniku nie ma znaczenia, o ile pozostaje ono stałe pomiędzy testami, kontrolami i eksperymentami. W przypadku erytrocytów objętość skumulowanych krwinek wynosi zazwyczaj 80%, natomiast w przypadku wirionów, embrionów i innych komórek jest ona zazwyczaj mniejsza niż 1%. Metoda ta jest bardzo odporna i pozwoli na otrzymanie zmodyfikowanych błon przy zastosowaniu dowolnego z jej wariantów, jednak wymagana będzie optymalizacja w celu ustandaryzowania stopnia modyfikacji niezbędnego dla konkretnych zastosowań.
1. Przygotowanie konstruktów FSL
<ol>
	<li>Aby przygotować roztwór zapasowy konstruktu FSL, należy najpierw zrekonstytuować suchy produkt FSL (Tabela 1), dodając 1,0 mL rozcieńczalnika (lub zgodnie z instrukcją dołączoną do produktu) do fiolki z produktem. Następnie krótko sonikować (30 sekund). W ten sposób zostanie przygotowany roztwór o stężeniu 1 mg/mL, który można podzielić na alikwoty po 100 μL do sterylnych pojemników i przechowywać w temperaturze 2-8°C do jednego tygodnia lub zamrozić na okres do 3 miesięcy.</li>
	<li>Aby przygotować robocze roztwory konstruktu FSL do insercji, bezpośrednio przed użyciem należy krótko sonikować (30 sekund) roztwór zapasowy w celu homogenizacji miceli. Konstrukt FSL należy rozcieńczyć w buforze (najlepiej nie zawierającym lipidów ani materiałów silnie hydrofobowych) do wymaganego stężenia lub do pożądanego zakresu stężeń.</li>
</ol>
Uwagi:
<ol>
	<li>Konstrukty FSL zazwyczaj wbudowują się w komórki w mediach zawierających lipidy, ale zazwyczaj wymagają nawet 50-krotnie wyższych roboczych stężeń FSL niż w przypadku PBS lub innych mediów wolnych od lipidów.</li>
	<li>Zakres rozcieńczeń roboczych zależy od zastosowania, czułości metody detekcji, rodzaju konstruktu FSL oraz wymaganego stopnia modyfikacji. Zazwyczaj zakres rozcieńczeń wynosi od 10-500 μg FSL na mL rozcieńczalnika dla węglowodanowych konstruktów FSL oraz 1-100 μg/mL dla innych konstruktów FSL, takich jak fluorofory i biotyna.</li>
	<li>W przypadku przygotowywania rozcieczalników do wbudowywania zawierających wiele konstruktów FSL, należy po prostu dodać konstrukty do tego samego rozcieczalnika w ich normalnych stężeniach roboczych. Jeśli jeden konstrukt znajduje się w znacznie wyższym stężeniu niż inny, może być wymagana pewna korekta (zwiększenie) stężenia konstruktu o niższym stężeniu. Alternatywnie konstrukty można dodawać sekwencyjnie, najlepiej zaczynając od konstruktu o najwyższym stężeniu, a następnie dodając pozostałe.</li>
	<li>Stężenia konstruktów FSL powyżej 1000 μg/mL mogą wprowadzić znaczące ilości lipidów do błony komórkowej, co może zmienić kształt komórki lub zwiększyć jej podatność na lizę.</li>
	<li>Robocze roztwory konstruktów FSL należy przechowywać w temperaturze 2-8°C i zużyć w ciągu kilku dni.</li>
	<li>Konstrukty FSL można rozcieńczać w wodzie, jednak ich stabilność będzie ograniczona i muszą one zostać zużyte w ciągu kilku godzin. Jeśli ulotka dołączona do opakowania określa wodę jako rozcieczalnik do rekonstytucji, produkt w fiolce będzie zawierał również sole (zgodnie z informacją w ulotce).</li>
</ol>
2. Wprowadzanie konstruktu(ów) FSL do błon
<ol>
	<li>W pierwszej kolejności należy wyprać komórki przeznaczone do modyfikacji FSL, aby usunąć niezwiązane lipidy, stosując wirowanie oraz PBS lub bezlipidowe medium komórkowe jako roztwór do płukania.</li>
	<li>Należy upakować komórki lub zawiesić je w 100 μL rozcieńczalnika.</li>
	<li>Równocześnie należy przygotować kontrole, którymi w idealnym przypadku powinny być zarówno komórki niemodyfikowane (inkubowane z PBS zamiast roztworu FSL), jak i/lub komórki zmodyfikowane łagodnym, ale pokrewnym konstruktem FSL.</li>
	<li>Do komórek należy dodać 100 μL odpowiedniego rozcieńczenia roztworu FSL (zawierającego jeden lub więcej konstruktów FSL) i inkubować przez 1-2 godziny w temperaturze 37°C. Podobny wynik można uzyskać poprzez 6-godzinną inkubację w 25°C lub inkubację nocną (18 godzin) w 4°C – w przypadku stosowania gęstych zawiesin komórkowych zaleca się mieszanie co kilka godzin.</li>
	<li>Opcjonalnie należy dwukrotnie wyprać komórki za pomocą PBS lub medium, aby usunąć wszelkie wolne konstrukty FSL, a następnie przygotować odpowiednią zawiesinę.</li>
</ol>
Uwagi:
<ol>
	<li>Rozcieńczalnik używany do zawieszenia komórek może być pożywką do hodowli komórkowej, PBS, roztworami do przechowywania komórek itp., jednak najlepiej, aby nie zawierał lipidów (np. płodowej surowicy cielęcej) ani detergentów (np. TWEEN).</li>
	<li>Można zastosować inne objętości (niż 100 μL), stosunki (niż 1:1 komórki/roztwór FSL) lub inne warunki inkubacji pod względem czasu i temperatury, pod warunkiem zachowania tego samego stosunku, stężenia i objętości w celu uzyskania powtarzalnych wyników.</li>
</ol>
3. Praca z próbkami i wizualizacja
<ol>
	<li>Po zakończeniu procesu modyfikacji FSL kodecyty można przechowywać w temperaturze 4-8°C w mediach wolnych od lipidów lub poddać dalszej analizie. </li>
	<li>Kodecyty i kodewiriony zazwyczaj zachowują się tak samo jak niemodyfikowane komórki/wiriony i mogą być przetwarzane oraz analizowane w standardowych systemach badawczych (mikroskopia, serologia, cytometria przepływowa itp.). Zazwyczaj nie mają one specjalnych wymagań, z wyjątkiem unikania rozpuszczalników/detergentów/lipidów, które mogłyby spowodować eluowanie konstruktów lipidowych z błon.</li>
</ol>
Uwagi:
<ol>
	<li>Konstrukty pozostaną w błonie nieaktywnych komórek, takich jak erytrocyty, jeżeli będą przechowywane w mediach wolnych od lipidów przez czas życia komórki. W komórkach o aktywnych błonach konstrukty zostaną zinternalizowane i zmetabolizowane w tempie zależnym od aktywności błony komórkowej. </li>
	<li>Martwe komórki zazwyczaj zawierają wysokie poziomy konstruktów FSL; można to wykorzystać do oddzielenia komórek nieżywotnych od żywotnych. </li>
	<li>Jeśli kodecyty są przechowywane (lub stosowane in vivo) w mediach/środowiskach zawierających lipidy, takich jak surowica/osocze, konstrukt będzie powoli eluował z błony w ciągu wielu godzin lub dni, w zależności od temperatury oraz stężeń i składu lipidów. </li>
</ol>
4. Reprezentatywne wyniki:
<ol>
	<li>Poniższe reprezentatywne wyniki zależą od zastosowanego konstruktu (Tabela 1), jego stężenia wstawionego oraz względnej czułości i swoistości systemu(ów) detekcji. Generalnie wszystkie konstrukty FSL zostaną wstawione do komórek po 1 godzinie, jednak dla każdej sytuacji należy ustalić optymalne warunki.</li>
	<li>Konstrukty FSL mogą być wykorzystywane do znakowania powierzchni różnych żywych komórek3-9,11,14. W przykładach przedstawionych na Rysunku 2 wykorzystano embriony na różnych etapach rozwoju (ponieważ są one kruchymi komórkami), ale można również znakować inne komórki (Rysunek 3) lub wiriony otoczkowe (Rysunek 4). FSL-Fluoresceina umożliwia bezpośrednie znakowanie powierzchni (Rysunki 2-4), natomiast FSL-biotyna i inne konstrukty FSL mogą wymagać zastosowania wtórnego systemu detekcji (zazwyczaj awidyny/przeciwciał/lektyn), aby wykazać ich obecność (Rysunki 5).</li>
	<li>Markery grup krwi o swoistości ludzkiej lub zwierzęcej mogą być przyłączane do komórek, w tym do erytrocytów4-9 (Rysunek 6). Ponieważ ilość konstruktu FSL na kodecycie jest kontrolowalna i powtarzalna4-6, można tworzyć kodecyty do oznaczania ilości przeciwciał (Tabela 2 i Rysunek 6). Rzeczywiste źródło komórek nie jest istotne; mogą one pochodzić od dowolnego gatunku, a nawet z tego samego źródła co przeciwciała, co zapewnia, że jedynym niekompatybilnym antygenem jest ten wprowadzony przez FSL7,8 (Rysunek 6).</li>
</ol>
<img src="/files/ftp_upload/3289/3289table2.jpg" alt="Wyniki testu kodecytów FSL-A(tri) w serii rozcieńczeń przeciwciał monoklonalnych anty-A, format tabeli, analiza danych." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Tabela 2"> 
Tabela 2. Reprezentatywne reakcje serologiczne trzech różnych kodecytów erytrocytarnych FSL-A(tri) przebadanych z rozcieńczeniami przeciwciał monoklonalnych anty-A. Roztwór FSL-A(tri) o stężeniu 50 μM po inkubacji z równą objętością erytrocytów grupy O wytworzył komórki silnie dodatnie pod względem antygenu A, które można było wykryć przy rozcieńczeniu przeciwciał monoklonalnych anty-A w stosunku 1:512. Roztwory FSL-A(tri) o stężeniu 5- i 10-krotnie niższym wytworzyły kodecyty o słabszej ekspresji antygenu grupy krwi A.
<img src="/files/ftp_upload/3289/3289fig1.jpg" alt="Schemat struktury chemicznej; relacja funkcji przekładki lipidowej w biologii roślin" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Przegląd konstrukcji FSL"> 
Rycina 1. Przegląd konstrukcji FSL. Podobnie jak kwiat, konstrukcje FSL składają się z trzech głównych elementów. Głowa funkcjonalna (F) w przypadku konstrukcji FSL może stanowić szereg różnych grup biologicznie czynnych; przekładka (S) jest zaprojektowana tak, aby oddalić F od błony, poprawić rozpuszczalność w wodzie i być nieaktywna w obecności surowicy, natomiast lipid diacylowy umożliwia spontaniczne wbudowywanie się konstrukcji w powierzchnie. (I) FSL-GB3 z epitopem trisacharydowym grupy krwi Gb3 (lub Pk) Galα4Galβ4Glcβ. (II) FSL-A(tri) z epitopem trisacharydowym grupy krwi A GalNAcα3(Fucα2)Galβ. (III) FSL-Fluoresceina. (IV) FSL-biotyna z pojedynczą grupą F biotyny. Grupy funkcjonalne w strukturach I-III są sprzężone z aktywowaną pochodną adipianu dioleofilofosfatydyloetanolaminy (DOPE), natomiast przekładka w strukturze IV opiera się na adipianie karboksymetyloglicyny.
<img src="/files/ftp_upload/3289/3289fig2.jpg" alt="Mikroskopia fluorescencyjna etapów podziału komórek zygoty; mitoza komórkowa, biologia rozwoju." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Znakowane fluoresceiną FSL zarodki mysie"> 
Rysunek 2. Znakowane fluoresceiną FSL zarodki mysie. Wszystkie obrazy przedstawiają żywe zarodki, które zostały znakowane w stanie nienaruszonej błony przejrzystej (ZP) (tzn. konstrukt FSL przeniknął przez ZP, aby oznakować znajdujący się wewnątrz zarodek). Obrazy I-IV przedstawiają zarodki pozbawione ZP, uwolnione z błony przejrzystej za pomocą kwasowego roztworu Tyrode'a po znakowaniu fluoresceiną FSL. Identyczne barwienie występuje niezależnie od tego, czy zarodki modyfikowano FSL przy nienaruszonej ZP, czy po jej usunięciu. Zarodki znakowano bezpośrednio fluoresceiną FSL metodą 2-godzinną w 37°C w bezzerowym medium hodowlanym, przemywano, a następnie badano pod mikroskopem fluorescencyjnym. (I) Pozbawiony ZP dwukomórkowy zarodek mysi, wykazujący również klasyczne intensywne barwienie ciałek polarnych. (II-III) Pozbawione ZP czterokomórkowy i ośmiokomórkowy zarodek mysi, oba wykazujące cień barwienia komórek znajdujących się poza płaszczyzną ostrości mikroskopu. (IV) Pozbawiony ZP 16-komórkowy zarodek mysi. (V) Zarodki mysie w stadium blastocysty (d4-d5) z nienaruszoną ZP, gdzie zarówno zarodek, jak i błona przejrzysta są znakowane.
<img src="/files/ftp_upload/3289/3289fig3.jpg" alt="Mikroskopia fluorescencyjna danio pręgowanego; ekspresja GFP w tkankach; eksperymentalna seria obrazów." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="FSL-Fluoresceina i danio pręgowany"> 
Rysunek 3. FSL-Fluoresceina i danio pręgowany14. (I) Mikroangiografia larwy danio pręgowanego w 52 hpf (godziny po zapłodnieniu), po bezpośrednim wstrzyknięciu FSL-Fluoresceiny do krwiobiegu. Układ naczyniowy danio pręgowanego jest zabarwiony. (II) Heterogeniczne komórki tkanki nerkowej danio pręgowanego (ZK kodecyty) z FSL-Fluoresceiną zostały stworzone ex vivo, a następnie mikroiniekcyjne podano do krwiobiegu biorcy danio pręgowanego w 52 hpf. Obserwacje in vivo ZK kodecytów przeprowadzono 2 godziny po iniekcji, obrazując naczynia krwionośne w świetle fluorescencyjnym za pomocą mikroskopii time-lapse. Przedstawiono pojedynczą klatkę wideo z dużymi, wolno poruszającymi się lub nieruchomymi komórkami (oznaczonymi pomarańczowymi strzałkami) oraz komórkami szybko poruszającymi się (rozmyte obrazy z powodu ruchu – oznaczone zielonymi strzałkami). Znakowanie umożliwia obserwację in vivo w czasie rzeczywistym zachowania i biodystrybucji ZK kodecytów. (III) Pobranie doustne FSL-Fluoresceiny osiągnięto poprzez zanurzenie embrionów danio pręgowanego w pożywce zawierającej FSL-Fluoresceinę przez maksymalnie 5 dni. Płukanie zrealizowano poprzez przeniesienie embrionów do pożywki niezawierającej konstruktów FSL (wymagane jest co najmniej 6 godzin, ale proces ten może trwać kilka dni). (IIIa) Mikroskopia w polu jasnym danio pręgowanego traktowanego FSL-Fluoresceiną, odpowiadająca sąsiedniemu obrazowi fluorescencyjnemu (IIIb). Fluorescencja była zlokalizowana preferencyjnie w przewodzie pokarmowym. Nie zaobserwowano zabarwienia w nieleczonych embrionach kontrolnych (IVa i IVb).
<img src="/files/ftp_upload/3289/3289fig4.jpg" alt="Wykresy cytometrii przepływowej fluorescencji wirionów i komórek, porównujące VSV, kodewiriony i efekty infekcji." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Znakowanie wirionów fluoresceiną FSL"> 
Rycina 4. Znakowanie wirionów10 VSV i H1N1 fluoresceiną FSL. (I) Wirus zapalenia pęcherzykowego jamy ustnej (VSV) został bezpośrednio znakowany 10 μg/ml fluoresceiny FSL przez 2 h w 37°C, a następnie utrwalony 4% paraformaldehydem i poddany cytometrii przepływowej. Po znakowaniu FSL nie było konieczne oczyszczanie kodewirionu VSV. (II) Cytometria przepływowa komórek jąder świni zainfekowanych kodewirionami ludzkiego wirusa A/Puerto Rico/8/1934 (H1N1) znakowanymi fluoresceiną FSL. Komórki niezainfekowane są reprezentowane przez czarną linię, natomiast fuzja kodewirionu H1N1 z komórkami ST skutkuje powstaniem komórki fluorescencyjnej (czerwona linia).
<img src="/files/ftp_upload/3289/3289fig5.jpg" alt="Etapy podziału komórki w mikroskopii fluorescencyjnej, schemat faz mitozy, eksperyment biologiczny." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Komórki znakowane FSL-biotyną"> 
Rysunek 5. Komórki znakowane FSL-biotyną i ich późniejsza wizualizacja za pomocą znakowanej awidyny7,8. Wszystkie komórki zostały najpierw znakowane FSL-biotyną przez 1 h w 37°C, przemyte, a następnie poddane reakcji z awidyną znakowaną fluorophorem, przemyte i zamontowane na mokro do mikroskopii fluorescencyjnej. (I) Złożony obraz konfokalny blastocysty zarodka mysiego. (II) Centralny przekrój konfokalny zarodka z poprzedniego obrazu. (III) Żywe, ruchome plemniki ludzkie – rozmycie wynika z ich ruchu. (IV) Utrwalone (4% paraformaldehydu po insercji) plemniki ludzkie. (V) Erytrocyt ludzki. (VI) Utrwalona (4% paraformaldehydu przed insercją) ludzka linia raka endometrium RL95. (VII) Nieutrwalona ludzka linia raka endometrium RL95. (VIII) Biotynowe kodecyty RBC zaobserwowane w próbce krwi pobranej 2 godziny po dożylnej infuzji kodecytów, gdzie (VIIIa) przedstawia pole widzenia w mikroskopii świetlnej, a (VIIIb) to to samo pole widzenia w fluorescencji, identyfikujące dwa kodecyty obecne w polu widzenia. Obliczenie stosunku kodecytów do nieznakowanych komórek może służyć jako wskaźnik przeżywalności. (IX) Żywe ludzkie biotynowe kodecyty endometrium wizualizowane poprzez wiązanie z kuleczkami awidynyl化した.
<img src="/files/ftp_upload/3289/3289fig6.jpg" alt="Wyniki testu reakcji antygen-przeciwciało we krwi, rozcieńczenie surowicy i oznaczenie FSL-Lea w fiolkach." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Węglowodany FSL do dodawania markerów grup krwi w celu profilowania serologicznego"> 
Rysunek 6. Węglowodany FSL do dodawania markerów grup krwi w celu profilowania serologicznego. (I) Ludzkie erytrocyty-kodecyty Galili zostały utworzone z ustalonym stężeniem FSL-Galili (500 μg/mL) i przetestowane przeciwko rozcieńczeniom ludzkiej surowicy. W ludzkich erytrocytach naturalnie nie występuje ksenoantygen Galili. Takie kodecyty mogą być wykorzystane do ilościowego oznaczenia poziomu przeciwciał w surowicy. W tym przykładzie ustalono, że dawca ma miano anty-Galili wynoszące 1:32. (II) Poprzez tworzenie kodecytów z malejącymi poziomami FSL („miana antygenów”), można określić optymalny poziom antygenu do wykrywania przeciwciał (w tym przykładzie Lea). Komórki mogą być tworzone tak, aby dawały wynik dodatni tylko wtedy, gdy poziom przeciwciał przekracza określone miano. Poziom antygenu FSL wymagany do uzyskania wyniku dodatniego zależy od jakości i poziomu wykrywanych przeciwciał. W przypadku antygenów węglowodanowych, roztwór FSL o stężeniu 100 μg/mL zazwyczaj skutkuje silną reakcją dodatnią. (III) Ludzkie erytrocyty grupy O zostały zmodyfikowane tak, aby posiadały określony poziom antygenu A (standardowe kodecyty A), i wykorzystane do dokładnego i powtarzalnego ilościowego oznaczenia anty-A w ludzkiej surowicy. W tym przykładzie miano anty-A w badanej surowicy grupy O wynosi 1:32, a kodecyty zostały przygotowane z własnych erytrocytów dawcy. (IV) Antygeny grup krwi A i B wprowadzane jednocześnie do jednej próbki ludzkich erytrocytów grupy O są wykorzystywane do tworzenia kodecytów AweakBweak. Kodecyty te mogą być stosowane do kontroli jakości układu ABO. Wynik ten przedstawia analizę specjalnie sformułowanego kodecytu AweakBweak przetestowanego przeciwko odczynnikom anty-A i anty-B, co daje oczekiwane słabe reakcje.

<ol><li>Waehler, R., Russell, S. J., Curiel, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+targeted+viral+vectors+for+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Genet%22%5BJournal%5D)">Engineering targeted viral vectors for gene therapy.</a> Nat. Rev. Genet. 8, 573-587 (2007).</li>
<li>Strable, E., Finn, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+modification+of+viruses+and+virus-like+particles%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Top.+Microbiol.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Chemical modification of viruses and virus-like particles.</a> Curr. Top. Microbiol. Immunol. 327, 1-21 (2009).</li>
<li>Henry, S., Bovin, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+development+of+synthetic+peptidolipids%2C+glycolipids+and+other+lipid-linked+structures+to+create+designer+red+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Transfusion%22%5BJournal%5D)">The development of synthetic peptidolipids, glycolipids and other lipid-linked structures to create designer red cells.</a> Transfusion. 48, Suppl 2S. 194A-194A (2008).</li>
<li>Frame, T., Carroll, T., Korchagina, E., Bovin, N., Henry, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic+glycolipid+modification+of+red+blood+cell+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Transfusion%22%5BJournal%5D)">Synthetic glycolipid modification of red blood cell membranes.</a> Transfusion. 47, 876-882 (2007).</li>
<li>Hult, A. K., Frame, T., Henry, S., Olsson, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometry+evaluation+of+red+blood+cells+transformed+with+variable+amounts+of+synthetic+A+and+B+glycolipids%5BTitle%5D)+AND+%22Vox+Sang%22%5BJournal%5D)">Flow cytometry evaluation of red blood cells transformed with variable amounts of synthetic A and B glycolipids.</a> Vox Sang. 95, Suppl 1. 180-180 (2008).</li>
<li>Henry, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modification+of+red+blood+cells+for+laboratory+quality+control+use%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Hematol%22%5BJournal%5D)">Modification of red blood cells for laboratory quality control use.</a> Curr. Opin. Hematol. 16, 467-472 (2009).</li>
<li>Oliver, C., Blake, D., Henry, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+neutralization+of+anti-A+and+successful+transfusion+of+A+antigen+incompatible+red+cells+in+an+animal+model%5BTitle%5D)+AND+%22Transfusion%22%5BJournal%5D)">In vivo neutralization of anti-A and successful transfusion of A antigen incompatible red cells in an animal model.</a> Transfusion. , Forthcoming (2011).</li>
<li>Oliver, C., Blake, D., Henry, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+transfusion+reactions+and+predicting+in+vivo+cell+survival+with+kodecytes%5BTitle%5D)+AND+%22Transfusion%22%5BJournal%5D)">Modeling transfusion reactions and predicting in vivo cell survival with kodecytes.</a> Transfusion. , Forthcoming (2011).</li>
<li>Heathcote, D., Carroll, T., Wang, J. J., Flower, R., Rodionov, I., Tuzikov, A., Bovin, N., Henry, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+antibody+screening+cells%2C+MUT%2BMur+kodecytes%2C+created+by+attaching+peptides+onto+erythrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Transfusion%22%5BJournal%5D)">Novel antibody screening cells, MUT+Mur kodecytes, created by attaching peptides onto erythrocytes.</a> Transfusion. 50, 635-641 (2010).</li>
<li>Hadac, E. M., Federspiel, M. J., Chernyy, E., Tuzikovb, A., Korchagina, E., Bovin, N. V., Russell, S. J., Henry, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescein+and+radiolabeled+Function-Spacer-Lipid+constructs+allow+for+simple+in+vitro+and+in+vivo+bioimaging+of+enveloped+virions%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol+Meth%22%5BJournal%5D)">Fluorescein and radiolabeled Function-Spacer-Lipid constructs allow for simple in vitro and in vivo bioimaging of enveloped virions.</a> J Virol Meth. 10, Forthcoming (2011).</li>
<li>Blake, D., Lan, A., Love, D., Bovin, N., Henry, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorophore-kodecytes+-+fluorescent+function-spacer-lipid+%28FSL%29+modified+cells+for+in+vitro+and+in+vivo+analyses%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+J.%22%5BJournal%5D)">Fluorophore-kodecytes - fluorescent function-spacer-lipid (FSL) modified cells for in vitro and in vivo analyses.</a> FEBS J.. 277, Suppl 1. 199-199 (2010).</li>
<li>Harrison, A. L., Olsson, M. L., Brad Jones, R., Ramkumar, S., Sakac, D., Binnington, B., Henry, S., Lingwood, C. A., Branch, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+synthetic+globotriaosylceramide+analogue+inhibits+HIV-1+infection+in+vitro+by+two+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Glycobiology%22%5BJournal%5D)">A synthetic globotriaosylceramide analogue inhibits HIV-1 infection in vitro by two mechanisms.</a> Glycobiology. 27, 515-524 (2010).</li>
<li>Barr, K., Diegel, O., Parker, S., Bovin, N., Henry, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Function-Spacer-Lipid+%28FSL%29+constructs+enable+inkjet+printing+of+blood+group+antigens%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+J%22%5BJournal%5D)">Function-Spacer-Lipid (FSL) constructs enable inkjet printing of blood group antigens.</a> FEBS J. 277, Suppl 1. 235-235 (2010).</li>
<li>Lan, C. -C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Modeling+inflammatory+bowel+disease+%5B%5D%22">Modeling inflammatory bowel disease [dissertation]</a>. , University of Auckland. Auckland. (1988).</li>
</ol>

Deborah A. Blank i Stephen M. Henry są pracownikami i akcjonariuszami firmy KODE Biotech Limited, właściciela patentu na technologię KODE. Dan Bess jest pracownikiem firmy Sigma-Aldrich, która sfinansowała produkcję niniejszego artykułu wideo.

Modyfikowanie komórek i wirionów za pomocą konstruktów FSL jest bardzo prostą i niezawodną techniką3-11. Aby opisać i odróżnić komórki oraz wiriony zmodyfikowane konstruktami FSL od tych niemodyfikowanych, określa się je odpowiednio mianem kodecytów i kodewirionów6-10, jednak tylko wtedy, gdy można wykazać obecność wprowadzonej grupy funkcyjnej na ich błonie. W przypadku tworzenia kodecytów z różnych stężeń konstruktów FSL, można je określać według stężenia roztworu konstruktu FSL użytego do ich wytworzenia, np. kodecyty A 15 μg/mL, a w przypadku użycia więcej niż jednego FSL – terminem łączonym, np. kodecyty A+biotyna7,8. Przy porównywaniu różnych komórek zaleca się uwzględnienie typu komórki w opisie, np. biotinowe kodecyty erytrocytów lub biotinowe kodecyty endometrium7,8.
Choć proces insercji jest bardzo wydajny, a sama insercja (choć z różną szybkością) zachodzi w szerokim zakresie temperatur od 4 - 37°C w czasie od kilku minut do kilku godzin, uzyskanie powtarzalnych wyników wymaga ścisłej kontroli czasu kontaktu, temperatury, stężenia FSL (w tym składu rozcieńczalnika), a w mniejszym stopniu stężenia komórek. Do tej pory wszystkie konstrukty FSL mogły być wykorzystywane do modyfikacji komórek tą samą techniką4-11, jednak przewiduje się, że określone warunki będą bardziej korzystne dla przebiegu prac i/lub optymalnych wymagań dotyczących postępowania z modyfikowanymi komórkami/wirionami. Dokładne stężenie FSL niezbędne do osiągnięcia pożądanego efektu musi zostać określone przez użytkownika4. Uzyskane w ten sposób zmodyfikowane konstruktami FSL komórki/wiriony można zazwyczaj stosować w systemach biologicznych lub analitycznych w taki sam sposób, jak niemodyfikowane komórki/wiriony4-11. Ponieważ konstrukty FSL będą powoli wymywać się z zmodyfikowanych powierzchni w kontakcie z roztworami lipidów7,8 lub będą zużywane przez aktywne komórki11, kwestie te należy uwzględnić w odniesieniu do poziomu sygnału lub aktywności otrzymywanej w czasie. Kodecyty można utrwalać (np. glutaraldehydem/formaliną) po insercji, pod warunkiem, że utrwalacz nie zawiera rozpuszczalników wymywających lipidy, a grupa funkcyjna jest kompatybilna z utrwalaczem. Alternatywnie można modyfikować konstruktami FSL komórki uprzednio utrwalone.
Oprócz modyfikacji powierzchni komórek i wirionów, konstrukty FSL mogą być również wprowadzane bezpośrednio do krwiobiegu zwierząt laboratoryjnych, powodując modyfikację komórek krążących in vivo7 oraz hamując działanie wirusów12, toksyn12 i przeciwciał7. Konstrukty FLS stosowano także do dekorowania liposomów oraz do nanoszenia na powierzchnie papierowe13, gdzie ulegają immobilizacji, a następnie mogą być wykorzystywane w testach diagnostycznych.
Zdolność do łatwego modyfikowania żywych komórek coraz szerszym zakresem konstruktów FSL powinna okazać się użytecznym narzędziem badawczym i rozwojowym w badaniach nad biologią powierzchni komórki.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Nazwa Sigma&lt;/strong&gt;</td><td>Firma</td><td>&lt;strong&gt;Numer produktu Sigma&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Konstrukt (nazwa KODE Biotech)&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>FSL-A(tri)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.sigmaaldrich.com/catalog/ProductDetail.do?lang=en&amp;amp;N4=F9307%7CSIGMA&amp;amp;N5=SEARCH_CONCAT_PNO%7CBRAND_KEY&amp;amp;F=SPEC&amp;amp;cm_sp=affiliate-_-Jove-_-12346">F9307&lt;/a&gt;</td><td>FSL-A(GALNa3[Fa2]GALb)-SA1-L1</td></tr><tr><td>FSL-B(tri)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.sigmaaldrich.com/catalog/ProductDetail.do?lang=en&amp;amp;N4=F9557%7CSIGMA&amp;amp;N5=SEARCH_CONCAT_PNO%7CBRAND_KEY&amp;amp;F=SPEC&amp;amp;cm_sp=affiliate-_-Jove-_-12347">F9557&lt;/a&gt;</td><td>FSL-B(GALa3[Fa2]GALb)-SA1-L1</td></tr><tr><td>FSL-GB3</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.sigmaaldrich.com/catalog/ProductDetail.do?lang=en&amp;amp;N4=F9807%7CSIGMA&amp;amp;N5=SEARCH_CONCAT_PNO%7CBRAND_KEY&amp;amp;F=SPEC&amp;amp;cm_sp=affiliate-_-Jove-_-12348">F9807&lt;/a&gt;</td><td>FSL-GB3(GALa4GALb4GLCb)-SA1-L1</td></tr><tr><td>FSL-Lea(tri)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.sigmaaldrich.com/catalog/ProductDetail.do?lang=en&amp;amp;N4=F9682%7CSIGMA&amp;amp;N5=SEARCH_CONCAT_PNO%7CBRAND_KEY&amp;amp;F=SPEC&amp;amp;cm_sp=affiliate-_-Jove-_-12349">F9682&lt;/a&gt;</td><td>FSL-LEA(GALb3[Fa4]GLCNb)-SA1-L1</td></tr><tr><td>FSL-biotin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.sigmaaldrich.com/catalog/ProductDetail.do?lang=en&amp;amp;N4=F9182%7CSIGMA&amp;amp;N5=SEARCH_CONCAT_PNO%7CBRAND_KEY&amp;amp;F=SPEC&amp;amp;cm_sp=affiliate-_-Jove-_-12350">F9182&lt;/a&gt;</td><td>FSL-CONJ(1Biotin)-SC2-L1</td></tr><tr><td>FSL-Galili</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.sigmaaldrich.com/catalog/ProductDetail.do?lang=en&amp;amp;N4=F9432%7CSIGMA&amp;amp;N5=SEARCH_CONCAT_PNO%7CBRAND_KEY&amp;amp;F=SPEC&amp;amp;cm_sp=affiliate-_-Jove-_-12351">F9432&lt;/a&gt;</td><td>FSL-GALILI(GALa3GALb4GLCNb)-SA1-L1</td></tr><tr><td>FSL-Fluorescein</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.sigmaaldrich.com/catalog/ProductDetail.do?lang=en&amp;amp;N4=F1058%7CSIGMA&amp;amp;N5=SEARCH_CONCAT_PNO%7CBRAND_KEY&amp;amp;F=SPEC&amp;amp;cm_sp=affiliate-_-Jove-_-12352">F1058&lt;/a&gt;</td><td>FSL-FLRO4(fluorescein)-SA2-L1</td></tr><tr><td colspan="4">Tabela 1.</td></tr></tbody></table>

konstrukcje fsl: prosta metoda modyfikowania powierzchni komórek/wirionów za pomocą szeregu markerów biologicznych bez wpływu na ich żywotność

FSL Constructs: A Simple Method for Modifying Cell/Virion Surfaces with a Range of Biological Markers Without Affecting their Viability

Zdolność do modyfikowania/wizualizacji powierzchni biologicznych, a następnie badania zmodyfikowanej komórki/wirionu w szerokim zakresie środowisk in vitro oraz in vivo jest niezbędna do pogłębienia wiedzy na temat funkcji konkretnych cząsteczek lub całego organizmu. Badania nad modyfikacją powierzchni biologicznymi są zazwyczaj ograniczone do inżynierii genetycznej organizmu lub kowalencyjnego przyłączania grup chemicznych do powierzchni komórki1,2. Jednakże te tradycyjne techniki narażają komórkę na działanie reagentów chemicznych lub wymagają znacznych manipulacji w celu osiągnięcia pożądanego rezultatu, co czyni je uciążliwymi; mogą one również nieumyślnie wpływać na żywotność/funkcjonalność zmodyfikowanej komórki. Konieczna jest zatem prosta metoda bezpiecznego modyfikowania powierzchni komórek.
Niedawno nowa technologia, KODE Technology, wprowadziła szereg nowatorskich konstruktów składających się z trzech komponentów: funkcjonalnej grupy głowowej (F), łącznika (S) oraz ogona lipidowego (L), znanych jako konstrukty funkcja-łącznik-lipid lub FSL3. Łącznik (S) dobiera się tak, aby konstrukty były dyspergowalne w wodzie, a jednocześnie mogły spontanicznie i stabilnie wbudowywać się w błonę.
Do tej pory funkcjonalne części (F) konstruktów FSL obejmowały szereg sacharydów, w tym determinanty związane z grupami krwi, kwasy sialowe, polisacharydy kwasu hialuronowego, fluorofory, biotynę, znaczniki radiacyjne oraz szereg peptydów3-12. Konstrukty FSL były wykorzystywane do modyfikacji embrionów, plemników, rybek danio-ostroseianek, komórek nabłonkowych/endometrialnych, erytrocytów i wirionów w celu tworzenia systemów kontroli jakości i paneli diagnostycznych, modyfikowania adhezji/interakcji/separacji/immobilizacji komórek, a także do obrazowania komórek/wirionów in vitro i in vivo3-12.
Proces modyfikowania komórek/wirionów jest ogólny i niezwykle prosty. Najczęstszą procedurą jest inkubacja komórek (w medium wolnym od lipidów) z roztworem konstruktów FSL przez 1-2 godziny w temperaturze 37°C4-10. Podczas inkubacji konstrukty FSL spontanicznie wbudowują się w błonę, co kończy cały proces. Etap płukania jest opcjonalny. Komórki zmodyfikowane konstruktami FSL nazywa się kodecytami6-9, natomiast wiriony – kodewirionami10.
Konstrukcje FSL podawane w formie bezpośrednich infuzji oraz kodecyty/kodewiriony były wykorzystywane w eksperymentalnych modelach zwierzęcych7,8,10. Wszystkie kodecyty/kodewiriony wydają się zachowywać normalną żywotność i funkcjonalność, zyskując jednocześnie nową funkcję części F7,8,10,11.
Połączenie zdolności do dyspersji w mediach biokompatybilnych, spontanicznej inkorporacji do błon komórkowych oraz pozornej niskiej toksyczności sprawia, że konstrukty FSL są cennymi narzędziami badawczymi w analizie komórek i wirionów.

Konstrukcje typu Function-Spacer-Lipid (FSL) pozwalają na modyfikację charakterystyki powierzchni żywych komórek i wirionów bez utraty ich żywotności. Metoda ta wymaga jedynie prostego kontaktu roztworu konstrukcji FSL z komórką lub wirionem, co prowadzi do spontanicznej i stabilnej inkorporacji w powierzchnię.

Konstrukcje FSL: prosta metoda modyfikowania powierzchni komórek/wirionów za pomocą szeregu markerów biologicznych bez wpływu na ich żywotność

Zdolność do modyfikowania/wizualizacji powierzchni biologicznych, a następnie badania zmodyfikowanej komórki/wirionu w szerokim zakresie środowisk in vitro i in vivo, jest niezbędna ...

Ogólnym celem tej procedury jest bezpieczne i szybkie znakowanie powierzchni żywych komórek lub S za pomocą konstrukcji bioaktywnych. Jest to osiągane poprzez wstępne przygotowanie roztworu funkcjonalnego spacera, lipidu lub konstrukcji FSL. Następnie równą część roztworu konstrukcji miesza się z równą częścią roztworu komórek lub VIR.W trzecim kroku mieszaninę inkubuje się przez 60 minut w temperaturze 37 °C. Ostatnim etapem jest przemycie zmodyfikowanych komórek lub cytów lub zmodyfikowanych VIR lub VIR i wykorzystanie ich w doświadczeniach w sposób rutynowy. Ostatecznie komórki żywe z modyfikacją powierzchniową lub S można wizualizować za pomocą wszystkich rutynowych technik analizy eksperymentalnej, w tym cytometrii przepływowej, mikroskopii i aglutynacji.Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak znakowanie kowalencyjne, jest to, że jest ona szybka, niezawodna, elastyczna i nie wpływa na żywotność zmodyfikowanej komórki lub organelli. Aby przygotować roztwór zapasu konstruktu FSL, najpierw dodaj jeden mililitr rozcieńczalnika do fiolki z produktem w celu reconstitution suchego produktu FSL, tworząc roztwór zapasu o stężeniu jeden miligram na mililitr. Sonicuj fiolkę przez 30 sekund, podziel roztwór zapasu na 100 µL sterylne pojemniki i przechowuj je w temperaturze od dwóch do ośmiu °C przez maksymalnie jeden tydzień.Aby przygotować robocze roztwory konstruktu FSL do insercji bezpośrednio przed użyciem, ponownie poddaj roztwór sonikacji przez 30 sekund w celu homogenizacji wszelkich skupień komórek, a następnie rozcieńcz konstrukt FSL i bufor do wymaganego stężenia. Roztwór roboczy przechowuj w temperaturze od dwóch do ośmiu stopni Celsiusjusza przez maksymalnie tydzień. Po resuspensji w mediach wolnych od lipidów lub w PBS, odwiruj komórki przeznaczone do modyfikacji FSL, aby usunąć niezwiązane lipidy. Następnie osadź komórki w 100 mikrolitrach rozcieńczalnika; komórki kontrolne przemyj w tych samych warunkach do uzyskania 100 mikrolitrów niezmodyfikowanych komórek.W razie potrzeby dodać 100 µL odpowiedniego rozcieńczenia roztworu FSL. Równolegle należy przygotować kontrole negatywne z niepowiązanymi roztworami FSL oraz/lub PBS. Następnie inkubować wszystkie subpopulacje komórek przez jedną godzinę w temperaturze 37 °C po inkubacji.Wypłucz wszystkie komórki dwukrotnie w medium wolnym od lipidów lub w PBS, aby usunąć wszelkie wolne konstrukty FSL, a następnie przygotuj odpowiednią zawiesinę w medium wolnym od lipidów. Po zakończeniu procesu modyfikacji FSL, komórki mogą być przechowywane w temperaturze od czterech do ośmiu stopni Celsjusza. Konstrukty FSL składają się z trzech głównych komponentów: funkcjonalnej głowy lub F, która może być różnymi biologicznie aktywnymi grupami.Dystanser RS został zaprojektowany w celu oddalenia funkcjonalnej główki od błony w celu poprawy dyspersyjności w wodzie oraz aby był nieaktywny w kontakcie z ludzką surowicą i lipidem DAL lub L, co pozwala konstruktowi na spontaniczną inkorporację w powierzchnie cztery. Reprezentatywne grupy FSL przedstawiono na następnych pięciu obrazach. Żywe embriony mysie zostały bezpośrednio znakowane fluoresceiną FSL przez 2 h w temperaturze 37 °C w bezsurowicznym medium hodowlanym, a następnie przemyte i poddane obserwacji pod mikroskopem fluorescencyjnym.Na tym pierwszym obrazie widoczny jest lustrzany zarodek w stadium dwóch komórek, pozbawiony zop palita. Intensne barwienie w środkowej części zarodka jest charakterystyczne dla klasycznego barwienia ciałka polarnego. Na kolejnych dwóch obrazach przedstawiono lustrzane zarodki w stadium czterech i ośmiu komórek, pozbawione zop palita, w których widoczne jest niewyraźne barwienie komórek znajdujących się poza płaszczyzną ostrości mikroskopu.Na ostatnim obrazie przedstawiono zarodek z lustrzanym odbiciem w stadium 16 komórek, wolny od zop palita. Na następnej serii obrazów widoczne są nienaruszone zarodki z lustrzanym odbiciem w wieku od czterech do pięciu dni, w których zarówno zarodek, jak i zop LUCITA zostały oznakowane FSL fluoresceiną. Przedstawiono znakowanie FSL fluoresceiną u danio pręgowanego. Pierwszy obraz to mikroangiografia larwy danio pręgowanego w 52. godzinie po zapłodnieniu, której do krwioobiegu wstrzyknięto bezpośrednio FSL fluoresceinę.Tutaj można zaobserwować barwienie naczyń krwionośnych danio pręgowanego. Fluoresceina FSL, heterogeniczne komórki tkanki nerek danio pręgowanego lub cyty ZK zostały przygotowane ex vivo, a następnie wstrzyknięte mikrostrzykawką do krwiobiegu biorcy, którym był embrion danio pręgowanego w 52. godzinie po zapłodnieniu. Obserwacje in vivo cytów ZK przeprowadzono dwie godziny po wstrzyknięciu, obrazując naczynia krwionośne w świetle fluorescencyjnym przy użyciu mikroskopii poklatkowej. Przedstawiono pojedynczą klatkę wideo, w której pomarańczowe strzałki wskazują duże, powoli poruszające się lub nieruchome komórki, a zielone strzałki wskazują komórki szybko poruszające się, które ze względu na ruch wydają się rozmyte. Na tym obrazie pokazano oznakowanie fluoresceiną FSL poprzez doustne pobranie konstruktu, osiągnięte poprzez zanurzenie embrionów danio pręgowanego w medium zawierającym fluoresceinę FSL przez okres do pięciu dni.Mikroskopia w polu jasnym zarodków zebrafish traktowanych fluoresceiną FSL po lewej stronie odpowiada sąsiadującemu obrazowi fluorescencyjnemu po prawej stronie. Fluorescencja była zlokalizowana głównie w przewodzie pokarmowym. W pokazanych tutaj embrionach kontrolnych, nietraktowanych, nie zaobserwowano barwienia.Tutaj przedstawiono wirusa zapalenia pęcherzykowego jam ustnych (VSV) bezpośrednio znakowanego 10 µg/mL fluoresceiny FSL przez dwie godziny w temperaturze 37 °C, a następnie utrwalonego 4% paraformaldehydem; analiza za pomocą skanowania faktów wykazała brak oczyszczania wirusa VSV po znakowaniu FSL. Na tym histogramie przedstawiono komórki jąder świni zainfekowane ludzkimi wirusami H1N1 (szczep A Puerto Rico 8 19 34) znakowanymi fluoresceiną FSL.Niefluoryzujące komórki niezakażone są reprezentowane przez czarną linię, natomiast fuzja hemaglutyniny H1N1 z komórkami świń, która doprowadziła do fluorescencji, jest wskazana przez linię czerwoną. W tej kolejnej serii obrazów komórki zostały najpierw znakowane biotyną FSL przez jedną godzinę w temperaturze 37 °C, następnie przemyte i poddane reakcji z awidyną znakowaną Fluor 4, a następnie przemyte i zamontowane na mokro do mikroskopii fluorescencyjnej. Pierwszy obraz przedstawia złożony obraz konfokalny blastocysty mysiej, a ta figura pokazuje centralny przekrój konfokalny embrionu z poprzedniego obrazu.Tutaj przedstawiono żywe, ruchome ludzkie plemniki. Rozmycie jest wynikiem ich ruchu. Bardziej wyraźny obraz reprezentatywny ludzkich plemników utrwalonych w 4% paraformaldehydzie po wprowadzeniu można zobaczyć na tej rycini tutaj.Przedstawiono ludzkie erytrocyty znakowane biotyną FSL; utwierdzenie w 4% paraformaldehydzie przed wprowadzeniem nie wpływa na znakowanie FSL, co zilustrowano na dwóch poniższych rycinach. Tutaj można zaobserwować komórki ludzkiego raka endometrium RL 95 utwierdzone w 4% paraformaldehydzie. Natomiast na tym obrazie komórki ludzkiego raka endometrium RL 95 nie są utwierdzone. Między dwoma obrazami, z utwierdzeniem i bez niego, nie obserwuje się praktycznie żadnych różnic w znakowaniu.Po lewej przedstawiono RBC cytes znakowane biotyną FSL, zaobserwowane w próbce krwi pobranej dwie godziny po dożylnej infuzji komórek; po prawej te same komórki widziane w mikroskopii świetlnej, a następnie to samo pole widzenia w mikroskopii fluorescencyjnej, gdzie dwie obecne cytes są zidentyfikowane kolorem zielonym. Obliczanie stosunku cytes do nieznakowanych komórek może służyć jako wskaźnik przeżywalności. Ostatni obraz komórek znakowanych biotyną FSL przedstawia żywe ludzkie biotin cytes endometrium, wizualizowane poprzez wiązanie z kuleczkami abated.Ta ostatnia seria obrazów przedstawia interakcje konstruktu FSL z markerami grup krwi. Pierwszy obraz przedstawia ludzkie erytrocyty GLI pokryte stężeniem 500 µg/mL FSLG, przetestowane przeciwko rozcieńczeniom ludzkiego surowicy. Ludzkie erytrocyty naturalnie nie reagują z antygenem Xena GALI.W związku z tym cytes mogą być wykorzystywane do ilościowego oznaczenia poziomu przeciwciał w surowicy. W niniejszym przykładzie ustalono, że pacjent posiada miano antygenu wynoszące 1:32, tworząc cytes o malejących poziomach FSL. Podobnie jak w przypadku wyznaczania miana antygenu, można określić optymalny poziom antygenu do wykrycia przeciwciał oraz stworzyć komórki, które dadzą wynik dodatni tylko wtedy, gdy poziom przeciwciał przekroczy określone miano.Poziom antygenu FSL wymagany do uzyskania wyniku dodatniego zależy od jakości i poziomu wykrywanego przeciwciała. Zazwyczaj w przypadku antygenów węglowodanowych roztwór FSL o stężeniu 100 µg/ml spowoduje silną reakcję dodatnią. Ludzkie erytrocyty grupy 0 zmodyfikowane tak, aby posiadały określony poziom antygenu a, lub tzw. zestawy standaryzowane.Komórki testowe (cytes) są wykorzystywane do dokładnego i powtarzalnego oznaczania miana przeciwciał anty-A w ludzkiej surowicy. W tym przykładzie komórki testowe przygotowano z własnych erytrocytów dawcy, a poziom anty-A w badanej surowicy grupy O określono jako 1:32. Przedstawiono tutaj w szóstej probówce, jak jednoczesne wprowadzenie antygenów grup krwi A i B do pojedynczej próbki erytrocytów grupy O pozwoliło na stworzenie komórek testowych typu A słaby, B słaby.Komórki te mogą być wykorzystywane do kontroli jakości VO. Analiza specjalnie przygotowanych komórek grupy A-słabej oraz B-słabej przetestowanych przeciwko odczynnikom anty-A i anty-B wykazuje oczekiwane słabe reakcje, co przedstawiono na tej ilustracji, gdzie reakcje zachodzą w środkowej dolnej części probówek. Tę prostą technikę można przeprowadzić w ciągu dwóch godzin, pod warunkiem prawidłowego wykonania.

fsl-constructs-simple-method-for-modifying-cellvirion-surfaces-with

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

FSL Constructs: Prosta metoda modyfikacji powierzchni komórek/wirionów za pomocą szerokiej gamy markerów biologicznych bez wpływu na ich żywotność

Przedstawiamy dwukolorowy test fluorescencyjny in vitro, służący do wizualizacji fuzji pojedynczych cząsteczek wirusa z płynną dwuwarstwą docelową. Poprzez znakowanie cząsteczek wirusowych fluoroforami, które różnicowo barwią błonę wirusa oraz jego wnętrze, jesteśmy w stanie monitorować kinetykę hemifuzji i tworzenia się porów.

Metoda pomiaru kinetyki fuzji wirusowej na poziomie pojedynczych cząsteczek

Cząsteczki adenowirusów są modyfikowane tak, aby zawierały albo nienaturalny analog aminokwasu azydohomoalaninę, albo azydocukier O-GlcNAz. Grupa azydowa każdego z nich jest chemoselektywnie łączona za pomocą reakcji chemii „click” w celu modyfikacji powierzchni wirusa.

Chemoselektywna modyfikacja powierzchni wirusów za pomocą bioortogonalnej chemii klik

Szybki i modułowy protokół generowania rekombinowanych wirusów krowianki wyrażających fluorescencyjnie znakowane białka jednocześnie przy użyciu metody przejściowej selekcji dominującej jest opisany tutaj.

Metodologia wydajnego wytwarzania znakowanych fluorescencyjnie białek wirusa krowianki

Dołączanie wirionów do powierzchni jest wymogiem do obrazowania pojedynczego wirionu za pomocą obrazowania fluorescencyjnego w superrozdzielczości lub mikroskopii sił atomowych (AFM). W tym miejscu demonstrujemy metodę przygotowania próbki do kontrolowanej adhezji wirionów do powierzchni szklanych, odpowiednią do stosowania w obrazowaniu AFM i fluorescencji o wysokiej rozdzielczości.

Przygotowanie próbki do mikroskopii sił atomowych pojedynczego wirionu i obrazowania fluorescencyjnego w superrozdzielczości

Praca z zakaźnymi wirusami Ebola jest ograniczona do laboratoriów o 4 poziomie bezpieczeństwa biologicznego. Tetrarazystroniczne cząstki wirusopodobne zawierające replikację i transkrypcję (trVLP) reprezentują system modelowania cyklu życia, który pozwala nam bezpiecznie modelować wiele cykli zakaźnych w warunkach bezpieczeństwa biologicznego na poziomie 2, opierając się wyłącznie na składnikach wirusa Ebola.

Modelowanie cyklu życiowego wirusa Ebola w warunkach poziomu bezpieczeństwa biologicznego 2 z cząstkami wirusopodobnymi zawierającymi minigenomy tetracistroniczne

Opisano tutaj metodę określania międzykrólestwowych asocjacji i konkurencji (bakteryjnej i grzybiczej) o przyleganie do monowarstw komórek HeLa zakażonych wirusem. Protokół ten można rozszerzyć na wiele kombinacji prokariontów, eukariontów i wirusów.

Oznaczanie inicjacji biofilmu na komórkach zakażonych wirusem przez bakterie i grzyby

Wirus krowianki (VV) jest szeroko stosowany w badaniach biomedycznych i poprawie zdrowia ludzkiego. W tym artykule opisano prostą, bardzo wydajną metodę edycji genomu VV przy użyciu systemu CRISPR-Cas9.

Proste i skuteczne podejście do konstruowania zmutowanych wektorów wirusa krowianki

Ten protokół opisuje konfigurowalną funkcjonalizację powierzchni systemu destiobiotyny, streptawidyny i APTES w celu wyizolowania określonych typów komórek. Ponadto w niniejszym manuskrypcie omówiono zastosowania, optymalizację i weryfikację tego procesu.

Metoda celowanej izolacji komórek poprzez funkcjonalizację powierzchni szkła

Opisana jest metodologia ilościowego oznaczania ekspresji 96 genów i 18 białek powierzchniowych przez pojedyncze komórki ex vivo, pozwalająca na identyfikację genów i białek o zróżnicowanej ekspresji w komórkach zakażonych wirusem w stosunku do komórek niezainfekowanych. Stosujemy podejście do badania limfocytów T CD4 + zakażonych SIV wyizolowanych od makaków rezusów.

Kwantyfikacja mRNA i ekspresji białek powierzchniowych w pojedynczych komórkach w limfocytach T CD4 + zakażonych małpim wirusem niedoboru odporności wyizolowanych od makaków rezusów

Tutaj prezentujemy protokoły identyfikacji 1) kodowanych przez wirusa immunomodulatorów, które promują replikację arbowirusa i 2) eukariotycznych czynników gospodarza, które ograniczają replikację arbowirusa. Te metody oparte na fluorescencji i luminescencji pozwalają naukowcom szybko uzyskać ilościowe odczyty replikacji arbowirusa w uproszczonych testach o niskim stosunku sygnału do szumu.

Zakażenia arbowirusem jako narzędzia przesiewowe do identyfikacji immunomodulatorów wirusa i czynników przeciwwirusowych gospodarza

Tutaj opisujemy nowo opracowany multipleksowy fluorescencyjny test immunologiczny, który wykorzystuje system cytometrii z podwójnym przepływem reporterowym do jednoczesnego wykrywania dwóch unikalnych epitopów białka kolca na nienaruszonych cząsteczkach wirusa SARS-CoV-2 (SARS-CoV-2) zespołu ciężkiej ostrej niewydolności oddechowej, które zostały wychwycone przez mikrosfery magnetyczne sprzężone z enzymem konwertującym angiotensynę.

Profilowanie epitopów białek powierzchniowych na cząsteczkach wirusa za pomocą strategii multipleksu dual-reporter

Poznaj metodę modyfikacji powierzchni żywych komórek i wirionów za pomocą konstruktów FSL bez wpływu na ich żywotność. Technika ta umożliwia szybkie i bezpieczne etykietowanie komórek do badań biologicznych.

Konstrukty FSL: prosta metoda modyfikowania powierzchni komórek/wirionów za pomocą szeregu markerów biologicznych bez wpływu na ich żywotność (Wideo) | JoVE Journal

Konstrukcje FSL: prosta metoda modyfikowania powierzchni komórek/wirionów za pomocą szeregu markerów biologicznych bez wpływu na ich żywotność

Przeglądaj więcej filmów