Name: Ilościowa ocena migracji komórek za pomocą testu fagokinetycznego ruchu torowego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-12-04T12:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 30 s
Description: Poznaj ilościową ocenę motoryki komórek za pomocą testu fagokinetycznego z nanocząstkami złota. Ta metoda umożliwia wizualizację i pomiar ruchu komórkowego w czasie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Praca ta była wspierana przez granty z National Institutes of Health (AI050677, HD-051998 oraz GM103433), stypendium badawcze w dziedzinie układu krążenia im. Malcolma Feista oraz stypendium przeddoktorskie American Heart Association (10PRE4200007).

1. Przygotowanie szkiełek coverglass pokrytych żelatyną
<ol>
	<li>Umieść szkiełka nakrywkowe (o średnicy 15 mm) przemyte kwasem w sterylnym plastikowym naczyniu o średnicy 100 mm. W każdym naczyniu umieść 8–9 szkiełek, upewniając się, że nie dotykają one siebie ani ścianek naczynia.</li>
</ol>
Uwaga: Kryszalki, igły i pęsety muszą być sterylne, aby wyeliminować możliwe zanieczyszczenie mikroorganizmami, a także endotoksynami, które wpływają na funkcje komórkowe, w tym na ruchliwość.
<ol start="2">
	<li>Odważ proszek żelatynowy i zawieś go w wodzie dejonizowanej, aby przygotować roztwór żelatyny o końcowym stężeniu 0,5 g/300 ml. Następnie roztwór żelatyny należy poddać autoklawowaniu.</li>
	<li>Nanieś pipetą 2-3 krople żelatyny (~100-150 ml) na każdą szkiełko nakrywkę.</li>
</ol>
Uwaga: Należy uważać, aby żelatyna nie dotknęła ścianek naczynia, w przeciwnym razie nie będzie można wyjąć szkiełek nakrywkowych z naczynia.
<ol start="4">
	<li>Wygrzewać szkiełka nakrywkowe pokryte żelatyną w szalce 100 mm w piekarniku w temperaturze 90 °C przez 10 min.</li>
	<li>Usunąć nadmiar żelatyny za pomocą delikatnego pipetowania.</li>
	<li>Osuszyć szkiełka nakrywkowe w szalce 100 mm w piekarniku w temperaturze 70 °C przez 45 min.</li>
	<li>Po wyschnięciu wyjąć szkiełka nakrywkowe z szalki 100 mm, używając sterylnej, wolnej od endotoksyn igły i pęsety (igły służy do delikatnego uniesienia szkiełka nakrywkowego, aby umożliwić jego ostrożne usunięcie pęsetą).</li>
	<li>Umieścić poszczególne szkiełka nakrywkowe pokryte żelatyną w osobnych studzienkach płytki 24-dołkowej.</li>
</ol>
2. Przygotowanie szkiełek nakrywkowych powlekanych koloidalnym złotem
<ol>
	<li>Odważ odpowiednią ilość kwasu chloroaurycznego (trydrat tetrachlorozłotowego(III); HAuCl4·3H2O>), a następnie rozpuść go w sterylowanej wodzie dejonizowanej, aby przygotować końcowy roztwór o stężeniu 14,5 mM (toksyczny). Przygotuj 1,5 ml roztworu na każde 8–9 szkiełek nakrywkowych.</li>
</ol>
Ostrzeżenie: Kwas chloroaurowy jest szkodliwy w przypadku połknięcia, powoduje poważne oparzenia skóry i uszkodzenia oczu oraz może wywołać reakcję alergiczną skóry. Toksyczny w przypadku połknięcia.
<ol start="2">
	<li>Odważ odpowiednią ilość cytrynianu sodu (triwodorogeno-2-hydroksypropano-1,2,3-tricarboksylan trisodu; Na3C6H5O7), a następnie resuspenduj proszek w wodzie dejonizowanej, aby przygotować końcowy roztwór o stężeniu 0,5%. Przygotuj 1 ml roztworu na każde 8-9 szkiełek nakrywkowych.</li>
</ol>
Ostrzeżenie: Cytrynian sodu może powodować podrażnienie oczu i skóry. Może również powodować podrażnienie dróg oddechowych i pokarmowych.
<ol start="3">
	<li>W sterylnym, wolnym od endotoksyn zlewce połącz 1,5 ml sterylnego roztworu HAuCl4 o stężeniu 14,5 mM oraz 13,5 ml sterylnej wody dejonizowanej; w wyniku powstanie roztwór o bladożółtym kolorze. Wymienione objętości pozwolą na przygotowanie 8-9 szkiełek nakrywkowych z koloidalnym złotem.</li>
	<li>Podgrzewaj roztwór na płycie grzewczej przy ciągłym mieszaniu, aż zacznie wrzeć.</li>
</ol>
Ostrzeżenie: Podgrzewanie roztworu należy przeprowadzać w dygestorium, ponieważ opary mogą być szkodliwe/toksyczne. Opary te działają niszcząco na błony śluzowe oraz górne drogi oddechowe.
<ol start="5">
	<li>Zdejmij zlewka z płyty grzewczej.</li>
	<li>Podczas mieszania dodaj 0,7 ml 0,5% roztworu cytrynianu sodu. Wyżej wymieniona objętość pozwoli na przygotowanie 8–9 szkiełek nakrywkowych z koloidalnym złotem.</li>
	<li>Mieszaj połączony roztwór przez około 2 min (Uwaga: kolor roztworu będzie stopniowo zmieniać się z bladego żółtego na bezbarwny, szary, fioletowy i ciemnofioletowy, aż w końcu osiągnie kolor czerwonego wina lub, najlepiej, rdzy). Otrzymany produkt jest roztworem koloidalnego złota.</li>
	<li>Schłodź roztwór koloidalnego złota w pipecie 10 ml przez 1–2 min (aby zapobiec stopieniu się warstwy żelatyny na szkiełku nakrywkowym po dodaniu roztworu koloidalnego złota), a następnie nanieś 1,0–2,0 ml roztworu koloidalnego złota na każde szkiełko nakrywkowe pokryte żelatyną, umieszczone wcześniej w płytce(ach) 24-dołkowej (ilość roztworu koloidalnego złota dodawana do szkiełek pokrytych żelatyną zależy od stopnia wytrącenia cząsteczek złota w roztworze – zapoznaj się z poniższymi uwagami).</li>
</ol>
Uwaga: Z uwagi na możliwe różnice w efektywności wytrącania cząsteczek złota, zaleca się najpierw dodać 0,5-1 ml koloidalnego roztworu złota do szkiełek nakrywek powlekanych żelatyną, a następnie umieścić płytkę 24-dołkową w inkubatorze na 0,5 h. Po tym czasie inkubacji należy sprawdzić pod mikroskopem świetlnym, czy gęstość cząsteczek złota na szkiełkach nakrywkach jest odpowiednia. Obrazy mikroskopowe przy powiększeniu 20x przedstawiające przykłady zbyt niskiego i zbyt wysokiego stężenia cząsteczek złota znajdują się na Rysunku 1. Obrazy mikroskopowe przy powiększeniu 40x przedstawiające idealne stężenie cząsteczek złota (przynajmniej do zastosowań z monocytami) znajdują się na Rysunku 2. Optymalna gęstość nanocząsteczek złota na szkiełku powinna zostać wyznaczona doświadczalnie dla każdego rodzaju użytych komórek, ponieważ charakterystyka różnych komórek determinuje siłę ich ruchu po szkiełkach nakrywkach. Jeśli stężenie cząsteczek złota jest niewystarczające, należy dodać do powlekanych żelatyną szkiełek nakrywek dodatkowe 0,5-1 ml koloidalnego roztworu złota.
W zależności od wielkości komórki odpowiednie stężenie cząsteczek złota może się różnić i w konsekwencji będzie zależeć od wielkości komórki badanej pod kątem ruchliwości. Na przykład w przypadku monocytów ludzkich, które są komórkami o niewielkim rozmiarze (~10-20 μm28), w naszych analizach wymagane było wyższe stężenie cząsteczek złota. Odpowiednia dystrybucja nanocząsteczek złota umożliwia badaczowi łatwe i wydajne rozróżnienie krawędzi śladów komórkowych. Zbyt wysokie stężenie cząsteczek złota utrudnia ruch komórek, a tym samym dokładny pomiar ich ruchliwości, natomiast zbyt niskie stężenie ogranicza możliwość wyznaczenia dokładnego toru ruchu.
Ważna uwaga: Jeśli synteza nanocząsteczek złota jest problematyczna, nanocząsteczki złota są dostępne w sprzedaży komercyjnej w rozmiarach od 5 nm do 400 nm. Dodatkowo w badaniach nad ruchliwością komórek stosowano mikrosfery fluorescencyjne29. Jednakże użycie tych mikrosfer wymaga zastosowania mikroskopu fluorescencyjnego do analizy migracji komórek.
<ol start="9">
	<li>Umieść płytkę 24-dołkową z szkiełkami podstawowymi pokrytymi koloidalnym złotem w inkubatorze w temperaturze 37 °C i inkubuj od 1 h do całej nocy.</li>
	<li>Po inkubacji wypłucz/usuń niezwiązane złoto, zanurzając szkiełka podstawowe (3x) w sterylnym roztworze soli fizjologicznej w buforze fosforanowym (PBS; pH 7.4).</li>
	<li>Przenieś te pokryte koloidalnym złotem szkiełka podstawowe do czystej płytki (płytek) 12-dołkowej zawierającej PBS.</li>
	<li>Przechowuj te szkiełka podstawowe w temperaturze 4 °C do momentu użycia (przed włożeniem do lodówki zabezpiecz płytkę parafilmem).</li>
</ol>
Ważna uwaga: Szkiełka nakrywkowe powlekane złotem koloidalnym należy zawsze przechowywać w odpowiednim cieczy/medium, ponieważ cząsteczki złota mogą odpryskiwać od szkiełek w przypadku ich wyschnięcia. Szkiełka nakrywkowe ze złotem koloidalnym powinny zostać wykorzystane w ciągu 2-3 miesięcy od daty ich przygotowania.
Kontrola jakości: W pojedynczym badaniu ruchliwości metodą ścieżek fagokinetycznych krytyczne jest zastosowanie szkiełek podstawowych charakteryzujących się podobnym stężeniem cząsteczek złota. Ten prosty aspekt pozwoli zapewnić, że ilościowe różnice w ruchliwości komórkowej między próbkami będą wynikać wyłącznie z zastosowanej metody traktowania, a nie z właściwości fizycznych szkiełek pokrytych koloidalnym złotem. W pojedynczych eksperymentach preferujemy stosowanie wyłącznie szkiełek wykonanych w tym samym czasie, choć wykazaliśmy, że dopóki gęstość nanocząsteczek złota jest taka sama, użycie szkiełek z różnych preparatów jest dopuszczalne.
3. Analiza motywności komórkowej
<ol>
	<li>Umieść szkiełka podstawowe pokryte koloidalnym złotem w odpowiednim medium hodowlanym dla badanych komórek.</li>
	<li>Przenieś odpowiednio potraktowane komórki na szkiełka podstawowe pokryte koloidalnym złotem, umieszczone w płytce(ach) 24-dołkowej.</li>
</ol>
Uwaga: Liczba komórek przenoszonych do pojedynczej studni musi zostać określona dla każdego badanego typu komórek. W idealnym przypadku komórki powinny być równomiernie rozmieszczone na szkiełku podstawowym pokrytym koloidalnym złotem, co z kolei pozwoli na analizę statystyczną wyłącznie trajektorii utworzonych przez pojedynczą komórkę. Jeśli komórki zostaną wysiane w zbyt wysokim stężeniu, istnieje duże prawdopodobieństwo wystąpienia nakładających się trajektorii wielu komórek. Nakładających się trajektorii nie można dokładnie skwantyfikować, w związku z czym nie mogą być one uwzględnione w końcowych analizach ruchu badanych komórek. Nakładające się trajektorie będące wynikiem udziału wielu komórek są zazwyczaj łatwo zauważalne jako trajektorie zlane lub krzyżujące się (w polu analizy), w których w tym samym przyległym, oczyszczonym obszarze można zaobserwować dwie lub więcej komórek.
<ol start="3">
	<li>Inkubować w temperaturze 37 °C/5% CO2 przez 24 hr (lub przez inny odpowiedni czas; np. analizowano ruchliwość monocytów od 6 hr do 24 hr po opracowaniu oraz komórki śródbłonka w 12 hr po opracowaniu). Optymalny przedział czasowy dla określania i pomiaru ruchliwości komórkowej będzie różnić się w zależności od badanego typu komórek, a zatem powinien zostać wyznaczony eksperymentalnie dla każdego typu komórek (dobrym punktem wyjścia jest jednak okres od 6 - 12 hr po opracowaniu).</li>
</ol>
Uwaga: Jeśli eksperymentalne szkiełka podstawowe powlekane koloidalnym złotem muszą zostać zmagazynowane i/lub poddane analizie w późniejszym terminie, komórki i nanocząsteczki złota należy utrwalić na szkiełkach. Aby przeprowadzić ten etap utrwalania, po kroku 3.3 należy najpierw ostrożnie przemyć szkiełka 2 razy w 1x PBS (zaleca się zanurzanie szkiełek, aby uniknąć usunięcia nanocząsteczek złota z powierzchni), a następnie zastosować standardową metodę utrwalania komórek, np. inkubację z 3% paraformaldehydem w temperaturze pokojowej. Po 15-minutowej inkubacji należy usunąć 3% paraformaldehyd i ostrożnie przemyć szkiełka 3 razy w 1x PBS. Utrwalone szkiełka można przechowywać w lodówce.
<ol start="4">
	<li>Za pomocą mikroskopu świetlnego należy zarejestrować obrazy śladów pozostawionych przez pojedynczą poruszającą się komórkę (Uwaga: powiększenie stosowane do fotografowania śladów komórkowych będzie zależeć od badanego typu komórek). Przykłady śladów komórkowych pozostawionych przez komórki nieruchome i ruchliwe na szkiełkach podstawowych pokrytych koloidalnym złotem przedstawiono na Rysunku 2.</li>
</ol>
Uwaga: Stwierdzono, że nanocząsteczki złota o rozmiarze zastosowanym w teście mobilności śladu fagokinetycznego są całkowicie nietoksyczne dla komórek30. W razie potrzeby żywotność badanych komórek można ocenić poprzez barwienie błękitem trypanu lub badając inne markery żywotności komórkowej. Należy wziąć pod uwagę konieczność utrwalenia, rodzaj utrwalenia itp., jeśli ten krok musi zostać wykonany.
<ol start="5">
	<li>Za pomocą dostępnego bezpłatnie oprogramowania, takiego jak ImageJ (<a href="http://rsbweb.nih.gov/ij/" target="_blank">http://rsbweb.nih.gov/ij/</a>) lub NIH Image (<a href="http://rsb.info.nih.gov/nih-image/" target="_blank">http://rsb.info.nih.gov/nih-image/</a>), oba opracowane w National Institutes of Health, lub ImageTool (<a href="http://ddsdx.uthscsa.edu/dig/itdesc.html" target="_blank">http://ddsdx.uthscsa.edu/dig/itdesc.html</a>) opracowanego w University of Texas Health Science Center w San Antonio, na podstawie uzyskanych obrazów wyznacza się dla każdego ramienia eksperymentalnego średnią powierzchnię (w jednostkach dowolnych) złota koloidalnego usuniętego przez 10-20 lub więcej komórek (na próbkę). Następnie można przeprowadzić analizę statystyczną zebranych wyników. Na przykład wyniki można przedstawić jako średnie ± standardowe błędy średniej (SEM), stosując testy t Studenta, przyjmując wartość P &lt;0,05 jako miarę istotności statystycznej między próbkami. Rysunki 3 i 4 przedstawiają etapy analizy powierzchni złota koloidalnego usuniętego przez komórkę.</li>
</ol>

<ol><li>Armstrong, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+control+of+cell+motility+during+embryogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Metastasis+Rev%22%5BJournal%5D)">The control of cell motility during embryogenesis.</a> Cancer Metastasis Rev. 4, 59-79 (1985).</li>
<li>Dustin, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stop+and+go+traffic+to+tune+T+cell+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Stop and go traffic to tune T cell responses.</a> Immunity. 21, 305-314 (2004).</li>
<li>Mutsaers, S. E., Bishop, J. E., McGrouther, G., Laurent, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+tissue+repair%3A+from+wound+healing+to+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Biochem.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of tissue repair: from wound healing to fibrosis.</a> Int. J. Biochem. Cell Biol. 29, 5-17 (1997).</li>
<li>Etienne-Manneville, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polarity+proteins+in+migration+and+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Polarity proteins in migration and invasion.</a> Oncogene. 27, 6970-6980 (2008).</li>
<li>Parsons, J. T., Horwitz, A. R., Schwartz, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+adhesion%3A+integrating+cytoskeletal+dynamics+and+cellular+tension%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Cell adhesion: integrating cytoskeletal dynamics and cellular tension.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 11, 633-643 (2010).</li>
<li>Mitchison, T. J., Cramer, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actin-based+cell+motility+and+cell+locomotion%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Actin-based cell motility and cell locomotion.</a> Cell. 84, 371-379 (1996).</li>
<li>Pollard, T. D., Borisy, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+motility+driven+by+assembly+and+disassembly+of+actin+filaments%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Cellular motility driven by assembly and disassembly of actin filaments.</a> Cell. 112, 453-465 (2003).</li>
<li>Bretscher, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Getting+membrane+flow+and+the+cytoskeleton+to+cooperate+in+moving+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Getting membrane flow and the cytoskeleton to cooperate in moving cells.</a> Cell. 87, 601-606 (1996).</li>
<li>Albrecht-Buehler, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+phagokinetic+tracks+of+3T3+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The phagokinetic tracks of 3T3 cells.</a> Cell. 11, 395-404 (1977).</li>
<li>Smith, M. S., Bentz, G. L., Alexander, J. S., Yurochko, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+cytomegalovirus+induces+monocyte+differentiation+and+migration+as+a+strategy+for+dissemination+and+persistence%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Human cytomegalovirus induces monocyte differentiation and migration as a strategy for dissemination and persistence.</a> J. Virol. 78, 4444-4453 (2004).</li>
<li>Palmisano, R., Itoh, Y. Matrix Metalloproteinase Protocols. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPalmisano%2C+R+%22Methods+in+Molecular+Biology%22">Methods in Molecular Biology</a>. 622, Humana Press. 379-392 (2010).</li>
<li>Ohta, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HOXD3-Overexpression+Increases+Integrin+Alpha+V+Beta+3+Expression+and+Deprives+E-Cadherin+while+It+Enhances+Cell+Motility+in+A549+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+and+Experimental+Metastasis%22%5BJournal%5D)">HOXD3-Overexpression Increases Integrin Alpha V Beta 3 Expression and Deprives E-Cadherin while It Enhances Cell Motility in A549 Cells.</a> Clinical and Experimental Metastasis. 7-8, 381-390 (2006).</li>
<li>Kawa, S., Kimura, S., Hakomori, S., Igarashi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+chemotactic+motility+and+trans-endothelial+migration+of+human+neutrophils+by+sphingosine+1-phosphate%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Inhibition of chemotactic motility and trans-endothelial migration of human neutrophils by sphingosine 1-phosphate.</a> FEBS Lett. 420, 196-200 (1997).</li>
<li>Kawamura, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((N-WASP+and+WAVE2+acting+downstream+of+phosphatidylinositol+3-kinase+are+required+for+myogenic+cell+migration+induced+by+hepatocyte+growth+factor%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">N-WASP and WAVE2 acting downstream of phosphatidylinositol 3-kinase are required for myogenic cell migration induced by hepatocyte growth factor.</a> J. Biol. Chem. 279, 54862-54871 (2004).</li>
<li>Ando, Y., Jensen, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidermal+growth+factor+and+insulin-like+growth+factor+I+enhance+keratinocyte+migration%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Invest.+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Epidermal growth factor and insulin-like growth factor I enhance keratinocyte migration.</a> J. Invest. Dermatol. 100, 633-639 (1993).</li>
<li>Todt, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+tumor+necrosis+factor-alpha+on+human+trophoblast+cell+adhesion+and+motility%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Reprod.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Effects of tumor necrosis factor-alpha on human trophoblast cell adhesion and motility.</a> Am. J. Reprod. Immunol. 36, 65-71 (1996).</li>
<li>McAuslan, B. R., Reilly, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+cell+phagokinesis+in+response+to+specific+metal+ions%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Cell.+Res%22%5BJournal%5D)">Endothelial cell phagokinesis in response to specific metal ions.</a> Exp. Cell. Res. 130, 147-157 (1980).</li>
<li>Smith, M. S., Bentz, G. L., Smith, P. M., Bivins, E. R., Yurochko, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HCMV+activates+PI%283%29K+in+monocytes+and+promotes+monocyte+motility+and+transendothelial+migration+in+a+PI%283%29K-dependent+manner%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Leukoc.+Biol%22%5BJournal%5D)">HCMV activates PI(3)K in monocytes and promotes monocyte motility and transendothelial migration in a PI(3)K-dependent manner.</a> J. Leukoc. Biol. 76 (3), 65-76 (2004).</li>
<li>Smith, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Roles+of+phosphatidylinositol+3-kinase+and+NF-kappaB+in+human+cytomegalovirus-mediated+monocyte+diapedesis+and+adhesion%3A+strategy+for+viral+persistence%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Roles of phosphatidylinositol 3-kinase and NF-kappaB in human cytomegalovirus-mediated monocyte diapedesis and adhesion: strategy for viral persistence.</a> J. Virol. 81, 7683-7694 (2007).</li>
<li>Bentz, G. L., Yurochko, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+CMV+infection+of+endothelial+cells+induces+an+angiogenic+response+through+viral+binding+to+EGF+receptor+and+beta1+and+beta3+integrins%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Human CMV infection of endothelial cells induces an angiogenic response through viral binding to EGF receptor and beta1 and beta3 integrins.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 5531-5536 (2008).</li>
<li>Chan, G., Nogalski, M. T., Yurochko, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+EGFR+on+monocytes+is+required+for+human+cytomegalovirus+entry+and+mediates+cellular+motility%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Activation of EGFR on monocytes is required for human cytomegalovirus entry and mediates cellular motility.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 22369-22374 (2009).</li>
<li>Nogalski, M. T., Chan, G., Stevenson, E. V., Gray, S., Yurochko, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HCMV-Regulated+Paxillin+in+Monocytes+Links+Cellular+Pathogenic+Motility+to+the+Process+of+Viral+Entry%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">HCMV-Regulated Paxillin in Monocytes Links Cellular Pathogenic Motility to the Process of Viral Entry.</a> J. Virol. 85, 1360-1369 (2011).</li>
<li>Turkevich, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+study+of+the+nucleation+and+growth+processes+in+the+synthesis+of+colloidal+gold%5BTitle%5D)+AND+%22Discuss.+Faraday.+Soc%22%5BJournal%5D)">A study of the nucleation and growth processes in the synthesis of colloidal gold.</a> Discuss. Faraday. Soc. 11, 55-75 (1951).</li>
<li>Frens, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Particle+size+and+sol+stability+in+mental+colloids%5BTitle%5D)+AND+%22Colloid+%26+Polymer+Science%22%5BJournal%5D)">Particle size and sol stability in mental colloids.</a> Colloid & Polymer Science. 250, 736-741 (1972).</li>
<li>Frens, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlled+nucleation+for+the+regulation+of+the+particle+size+in+monodisperse+gold+suspensions%5BTitle%5D)+AND+%22Phys.+Sci%22%5BJournal%5D)">Controlled nucleation for the regulation of the particle size in monodisperse gold suspensions.</a> Phys. Sci. 241, 20-22 (1973).</li>
<li>Zetter, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assay+of+capillary+endothelial+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Assay of capillary endothelial cell migration.</a> Methods Enzymol. 147, 135-144 (1987).</li>
<li>Scott, W. N., McCool, K., Nelson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+method+for+the+production+of+gold+colloid+monolayers+for+use+in+the+phagokinetic+track+assay+for+cell+motility%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Improved method for the production of gold colloid monolayers for use in the phagokinetic track assay for cell motility.</a> Anal. Biochem. 287, 343-344 (2000).</li>
<li>Wang, S. Y., Mak, K. L., Chen, L. Y., Chou, M. P., Ho, C. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterogeneity+of+human+blood+monocyte%3A+two+subpopulations+with+different+sizes%2C+phenotypes+and+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology%22%5BJournal%5D)">Heterogeneity of human blood monocyte: two subpopulations with different sizes, phenotypes and functions.</a> Immunology. 77, 298-303 (1992).</li>
<li>Windler-Hart, S. L., Chen, K. Y., Chenn, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cell+behavior+screen%3A+identification%2C+sorting%2C+and+enrichment+of+cells+based+on+motility%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">A cell behavior screen: identification, sorting, and enrichment of cells based on motility.</a> BMC Cell Biol. 6, 14(2005).</li>
<li>Pan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Size-dependent+cytotoxicity+of+gold+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Small%22%5BJournal%5D)">Size-dependent cytotoxicity of gold nanoparticles.</a> Small. 3, 1941-1949 (2007).</li>
<li>Rodriguez, L. G., Wu, X., Guan, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wound-healing+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Wound-healing assay.</a> Methods Mol. Biol. 294, 23-29 (2005).</li>
<li>Boyden, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+chemotactic+effect+of+mixtures+of+antibody+and+antigen+on+polymorphonuclear+leucocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">The chemotactic effect of mixtures of antibody and antigen on polymorphonuclear leucocytes.</a> J. Exp. Med. 115, 453-466 (1962).</li>
<li>Brooks, D. M., Brooks, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Vitro+Invasion+Assay+Using+Matrigel%28R%29%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Med%22%5BJournal%5D)">In Vitro Invasion Assay Using Matrigel(R).</a> Methods Mol. Med. 58, 61-70 (2001).</li>
<li>Kuo, J. C., Wang, W. J., Yao, C. C., Wu, P. R., Chen, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+tumor+suppressor+DAPK+inhibits+cell+motility+by+blocking+the+integrin-mediated+polarity+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The tumor suppressor DAPK inhibits cell motility by blocking the integrin-mediated polarity pathway.</a> J. Cell Biol. 172, 619-631 (2006).</li>
<li>Benazeraf, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+random+cell+motility+gradient+downstream+of+FGF+controls+elongation+of+an+amniote+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A random cell motility gradient downstream of FGF controls elongation of an amniote embryo.</a> Nature. 466, 248-252 (2010).</li>
</ol>

Nie zadeklarowano konfliktów interesów.

Przedstawiony w tym artykule test ruchliwości w oparciu o ślady fagokinetyczne jest prostą i wysoce skuteczną metodą ilościowej analizy migracji komórek. Ponieważ analizie mogą zostać poddane wiele typów komórek9-17, metoda ta ma potencjał szerokiego zastosowania w wielu dyscyplinach. Zastosowanie szkiełek nakrywkowych pokrytych koloidalnym złotem umożliwia pomiar powierzchni śladu oczyszczonego przez przemieszczającą się komórkę. Test ten pozwala zmierzyć wpływ różnych bodźców (t.j. czynników wzrostu...

<table><tbody><tr><td>Szklane szkiełka nakrywki (15mm)</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-545-83</td><td></td></tr><tr><td>Żelatyna 300 Bloom</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G-1890</td><td></td></tr><tr><td>Kwas tetrachlorozłotowy trihydrat</td><td>Fisher Chemical</td><td>G54-1</td><td>14.5 mM (końcowy roztwór roboczy)</td></tr><tr><td>Cytrynian sodu</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP327-500</td><td>0.5% (końcowy roztwór roboczy)</td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Fisher Scientific</td><td>O4042</td><td>3% (końcowy roztwór roboczy)</td></tr><tr><td>Szalka do hodowli tkankowych 100 mm</td><td>Sarstedt</td><td>83.1802</td><td></td></tr><tr><td>Płytki 12-dołkowe</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-772-29</td><td></td></tr><tr><td>Płytki 24-dołkowe</td><td>Fisher Scientific</td><td>07-200-84</td><td></td></tr><tr><td>Hybrydyzator z piecem Techne Oven Hybridiser HB-1D</td><td>LabPlanet</td><td>2040500</td><td>Wystarczy standardowy piec laboratoryjny</td></tr><tr><td>Pipety serologiczne 10 ml</td><td>Sarstedt</td><td>86.1254.001</td><td></td></tr><tr><td>Scedent/dozownik Pipet-Aid</td><td>Drummond</td><td>13-681-15</td><td></td></tr><tr><td>Jednokanałowa pipeta manualna P200</td><td>Rainin</td><td>PR-200</td><td></td></tr><tr><td>Nawki z filtrem 200 µl</td><td>CLP</td><td>BT200</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie ImageJ</td><td>&lt;a href=&quot;http://rsb.info.nih.gov/ij/&quot; target=&quot;_blank">http://rsb.info.nih.gov/ij/&lt;/a&gt;</td><td></td><td>Licencja: Domena Publiczna</td></tr><tr><td>Mikroskop Nikon Eclipse TE300 z monochromatyczną 12-bitową kamerą CCD photometrics CoolSNAPfx</td><td>Nikon</td><td></td><td>Wycofany z produkcji; najbliższa specyfikacja odpowiada modelowi Nikon Eclipse Ti, jednak model Nikon 80i z niższej serii również będzie odpowiedni. Inne marki oferują również porównywalne mikroskopy.</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Uwaga: &lt;/strong&gt;Wymienione poniżej odczynniki i sprzęt zostały wykorzystane przez nas w naszych badaniach. Można stosować inne materiały, dostawców, odczynniki i sprzęt, o ile posiadają one podobne specyfikacje.</td></tr></tbody></table>

ilościowa ocena migracji komórek z wykorzystaniem testu ruchliwości w śladach fagokinetycznych

A Quantitative Evaluation of Cell Migration by the Phagokinetic Track Motility Assay

Ruchliwość komórkowa jest istotnym procesem biologicznym zarówno dla organizmów jednokomórkowych, jak i wielokomórkowych. Jest ona niezbędna do przemieszczania się organizmów jednokomórkowych w kierunku źródła składników odżywczych lub z dala od niekorzystnych warunków, a w organizmach wielokomórkowych odgrywa wiele ról, m.in. w rozwoju tkanek, nadzorze immunologicznym oraz gojeniu ran1,2,3. Rozregulowanie tego procesu może prowadzić do poważnych chorób neurologicznych, sercowo-naczyniowych i immunologicznych, a także do nasilenia powstawania i rozprzestrzeniania się nowotworów4,5. Na poziomie molekularnym wykazano, że polimeryzacja aktyny oraz recykling receptorów odgrywają istotną rolę w tworzeniu wypustek komórkowych (lamellipodiów), które napędzają ruch komórki do przodu6,7,8. Niemniej jednak wiele pytań biologicznych dotyczących migracji komórek pozostaje nieodpowiedzianych.
Centralna rola ruchliwości komórkowej w zdrowiu i chorobach ludzi podkreśla znaczenie zrozumienia konkretnych mechanizmów zaangażowanych w ten proces i sprawia, że dokładne metody oceny ruchliwości komórek są szczególnie istotne. Do wizualizacji ruchu komórek zazwyczaj wykorzystuje się mikroskopy. Jednak komórki poruszają się dość wolno, co sprawia, że ilościowy pomiar migracji komórek jest procesem zasobochłonnym, wymagającym drogich kamer i oprogramowania do tworzenia ilościowych filmów poklatkowych z ruchliwymi komórkami. W związku z tym, możliwość przeprowadzenia ilościowego pomiaru migracji komórek, który byłby kosztowo efektywny, niewymagający dużego nakładu pracy i wykorzystujący powszechne wyposażenie laboratoryjne, stanowi ogromną potrzebę wielu badaczy.
Analiza ruchomości metodą śladów fagokinetycznych wykorzystuje zdolność poruszającej się komórki do usuwania cząsteczek złota z jej drogi, co pozwala na utworzenie mierzalnego śladu na szkiełku podstawowym pokrytym koloidalnym złotem9,10. Dzięki zastosowaniu ogólnodostępnego oprogramowania można ocenić wiele śladów dla każdej serii badawczej w celu spełnienia wymogów statystycznych. Analizę tę można wykorzystać do oceny ruchomości wielu typów komórek, takich jak komórki nowotworowe11,12, fibroblasty9, neutrofile13, komórki mięśni szkieletowych14, keratynocyty15, trofoblasty16, komórki śródbłonka17 oraz monocyty10,18-22. Protokół obejmuje przygotowanie szkiełek pokrytych nanocząsteczkami złota (Au°), które powstają w wyniku redukcji kwasu chloroauronego (Au3+) cytrynianem sodu. Metoda ta została opracowana przez Turkevicha et al. w 1951 roku23, a następnie udoskonalona w latach 70. przez Frensa et al.24,25. W wyniku tego etapu redukcji chemicznej z mieszaniny reakcyjnej wytrącają się cząsteczki złota (o średnicy 10-20 nm), które można nanieść na szkiełka podstawowe, przygotowując je następnie do analiz migracji komórkowych9,26,27.
Ogólnie rzecz biorąc, test ruchliwości w śladzie fagokinetycznym jest szybką, ilościową i prostą metodą pomiaru ruchliwości komórkowej. Ponadto może on być wykorzystywany jako prosty test wysokoprzepustowy w przypadku typów komórek, które nie nadają się do obrazowania poklatkowego, a także w innych zastosowaniach, zależnie od potrzeb badacza. Możliwość ilościowego pomiaru ruchliwości wielu typów komórek bez konieczności stosowania drogich mikroskopów i oprogramowania, w połączeniu z wykorzystaniem powszechnie dostępnego sprzętu i odczynników laboratoryjnych, sprawia, że test ruchliwości w śladzie fagokinetycznym jest odpowiednim wyborem dla naukowców zainteresowanych badaniem ruchliwości komórkowej.

Przedstawiono przykład zdjęć wykonanych pod mikroskopem świetlnym, ukazujących obszar śladu oczyszczonego przez pojedynczą komórkę (w rycinie 2 pokazano monocyt z naszych eksperymentów). Komórki nieruchome tworzą charakterystyczne małe, owalne lub okrągłe ślady wokół siebie, co wskazuje na niski podstawowy poziom ruchu tych niepobudzonych komórek (ryciny 2A i 2B). Z kolei komórki o wysokiej mobilności [w naszym systemie są to komórki zakażone ludzkim cytomegalowirusem (HCMV)] charakteryz...

Test ścieżki motylości fagokinetycznej jest metodą stosowaną do oceny ruchu komórek. W szczególności test ten mierzy w sposób ilościowy chemokinezę (losową motylość komórek) w czasie. Metoda ta wykorzystuje zdolność komórek do tworzenia mierzalnego śladu ich ruchu na szkiełkach nakrywkowych powlekanych koloidalnym złotem.

Ilościowa ocena migracji komórek z wykorzystaniem testu ruchliwości w śladach fagokinetycznych

Motylość komórkowa jest istotnym procesem biologicznym zarówno dla organizmów jednokomórkowych, jak i wielokomórkowych. Jest ona niezbędna do przemieszczania się organizmów jednokomórkowych ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest umożliwienie ilościowego pomiaru motylowości komórkowej w czasie z wykorzystaniem testu motylowości komórek opartego na nanocząsteczkach złota. Osiąga się to poprzez uprzednie przygotowanie szklanych szkiełek podstawkowych do powlekania nanocząsteczkami złota. W szczególności szkiełka podstawkowe wolne od endotoksyn są powlekane żelatyną, a następnie wypalane.Drugim krokiem jest redukcja kwasu chlorozłotowego, co doprowadzi do powstania nanocząsteczek złota, a następnie równomierne pokrycie szkiełek podstawowych powleczonych żelatyną otrzymanym roztworem. Następnie komórki nanosi się na szkiełka pokryte nanocząsteczkami złota na czas wymagany w eksperymencie. W kolejnym etapie żelatyna wyprze nanocząsteczki złota, tworząc ślady.Ostatnim krokiem jest monitorowanie i kwantyfikacja ruchliwości komórek przy użyciu mikroskopii w celu obrazowania śladów pozostawionych przez poruszające się komórki. Ostatecznie, za pomocą bezpłatnego oprogramowania, przeprowadza się pomiary powierzchni tych śladów. Jedną z głównych zalet tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak obrazowanie time-lapse, jest fakt, że badanie to wymaga jedynie stan

a-quantitative-evaluation-cell-migration-phagokinetic-track-motility

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Ocena ilościowa migracji komórek za pomocą testu ruchliwości śladów fagokinetycznych

Opisujemy protokół mikroskopii intravitalnej w świetle jasnym do pomiaru dynamicznych oddziaływań między neutrofilami a komórkami śródbłonka podczas rekrutacji neutrofili w odpowiedzi na źródło chemoatraktanta dla neutrofili in vivo. Pełzanie neutrofili wewnątrz naczyniowych, migracja transendotelialna oraz chemotaksja w tkance mięśnia kroczo ścięgnistego myszy są wizualizowane za pomocą fotografii wideo z odstępami czasu i śledzone przy użyciu programu ImageJ.

Śledzenie pełzania wewnątrznaczyniowego, migracji transendotelialnej i chemotaksji neutrofili w tkankach za pomocą intravitalnej wideomikroskopii

Ta metoda pozwala na monitorowanie komórek w czasie rzeczywistym oraz ilościowe pomiary różnych parametrów migracji komórkowej, takich jak prędkość, przemieszczenie i wektor prędkości. W przeciwieństwie do metod tradycyjnych, to podejście w czasie rzeczywistym nie opiera się na ilościowych pomiarach migracji w punkcie końcowym; zamiast tego umożliwia ciągłe monitorowanie i obliczanie różnych parametrów.

Ilościowa analiza przypadkowej migracji komórek z wykorzystaniem mikroskopii wideo time-lapse

Prezentujemy test migracji komórek ex vivo, który pozwala na precyzyjne określenie potencjału migracji komórek grzebienia nerwowego jelit w obecności różnych czynników wzrostu.

Ilościowy test migracji komórek dla mysich jelitowych progenitorów nerwowych

Opisano powszechnie stosowane, wysoce dostępne metody badania migracji komórek i inwazji in vitro. Pierwszą metodą jest test zamykania ran komórkowych, który mierzy ruchliwość komórek. Drugą metodą jest test migracji i inwazji transwell, który ocenia zdolność komórek do chemotakcji i inwazyjności.

Metody in vitro Testy migracji i inwazji komórek

Opisano ilościową metodę badania spontanicznej migracji komórek w jednowymiarowym, zamkniętym mikrośrodowisku. Metoda ta wykorzystuje mikrofabrykowane kanały i może być stosowana do badania migracji dużej liczby komórek w różnych warunkach w pojedynczych eksperymentach.

Badanie migracji komórek w kanałach mikroprefabrykowanych

Migracja komórek to zjawisko biologiczne, które bierze udział w wielu procesach fizjologicznych, takich jak gojenie się ran i reakcje immunologiczne oraz procesy patofizjologiczne, takie jak rak. Test migracji macierzy kolagenu 3D jest wszechstronnym narzędziem do analizy właściwości migracyjnych różnych typów komórek w środowisku fizjologicznym 3D.

Analiza migracji komórek w obrębie trójwymiarowej matrycy kolagenowej

Wiele genów o podwyższonej regulacji stymuluje migrację i inwazję komórek nowotworowych, co prowadzi do złych rokowań. Określenie, które geny regulują migrację i inwazję komórek nowotworowych, ma kluczowe znaczenie. Protokół ten przedstawia metodę badania wpływu zwiększonej ekspresji genu na migrację i inwazję komórek nowotworowych w czasie rzeczywistym.

Ilościowy pomiar migracji i inwazji komórek nowotworowych w czasie rzeczywistym po transfekcji syntetycznego mRNA

Ta procedura opisuje, jak wizualizować, śledzić i określać ilościowo Acanthamoeba spp. Ruchliwość.

Oznaczanie ilościowe Acanthamoeba spp. Ruchliwość

Ten protokół zapewnia metodę pierwotnej izolacji mysich limfocytów T i mikroskopii poklatkowej migracji limfocytów T w określonych warunkach środowiskowych z analizą ilościową.

Test migracji in vitro w czasie rzeczywistym dla pierwotnych mysich limfocytów T CD8 +

Ilościowe określanie stanu zapalnego komórek w uszkodzonym lub patologicznie zmienionym OUN za pomocą cytometrii przepływowej jest utrudnione przez obecność resztek lipidowych i mielinowych, które mogą mieć rozmiar i ziarnistość zbliżoną do komórek, co obniża czułość i dokładność pomiarów. Opracowaliśmy metodę przygotowania komórek w celu usunięcia resztek mieliny i poprawy detekcji komórek za pomocą cytometrii przepływowej w uszkodzonym rdzeniu kręgowym.

Ilościowa ocena komórek odpornościowych w uszkodzonej tkance rdzenia kręgowego z wykorzystaniem cytometrii przepływowej: nowe zastosowanie metody oczyszczania komórek

Poznaj ilościową ocenę motoryki komórek za pomocą testu fagokinetycznego z nanocząstkami złota. Ta metoda umożliwia wizualizację i pomiar ruchu komórkowego w czasie.

Ilościowa ocena migracji komórek z wykorzystaniem testu ruchliwości w śladach fagokinetycznych

Przeglądaj więcej filmów