Ilościowa ocena migracji komórek za pomocą testu fagokinetycznego ruchu torowego

Ogólnym celem tej procedury jest możliwość ilościowego pomiaru ruchliwości komórek w czasie za pomocą testu ruchliwości komórek opartego na nanocząstkach złota. Osiąga się to poprzez przygotowanie najpierw szklanych szkiełek nakrywkowych do pokrycia nanocząstkami złota. W szczególności szkiełka nakrywkowe wolne od endotoksyn są powlekane żelatyną, a następnie pieczone.

Drugim krokiem jest redukcja kwasu chloroorowego, który spowoduje powstanie nanocząsteczek złota i równomierne pokrycie żelatynowych szkiełek nakrywkowych roztworem. Następnie komórki umieszcza się na szkiełkach nakrywkowych pokrytych nanocząstkami złota na żądany przedział czasowy komórek eksperymentalnych. Idąc dalej, żelatyna wypiera nanocząstki złota, tworząc ścieżki.

Ostatnim krokiem jest monitorowanie i ilościowe określenie ruchliwości komórek za pomocą mikroskopii w celu zobrazowania ścieżek utworzonych przez poruszające się komórki. Docelowo pomiary powierzchni torów wykonywane są za pomocą ogólnodostępnego oprogramowania. Jedną z głównych zalet tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak obrazowanie poklatkowe, jest to, że test ten wymaga jedynie standardowego mikroskopu świetlnego, standardowej kamery i wykorzystuje swobodnie dostępne oprogramowanie do obrazowania.

Ponadto test umożliwia również łatwą analizę i porównanie wielu próbek przy użyciu metodysty zdolnego do badań przesiewowych o wysokiej przepustowości. Chociaż metoda ta może zapewnić wgląd w wpływ różnych czynników fizjologicznych i ruchu komórek, może być również stosowana do innych systemów, takich jak badania nad wpływem patogenów na ruchliwość zakażonych komórek. Ogólnie rzecz biorąc, osoby, które są nowe w tej metodzie, mogą mieć problemy, ponieważ metody wymagają ścisłego przestrzegania objętości i temperatur wskazanych w protokole.

W protokole tym położono nacisk na ocenę koloru końcowego roztworu wytrąconych nanocząstek złota, aby zapewnić sukces. Wizualna demonstracja tej metody ma kluczowe znaczenie. Ponieważ etapy testu ruchliwości toru kinetycznego FGO są trudne do nauczenia.

Zawierają one kilka procedur, które nie są powszechnie stosowane w laboratoriach biologii komórkowej i molekularnej. Aby przygotować szkiełka nakrywkowe pokryte żelatyną, najpierw Resus zawiesił żelatynę i wodę dejonizowaną, aby uzyskać roztwór o końcowym stężeniu 0,5 grama na 300 mililitrów, a następnie autoklawuj mieszaninę przez 15 do 30 minut. Ważne jest, aby zrobić to w ciągu dwóch godzin od dodania żelatyny do kaptura do hodowli tkankowej.

Przygotuj szkiełka nakrywkowe do powlekania, najpierw przenosząc od ośmiu do dziewięciu szkiełek nakrywkowych umytych kwasem do 100-milimetrowego plastikowego naczynia. Upewnij się, że szkiełka nakrywkowe nie stykają się ze sobą ani z bokami naczynia. Ostrożnie odpipetować dwie do trzech kropli żelatyny na każde szkiełko nakrywkowe, unikając wylania się na płytkę.

Następnie naczynie zawierające pokrytą żelatyną pokrywę wkładamy do piekarnika i pieczemy w temperaturze 90 stopni Celsjusza przez 10 minut. Po 10 minutach wyjmij naczynie z piekarnika i włóż je z powrotem do chusteczki. Kaptur kulturowy.

Delikatnie odpipetować nadmiar żelatyny. Włóż naczynie z powrotem do piekarnika i susz szkiełka nakrywkowe w temperaturze 70 stopni Celsjusza przez 45 minut. Gdy szkiełka nakrywkowe wyschną, wyjmij naczynie z piekarnika i włóż je z powrotem do okapu do hodowli tkankowych.

Za pomocą sterylnej igły delikatnie podnieść jedną stronę szkiełka nakrywkowego. Następnie za pomocą sterylnej pęsety usuń pokryte żelatyną szkiełka nakrywkowe z naczynia i umieść je w oddzielnych dołkach na płytce 24-dołkowej. Kolejnym krokiem jest przygotowanie szkiełek nakrywkowych pokrytych złotem koloidalnym.

Zacznij od przygotowania 10 mililitrów 0,5% roztworu cytrynianu sodu pracującego w kapturze do hodowli tkankowej połączonych z 1,5 mililitra 14,5 milimolowego roztworu kwasu chloro ORIC i 13,5 mililitra autoklawu dejonizowanej wody w sterylnej kolbie Erlenmeyera wolnej od endotoksyn Na każde osiem do dziewięciu szkiełek nakrywkowych wynik powinien dać słabo żółty roztwór. Kwas chloro ORIC jest toksyczny i należy obchodzić się z nim ostrożnie. Jest również wrażliwy na światło, więc etap gotowania powinien odbywać się przy słabym oświetleniu.

Gdy roztwór osiągnie temperaturę wrzenia, wyjąć kolbę z płyty grzejnej i przenieść ją na płytkę mieszającą. Aby utworzyć cząstki złota koloidalnego w roztworze, dodaj 0,7 mililitra 0,5% roztworu cytrynianu sodu na 15 mililitrów roztworu kwasu chloro ORIC podczas mieszania, kontynuuj mieszanie przez około dwie minuty. W tym czasie roztwór zmieni kolor z bladożółtego na przezroczysty, na szary, fioletowy i ciemnofioletowy.

Zanim w końcu osiągniesz czerwone wino lub najlepiej rdzawy kolor, narysuj koloidalny roztwór złota w 10-mililitrowej pipecie i pozwól roztworowi ostygnąć w pipecie przez jedną do dwóch minut, aż osiągnie temperaturę pokojową. Następnie dodać 0,5 do jednego mililitra na wierzch pokrytych żelatyną szkiełek nakrywkowych na płytce 24-dołkowej; Umieścić 24-dołkową płytkę zawierającą szkiełka nakrywkowe pokryte złotem koloidalnym w inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza i inkubować przez 30 minut. Po tym, jak cząstki zdążą osiąść na pokrytych żelatyną szkiełkach nakrywkowych, sprawdź ich gęstość pod mikroskopem świetlnym.

Odpowiednie rozmieszczenie nanocząsteczek złota pomaga w łatwy i skuteczny sposób rozróżnić krawędzie ciężarówek solarnych. Optymalna gęstość różni się w zależności od wielkości komórki. Zbyt wysokie stężenie cząsteczek złota utrudnia poruszanie się komórek, podczas gdy zbyt niskie stężenie cząsteczek złota, złota ogranicza zdolność do wyznaczenia dokładnej ścieżki ruchliwości.

Z tego powodu w indywidualnych doświadczeniach należy stosować razem tylko szkiełka nakrywkowe wykonane w tej samej partii lub takie, które mają taką samą gęstość. Jeśli stężenie cząstek złota jest niewystarczające, dodać dodatkowe 0,5 do jednego mililitra koloidalnego roztworu złota do szkiełek nakrywkowych pokrytych żelatyną. Jeśli jednak stężenie cząstek złota jest zbyt wysokie, tak jak w przypadku pokazanym tutaj, jedynym skutecznym wyborem jest przerobienie koloidalnego roztworu złota i pokrycie nowych szkiełek nakrywkowych.

Jeśli gęstość cząstek jest prawidłowa, włóż płytkę z powrotem do inkubatora w temperaturze 37 stopni Celsjusza i inkubuj przez godzinę, aby przez noc wypłukać niezwiązane cząstki złota, zanurzając trzykrotnie szkiełka pokrywowe w sterylnym roztworze soli fizjologicznej buforowanym fosforanami. Następnie przechowuj szkiełka nakrywkowe pokryte złotem koloidalnym w dołkach wypełnionych PBS na czystej 12-dołkowej płytce w temperaturze czterech stopni Celsjusza, aż będą gotowe do użycia. Szkiełka nakrywkowe nie powinny dopuszczać do wyschnięcia i powinny zostać zużyte w ciągu dwóch do trzech miesięcy od daty ich sporządzenia.

Kolejnym krokiem jest przygotowanie szkiełek nakrywkowych pokrytych złotem koloidalnym do hodowli komórkowej. Zacznij od umieszczenia ich w indywidualnych studzienkach 24-dołkowej płytki, do której dodano około 0,3 mililitra pożywki hodowlanej przed dodaniem szkiełek przykrywkowych. Liczba komórek będzie się różnić w zależności od typu komórki, ale gęstość komórek musi być wystarczająco niska, aby zapobiec nakładaniu się ścieżek komórek z wielu komórek w tym samym obszarze.

Przykryj płytkę i umieść ją w inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla na sześć do 24 godzin W oparciu o ruchliwość typu komórki, optymalne ramy czasowe należy eksperymentalnie określić dla każdego typu komórki po inkubacji, naprawić wszelkie szkiełka nakrywkowe, które nie zostaną natychmiast przeanalizowane, najpierw zanurzając je dwukrotnie w PBS, a następnie inkubując w 3% para formaldehydzie przez 15 minut w temperaturze pokojowej za pomocą Uchwyć światłem obrazy ścieżek utworzonych przez pojedynczą ruchomą komórkę na niezamocowanych lub stałych szkiełkach nakrywkowych. Powiększenie używane do robienia zdjęć ścieżek komórkowych różni się w zależności od typu komórki. Jednak w każdym badaniu należy użyć tego samego powiększenia, aby móc porównać wyniki.

W przypadku monocytów 40-krotne powiększenie działa dobrze przy użyciu ogólnodostępnego oprogramowania, takiego jak obraz, obraz JNIH lub narzędzie do obrazowania, określ średnią powierzchnię złota koloidalnego oczyszczonego przez 10 do 20 lub więcej komórek dla każdej próbki z przechwyconych obrazów pokazanych tutaj to oczyszczona ścieżka koloidalnych cząstek złota przez pojedynczy niestymulowany monocyt wykonany z obiektywem 40x. Nieruchome komórki tworzą wokół siebie charakterystyczne małe owalne lub okrągłe ścieżki, co wskazuje na niski poziom ruchu wasalskiego. Natomiast komórki o dużej ruchliwości charakteryzują się ruchem kierunkowym w postaci wydłużonych odcinków i większych obszarów ogólnych ze względu na ich nieregularne kształty.

Ścieżki komórek najlepiej analizować za pomocą narzędzia odręcznego w oprogramowaniu Image J, aby obrysować ich objętość. Ilościowe pomiary powierzchni można następnie wykonać za pomocą narzędzia pomiarowego w menu analizy obrazu J. Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać o ścisłym przestrzeganiu objętości i temperatur wskazanych w protokole, ponieważ odchylenia mogą mieć duży wpływ na końcowe wyniki. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak tworzyć szkiełka nakrywkowe pokryte żelatyną, jak przygotować nanocząstki złota i szkiełka nakrywkowe pokryte nanocząstkami złota oraz jak monitorować i ilościowo oceniać ruch komórek za pomocą mikroskopii świetlnej.

Nie zapominaj, że praca z wrzącymi roztworami na gorącej płycie, zwłaszcza opary z wrzącego roztworu fluoru, kwasu AIC i cytrynianu sodu, mogą być niebezpieczne środki ostrożności, takie jak praca w kapturze i zachowanie zdrowego rozsądku podczas wykonywania tej procedury.